ברצוננו להביע את תודתנו למשתמשים שלנו על שהפקידו בידינו את הדגימות היקרות שלהם לבדיקת קריסטלים, כמו גם על מתן משוב קריטי ובקשות שעזרו לנו לחדד ולפתח את המשאבים שלנו כדי לשרת טוב יותר את קהילת הביולוגיה המבנית. ברצוננו להודות גם לאיתן הולמן, ד"ר ליסה ג'יי קיף וד"ר אריקה דוגויד, שהניעו את הפיתוח של ממשק המשתמש הגרפי של מרקו פולו. ברצוננו להודות לעמיתי HWI על תמיכתם והצעותיהם, במיוחד לד"ר דיאנה CF מונטיירו. אנו מאשרים תמיכה במימון מהמכונים הלאומיים לבריאות, R24GM141256.

סינון בתפוקה גבוהה להתגבשות חלבונים

<ol>
	<li>PDB data distribution by experimental method and molecular type. RCSB Protein Data Bank Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/summary">https://www.rcsb.org/stats/summary</a> (2022)</li><li>Maveyraud, L., Mourey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+X-ray+crystallography+and+drug+discovery.">Protein X-ray crystallography and drug discovery.</a> Molecules. 25 (5), 1030 (2020).</li><li>Dupeux, F., R&#246;wer, M., Seroul, G., Blot, D., M&#225;rquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thermal+stability+assay+can+help+to+estimate+the+crystallization+likelihood+of+biological+samples.">A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).</li><li>Elbasir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeepCrystal:+A+deep+learning+framework+for+sequence-based+protein+crystallization+prediction.">DeepCrystal: A deep learning framework for sequence-based protein crystallization prediction.</a> Bioinformatics. 35 (13), 2216-2225 (2019).</li><li>Zucker, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+protein+crystallization+outcome+using+a+hybrid+method.">Prediction of protein crystallization outcome using a hybrid method.</a> Journal of Structural Biology. 171 (1), 64-73 (2010).</li><li>George, A., Wilson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+protein+crystallization+from+a+dilute+solution+property.">Predicting protein crystallization from a dilute solution property.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (4), 361-365 (1994).</li><li>Jia, Y., Liu, X. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+surface+self-assembly+to+crystallization:+prediction+of+protein+crystallization+conditions.">From surface self-assembly to crystallization: prediction of protein crystallization conditions.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6949-6955 (2006).</li><li>Slabinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XtalPred:+A+web+server+for+prediction+of+protein+crystallizability.">XtalPred: A web server for prediction of protein crystallizability.</a> Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).</li><li>Abrahams, G. J., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLASTing+away+preconceptions+in+crystallization+trials.">BLASTing away preconceptions in crystallization trials.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (3), 184-192 (2019).</li><li>Rosa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+ease+the+choice+and+design+of+protein+crystallisation+experiments.">Tools to ease the choice and design of protein crystallisation experiments.</a> Crystals. 10 (2), 95 (2020).</li><li>Newman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+need+for+an+international+effort+to+capture,+share+and+use+crystallization+screening+data.">On the need for an international effort to capture, share and use crystallization screening data.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (3), 253-258 (2012).</li><li>Lynch, M. L., Dudek, M. F., Bowman, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+searchable+database+of+crystallization+cocktails+in+the+PDB:+analyzing+the+chemical+condition+space.">A searchable database of crystallization cocktails in the PDB: analyzing the chemical condition space.</a> Patterns. 1 (4), 100024 (2020).</li><li>Jancarik, J., Kim, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+matrix+sampling:+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins.">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> Journal of Applied Crystallography. 24 (4), 409-411 (1991).</li><li>Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+factorial+designs+and+the+analysis+of+macromolecular+crystal+growth+conditions.">Efficient factorial designs and the analysis of macromolecular crystal growth conditions.</a> Methods. 1 (1), 12-24 (1990).</li><li>McPherson, A., Cudney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+silver+bullets:+An+alternative+strategy+for+crystallizing+macromolecules.">Searching for silver bullets: An alternative strategy for crystallizing macromolecules.</a> Journal of Structural Biology. 156 (3), 387-406 (2006).</li><li>McPherson, A., Nguyen, C., Cudney, R., Larson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+small+molecule+additives+and+chemical+modification+in+protein+crystallization.">The role of small molecule additives and chemical modification in protein crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (5), 1469-1474 (2011).</li><li>Luft, J. R., DeTitta, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+produce+microseed+stock+for+use+in+the+crystallization+of+biological+macromolecules.">A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).</li><li>Thakur, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+success+of+sparse+matrix+protein+crystallization+screening+with+heterogeneous+nucleating+agents.">Improved success of sparse matrix protein crystallization screening with heterogeneous nucleating agents.</a> PLoS One. 2 (10), 1091 (2007).</li><li>Chayen, N. E., Stewart, P. D. S., Blow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbatch+crystallization+under+oil-a+new+technique+allowing+many+small-volume+crystallization+trials.">Microbatch crystallization under oil-a new technique allowing many small-volume crystallization trials.</a> Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).</li><li>Luft, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deliberate+approach+to+screening+for+initial+crystallization+conditions+of+biological+macromolecules.">A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules.</a> Journal of Structural Biology. 142 (1), 170-179 (2003).</li><li>Luft, J. R., Snell, E. H., DeTitta, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+high-throughput+protein+crystallization+screening:+10+years+of+practical+experience.">Lessons from high-throughput protein crystallization screening: 10 years of practical experience.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 465-480 (2011).</li><li>Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=20+years+of+crystal+hits:+Progress+and+promise+in+ultrahigh-throughput+crystallization+screening.">20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. , (2023).</li><li>Segelke, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+analysis+of+sampling+protocols+used+in+protein+crystallization+screening.">Efficiency analysis of sampling protocols used in protein crystallization screening.</a> Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 553-562 (2001).</li><li>Luft, J. R., Newman, J., Snell, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+screening:+the+influence+of+history+on+current+practice.">Crystallization screening: the influence of history on current practice.</a> Acta Crystallographica Section F. 70 (7), 835-853 (2014).</li><li>Mlynek, G., Kostan, J., Leeb, S., Djinovic-Carugo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+suits+fit+better:+Customized+protein+crystallization+screens.">Tailored suits fit better: Customized protein crystallization screens.</a> Crystal Growth &amp; Design. 20 (2), 984-994 (2019).</li><li>Mueller-Dieckmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+open-access+high-throughput+crystallization+facility+at+EMBL+Hamburg.">The open-access high-throughput crystallization facility at EMBL Hamburg.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (12), 1446-1452 (2006).</li><li>Weber, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+crystallization+pipeline+at+the+crystallography+core+facility+of+the+Institut+Pasteur.">High-throughput crystallization pipeline at the crystallography core facility of the Institut Pasteur.</a> Molecules. 24 (24), 4451 (2019).</li><li>Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+happened+over+the+last+five+years+with+high-throughput+protein+crystallization+screening.">What's happened over the last five years with high-throughput protein crystallization screening.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (8), 691-695 (2018).</li><li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+(SONICC).">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55 (4), 379-386 (2011).</li><li>Madden, J. T., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excited+UV+fluorescence+for+protein+crystal+detection.">Two-photon excited UV fluorescence for protein crystal detection.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 839-846 (2011).</li><li>Fleming, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+harmonic+generation+interrogation+of+the+endonuclease+APE1+binding+interaction+with+G-quadruplex+DNA.">Second harmonic generation interrogation of the endonuclease APE1 binding interaction with G-quadruplex DNA.</a> Analytical Chemistry. 94 (43), 15027-15032 (2022).</li><li>Bruno, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+crystallization+outcomes+using+deep+convolutional+neural+networks.">Classification of crystallization outcomes using deep convolutional neural networks.</a> PLoS One. 13 (6), 0198883 (2018).</li><li>Holleman, E. T., Duguid, E., Keefe, L. J., Bowman, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo:+An+open-source+graphical+user+interface+for+crystallization+screening.">Polo: An open-source graphical user interface for crystallization screening.</a> Journal of Applied Crystallography. 54 (2), 673-679 (2021).</li><li>Niesen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+to+quality+management+in+structural+biology:+Biophysical+selection+of+proteins+for+successful+crystallization.">An approach to quality management in structural biology: Biophysical selection of proteins for successful crystallization.</a> Journal of Structural Biology. 162 (3), 451-459 (2008).</li><li>Padayatti, P., Palczewska, G., Sun, W., Palczewski, K., Salom, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+protein+crystals+with+two-photon+microscopy.">Imaging of protein crystals with two-photon microscopy.</a> Biochemistry. 51 (8), 1625-1637 (2012).</li><li>Haupert, L. M., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+SHG+activities+of+diverse+protein+crystals.">Modeling the SHG activities of diverse protein crystals.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (11), 1513-1521 (2012).</li><li>Luft, J. R., Grant, T. D., Wolfley, J. R., Snell, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+on+crystal+harvesting.">A new view on crystal harvesting.</a> Journal of Applied Crystallography. 47 (3), 1158-1161 (2014).</li><li>Bruno, A. E., Soares, A. S., Owen, R. L., Snell, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+haptic+interfaces+and+web+services+in+crystallography:+An+application+for+a+'screen+to+beam'+interface.">The use of haptic interfaces and web services in crystallography: An application for a 'screen to beam' interface.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (6), 2082-2090 (2016).</li><li>Baldock, P., Mills, V., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+microbatch+and+vapour+diffusion+for+initial+screening+of+crystallization+conditions.">A comparison of microbatch and vapour diffusion for initial screening of crystallization conditions.</a> Journal of Crystal Growth. 168 (1-4), 170-174 (1996).</li></ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

השיטה מתארת צינור בתפוקה גבוהה לבדיקת התגבשות חלבונים הדורש דגימה של 500 מיקרוליטר בלבד עבור 1,536 ניסויי התגבשות בודדים בפורמט מיקרו-אצווה מתחת לנפט. הצינור מסתמך על רובוטיקה לטיפול בנוזלים כדי לסייע במהירות ובשחזור למערך הניסוי, כמו גם על משאב ניתוח התמונה החישובי MARCO Polo, המותאם אישית לניתוח תמונות לוחות של 1,536 בארות באמצעות אלגוריתם MARCO כדי לזהות ולבודד פגיעות גבישיות.
הנפח הקטן של טיפות סינון בודדות (400 nL סה"כ עם יחס של 1:1 של דגימה:קוקטייל) פירושו שנפחי מדגם קטנים במיוחד נדרשים כדי לזהות תנאי התגבשות חיוביים. גודל טיפות קטנות אלה מייצר בהכרח גבישים קטנים שלא ניתן לדוג בלולאה מסורתית. פותחו שיטות לקציר מתוך 1,536 צלחות37; בנוסף, הלוחות עם הגבישים שימשו ישירות במקורות סינכרוטרון לאיסוף נתונים באתרם 38. אם תפותח שיטה חזקה לקצירת גבישים אלה, ההתקדמות בטכנולוגיית הסינכרוטרון והאלומות הממוקדות במיקרו יאפשרו עוד יותר להשיג מערכי נתונים שימושיים. בנוסף, הגבישים המתקבלים יכולים לשמש כזרעים למאמצי אופטימיזציה.
להדמיית SONICC יש יתרון ברור בזיהוי גבישי חלבון קטנים וגבישי חלבון החבויים מתחת לשקע. למרות יתרונות אלה, לא כל סוגי הדגימות מקובלים על הדמיה SHG ו- UV-TPEF. לדוגמה, חלבונים עם מעט או ללא שאריות טריפטופן ארומטיות יציגו אות UV-TPEF מעורפל. יתר על כן, גבישים בקבוצות מרחב ספציפיות, כולל קבוצות צנטרוסימטריות או קבוצת נקודה 432, לא יתגלו על ידי הדמיית SHG. דגימות עם פלואורופורים לפעמים מפריעות לאות SHG, וכתוצאה מכך ביטול האות או עוצמה מוגברת, כלומר פרשנות זהירה של אותות SHG נדרשת עבור חלבונים המכילים מתכת וחלבונים המכילים moieties פלואורסצנטי. עם זאת, במקרים רבים, ניתן לתרץ את היעדר אות SHG או UV-TPEF, והיעדר אותות אלה לא בהכרח צריך לשלול את נוכחותו של גביש חלבון.
פורמט מיקרו-אצווה מתחת לשמן מספק חלופה לשיטת פיזור האדים הנפוצה יותר המשמשת לקריסטלוגרפיה בתפוקה גבוהה. חשוב לציין כי פורמט ההתגבשות משפיע על זיהוי פגיעות39, המספק רציונל לשימוש בפורמטים שונים של התגבשות למאמצי סינון בעלי תפוקה גבוהה. הדמיה אוטומטית ושיטות התומכות ב-SONICC מסייעות בזיהוי מהיר של גבישי חלבונים במהלך קורס זמן ניסויי בן 6 שבועות. לבסוף, ממשק המשתמש הגרפי MARCO Polo מאפשר למשתמשים לנתח במהירות תמונות מ-1,536 תנאים כדי לזהות בארות פגיעה מבטיחות לצורך אופטימיזציה. היכולות במרכז HTX, כולל מערך ניסויי בתפוקה גבוהה התומך ברובוטיקה, יחד עם כלי הדימות והחישוב המתקדמים ביותר לניתוחים, מספקים תרומה משמעותית לקהילת הביולוגיה המבנית על ידי העצמת החוקרים לטפל ביעילות בצוואר בקבוק עיקרי בעבודה מבנית מבוססת גביש: מציאת תנאי התגבשות.

אפילו בעידן של התקדמות עצומה בשיטות ביולוגיה מבנית, קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ממשיכה להיות שיטה אמינה ופופולרית ליצירת מודלים מבניים באיכות גבוהה של מקרומולקולות. מעל 85% מכל המודלים המבניים התלת-ממדיים המופקדים בבנק נתוני החלבונים (PDB) הם משיטות מבניות מבוססות גבישים (נכון לינואר 2023). 1 יתר על כן, קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן נותרה הכרחית לפתרון מבנים של ליגנד חלבון, מרכיב חיוני בתהליך גילוי ופיתוח התרופות2. למרות שהתגבשות חלבונים נותרה טכניקת הביולוגיה המבנית הדומיננטית במשך יותר מחצי מאה, שיטות לחיזוי סבירות התגבשות בהתבסס על תכונות פיזיקליות3 או רצף 4,5 עדיין בחיתוליהן.
החיזוי של תנאי התגבשות מעורפל עוד יותר; התקדמות מוגבלת נעשתה כדי לחזות תנאי התגבשות סבירים אפילו עבור חלבוני מודל 6,7. מחקרים אחרים ניסו לזהות תנאי התגבשות בהתבסס על הומולוגיה של חלבונים ותנאים שנכרו מה-PDB 8,9,10. עם זאת, כוח הניבוי שניתן למצוא ב-PDB מוגבל, מכיוון שרק תנאי ההתגבשות הסופיים והמוצלחים מופקדים, מה שמחמיץ בהכרח את ניסויי האופטימיזציה הנרחבים לעתים קרובות הנדרשים לכוונון עדין של גדילת הגבישים. יתר על כן, ערכי PDB רבים חסרים מטא-נתונים המכילים פרטים אלה, כולל נוסחאות הקוקטייל, פורמט ההתגבשות, הטמפרטורה והזמן להתגבשות11,12. לכן, עבור חלבונים רבים בעלי עניין, הדרך הנגישה ביותר לקבוע את תנאי ההתגבשות היא באופן ניסיוני, תוך שימוש בתנאים רבים ככל האפשר במגוון רחב של אפשרויות כימיות.
מספר גישות להפוך את סינון ההתגבשות לפורה ויסודי ככל האפשר נחקרו במידה רבה, כולל מטריצות דלילות 13, סינון פקטוריאלי לא שלם 14, תוספים 15,16, זריעה 17, וחומרי גרעין 18. מרכז HTX הלאומי במכון המחקר הרפואי האופטמן-וודוורד (HWI) פיתח צינור יעיל לבדיקת התגבשות באמצעות גישת מיקרו-אצווה מתחת לנפט19, המשתמשת בשיטות אוטומטיות לטיפול בנוזלים והדמיה כדי לייעל את הזיהוי של תנאי התגבשות ראשוניים באמצעות דגימות ונפחי קוקטייל מינימליים יחסית (איור 1). הסט של 1,536 קוקטיילים ייחודיים מבוסס על תנאים שנקבעו בעבר כתורמים לצמיחת גבישי חלבונים ומתוכנן להיות מגוון מבחינה כימית על מנת לדגום מגוון רחב של תנאי התגבשות אפשריים20,21,22. הדגימה הרחבה של תנאי התגבשות מגדילה את הסיכוי לצפות במוליך התגבשות אחד או יותר.
מעט ניתוחים רשמיים של מספר התנאים הדרושים לסינון הופיעו בספרות. מחקר אחד התמקד בפריסת הדגימה של מסכים שונים ומצא כי הדגימה האקראית של רכיבים (בדומה לפקטוריאל חלקי) מייצגת את שיטת הדגימה היסודית והיעילה ביותר23. מחקר אחר של בדיקות סקר ציין כי היו מקרים רבים שבהם מסך 1,536 יסודי מאוד הניב רק גביש אחד פגע24, ומחקר עדכני מאוד הדגיש כי רוב המסכים המסחריים דוגמים בחסר את מרחב ההתגבשות הידוע כקשור ללהיטי הקרנה25. לא כל מוליכי ההתגבשות יניבו גביש באיכות עקיפה המתאים לאיסוף נתונים עקב אי סדר מובנה בתוך הגביש, מגבלות עקיפה או פגמים גבישיים; לכן, ליציקת רשת רחבה יותר לתנאים יש יתרון נוסף של מתן צורות גבישיות חלופיות לאופטימיזציה.
גם לפורמט של ניסויי התגבשות חלבונים יש השפעה על הצלחת המסך. פיזור אדים הוא ההגדרה הנפוצה ביותר עבור יישומי התגבשות בתפוקה גבוהה והוא משמש במרכזי התגבשות חדישים, כולל EMBL המבורג ומכון פסטר מרכזי הקרנה בתפוקה גבוהה26,27,28. מרכז HTX משתמש בשיטת מיקרו-אצווה מתחת לשמן; אמנם פחות נפוצה, אך זוהי שיטה חזקה הממזערת את צריכת בקבוקי הדגימה וההתגבשות20,21,22. אחד היתרונות של שיטת מיקרו-אצווה מתחת לשמן, במיוחד כאשר משתמשים בשמן פרפין בצמיגות גבוהה, הוא שרק אידוי קל מתרחש בתוך הטיפה במהלך הניסוי, כלומר ריכוז שיווי המשקל מושג בעת ערבוב טיפות. אם תוצאות התגבשות חיוביות נצפות בשיטת מיקרו-אצווה מתחת לנפט, הרבייה של תנאים אלה היא בדרך כלל פשוטה יותר מאשר במערכי דיפוזיה של אדים, שבהם ההתגבשות מתרחשת בנקודה לא מוגדרת כלשהי במהלך שיווי המשקל בין טיפת ההתגבשות לבין המאגר. יכולת השחזור של פגיעות רצויה עבור גישות התגבשות בעלות תפוקה גבוהה, המייצרות גבישי חלבון זעירים להחריד שבדרך כלל צריכים להיות מותאמים לניסויי רנטגן חד-גבישיים.
מסך ההתגבשות בתפוקה גבוהה עבור חלבונים מסיסים מורכב מקוקטיילים המוכנים בתוך הבית, מסכים מסחריים מוכנים, ומסכים מסחריים מותאמים בבית22. הקוקטיילים פותחו בתחילה תוך שימוש באסטרטגיה פקטוריאלית חלקית תוך שימוש בקוקטיילים של התגבשות מוצלחת בעבר20. הריאגנטים במסך הזמינים מסחרית כוללים מערכים של פולימרים, מלחי התגבשות, PEG ושילובי יונים ומסכים המשתמשים במטריצה דלילה ובגישות פקטוריאליות חלקיות. ישנם גם ריאגנטים המשתנים לפני הכללתם במסך: מסך תוספת, מסך pH וחיץ, מסך תוסף נוזלי יוני ומסך פולימר.
כוחם של תנאי ואסטרטגיות התגבשות ידועים מונף ב-1,536 קוקטיילים של התגבשות, יחד עם היתרונות של מערכת מיקרו-אצווה מתחת לנפט כדי ליצור צינור המשתמש בטיפול אוטומטי בנוזלים, הדמיה אוטומטית של שדה בהיר והדמיה לא ליניארית מסדר שני של גבישים כיראליים (SONICC). האוטומציה של הטיפול בנוזלים וההדמיה מספקת את היתרונות של פחות שעות מעבדה רטובות ויכולת שחזור גבוהה יותר. אופי התפוקה הגבוהה של סינון התגבשות אוטומטי מחייב אוטומציה של תהליך הניטור לגדילת גבישים. התקדמות זו מושגת באמצעות טכנולוגיות הדמיה חדישות המסייעות בזיהוי פגיעות גבישים חיוביות. גם דימות סטנדרטי של לוחות בשדה בהיר, וגם שיטות מרובות פוטונים לגילוי משופר, משמשות באמצעות מערכת דימות גבישי עם SONICC (איור 2). SONICC משלבת מיקרוסקופ דור הרמוני שני (SHG)29 ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מעורר אולטרה סגול של שני פוטונים (UV-TPEF)30 כדי לזהות גבישים קטנים מאוד, כמו גם כאלה המוסתרים על ידי משקע. ההדמיה של SONICC מודיעה אם הבארות מכילות חלבון (באמצעות UV-TPEF) וגבישים (באמצעות SHG). מעבר לזיהוי חיובי של גבישי חלבון, ניתן לקבל מידע נוסף גם בשיטות הדמיה מתקדמות. הדמיה של קוקטייל בלבד לפני הוספת הדגימה משמשת כבקרה שלילית; תמונות אלה יכולות לזהות את מראה הבאר לפני הוספת הדגימה, כולל במונחים של גבישי מלח ופסולת. בנוסף, הדמיית SHG ו- UV-TPEF מסייעת להבדיל גבישי חלבון מגבישי מלח וניתן להשתמש בה להדמיית חומר מורכב של חומצות גרעיןחלבוניות 31.
ניסויי התגבשות בתפוקה גבוהה העוברים ניטור חוזר ונשנה באמצעות הדמיה גורמים לכמות גדולה מאוד של תמונות הדורשות בדיקה. שיטות אוטומטיות לניקוד גבישים פותחו כדי להפחית את העומס על המשתמש ולהגדיל את ההסתברות לזהות פגיעות קריסטל חיוביות. מרכז HTX השתתף בפיתוח אלגוריתם הניקוד MAchine Recognition of Crystallization Outcomes (MARCO), ארכיטקטורת רשת עצבית קונבולוציונית עמוקה מאומנת שפותחה על ידי קונסורציום של שותפים אקדמיים, ללא כוונת רווח, ממשלתיים ותעשייתיים כדי לסווג תמונות באר ברייטפילד32. האלגוריתם אומן על כמעט חצי מיליון תמונות שדה בהיר מניסויי התגבשות ממוסדות מרובים תוך שימוש בשיטות התגבשות שונות ובתמונות שונות. האלגוריתם מפיק ציון הסתברותי המציין אם תמונה נתונה נופלת לארבע מחלקות תמונה אפשריות: "קריסטל", "ברור", "משקע" ו"אחר". ל-MARCO יש דיוק סיווג מדווח של 94.5%. זיהוי קריסטלים משופר עוד יותר באמצעות תוכנה המיישמת את האלגוריתם ומספקת ממשק משתמש גרפי (GUI) לצפייה נגישה ופשוטה בתמונות, המתאפשרת עם יכולות ניקוד32,33 המבוססות על בינה מלאכותית. ממשק המשתמש הגרפי MARCO Polo מתוכנן לעבוד בצורה חלקה עם התקנת מערכת ההדמיה וניהול הנתונים במרכז HTX כדי לזהות פגיעות במסך של 1,536 בארות, עם מעורבות אנושית לבחינת הפלט של רשימות ממוינות. בנוסף, כתוכנת קוד פתוח הזמינה ב- GitHub, ממשק המשתמש הגרפי זמין לשינוי כדי לשקף את הצרכים הספציפיים של קבוצות מעבדה אחרות.
כאן, מתואר התהליך של הקמת ניסוי מיקרו-אצווה תחת שמן בתפוקה גבוהה באמצעות טיפול רובוטי בנוזלים כדי לספק הן את הקוקטייל והן את החלבון. במרכז HTX מערך ייחודי של מכשור ומשאבים שאינם נמצאים במוסדות אחרים, במטרה לספק שירותי מיון ומשאבים חינוכיים למשתמשים המעוניינים. הדגמת השיטות והיכולות של טכניקות רובוטיקה בעלות תפוקה גבוהה תאפשר לקהילה לקבל ידע בטכנולוגיות זמינות ולקבל החלטות עבור מאמצי קביעת המבנה שלהם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1536 Well Imp@ct LBR LoBase</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>790 801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlumaSeal II Sealing Film</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bromide</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium nitrate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate monobasic</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium thiocyanate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine pH 9.0</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-tris propane pH 7.0</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-993-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPS pH 10.0</td>
			<td>Rigaku Reagents</td>
			<td>none given</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearSeal Film</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt sulfate heptahydrate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulator</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gryphon liquid handling robot</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES pH 7.0</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-902-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES pH 7.5</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-902-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HWI HTX Center sample submission form</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionic Liquid screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium bromide</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium sulfate monohydrate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium nitrate hexahydrate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride tetrahydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>63535-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MARCO Polo GUI download</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2 x 3 liquid handling robot</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES pH 6.0</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-943-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito liquid handling robot</td>
			<td>SPTLabtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Oil/White Mineral Oil Saybolt Viscosity 340-365 at 100 &#176;F&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PX0045-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 1000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 2000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 20000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 3350</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 4000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 6000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEGRx HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reservations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>htslab@hwi.buffalo.edu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bromide</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate-monobasic</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate-tribasic</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium thiocyanate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager 1000 with SONICC</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager 54</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubidium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R2252-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SaltRx HT screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Bullets screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice pH screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH 5.0</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-933-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bromide</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate pH 4.2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-935-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate pH 5.6</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD-100-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StockOptions Polymer screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacsimate pH 7</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS pH 9.0</td>
			<td>bioWORLD</td>
			<td>40121071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris pH 8</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-900-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris pH 8.5</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViaFLO 384</td>
			<td>Integra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViaFLO 384 384 channel pipettor head (0.5-12.5&#181;L)</td>
			<td>Integra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViaFLO 384 96 channel pipettor head (300&#181;L)</td>
			<td>Integra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc acetate dihydrate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-563</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening to obtain crystal hits for protein crystallography

קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן היא הטכניקה הנפוצה ביותר להבחנה במבנים מקרומולקולריים, אך השלב המכריע של גיבוש חלבון לסריג מסודר הניתן לעקיפה נותר מאתגר. התגבשות של ביומולקולות מוגדרת במידה רבה באופן ניסיוני, ותהליך זה יכול להיות עתיר עבודה ואוסר על חוקרים במוסדות מוגבלים במשאבים. במרכז הלאומי להתגבשות בתפוקה גבוהה (HTX), יושמו שיטות הניתנות לשחזור גבוה כדי להקל על צמיחת גבישים, כולל התקנה אוטומטית של לוחות מיקרו-אצווה מתחת לשמן בתפוקה גבוהה של 1,536 בארות שנועדה לדגום מגוון רחב של פרמטרים של התגבשות. לוחות מנוטרים באמצעות שיטות הדמיה חדישות במשך 6 שבועות כדי לספק תובנה לגבי צמיחת גבישים, כמו גם להבחין במדויק בין פגיעות קריסטל יקרות ערך. יתר על כן, יישום אלגוריתם ניקוד בינה מלאכותית מאומן לזיהוי פגיעות גבישיות, יחד עם ממשק קוד פתוח וידידותי למשתמש לצפייה בתמונות ניסיוניות, מייעל את תהליך ניתוח תמונות גידול הגבישים. כאן מתוארים נהלי המפתח והמכשור להכנת הקוקטיילים ולוחות ההתגבשות, הדמיה של הצלחות וזיהוי פגיעות באופן המבטיח יכולת שחזור ומגדיל את הסיכוי להתגבשות מוצלחת.

Even in an age of tremendous progress in structural biology methods, X-ray crystallography continues to be a dependable and popular method for generating high-quality structural models of macromolecules. Over 85% of all three-dimensional structural models deposited to the Protein Data Bank (PDB) are from crystal-based structural methods (as of January, 2023).1 Furthermore, X-ray crystallography remains indispensable for solving protein-ligand structures, a crucial component of the drug discovery and development process2. Despite protein crystallization having remained the dominant structural biology technique for over half a century, methods to predict crystallization likelihood based on physical properties3 or sequence4,5 are still in their infancy.
The prediction of crystallization conditions is even more obscure; limited progress has been made to predict likely crystallization conditions even for model proteins6,7. Other studies have attempted to identify crystallization conditions based on protein homology and conditions mined from the PDB8,9,10. The predictive power to be found in the PDB is limited, however, as only the final, successful crystallization conditions are deposited, which, by necessity, misses the often extensive optimization experiments required to fine-tune crystal growth. Further, many PDB entries lack metadata containing these details, including the cocktail formulas, crystallization format, temperature, and time to crystallize11,12. Therefore, for many proteins of interest, the most accessible way to determine the crystallization conditions is experimentally, using as many conditions as possible across a wide range of chemical possibilities.
Several approaches to make crystallization screening as fruitful and thorough as possible have been explored to great effect, including sparse matrices13, incomplete factorial screening14, additives15,16, seeding17, and nucleating agents18. The National HTX Center at Hauptman-Woodward Medical Research Institute (HWI) has developed an efficient pipeline for crystallization screening using the microbatch-under-oil approach19, which utilizes automated liquid handling and imaging modalities to streamline the identification of initial crystallization conditions using comparatively minimal sample and cocktail volumes (Figure 1). The set of 1,536 unique cocktails are based on conditions previously determined to be conducive to protein crystal growth and are designed to be chemically diverse in order to sample a large range of possible crystallization conditions20,21,22. The broad sampling of crystallization conditions increases the likelihood of observing one or more crystallization leads.
Few formal analyses of how many conditions are needed for screening have appeared in the literature. One study focused on the sampling layout of different screens and found that the random sampling of components (similar to an incomplete factorial) represented the most thorough and efficient sampling method23. Another study of screening noted that there have been numerous instances when the very thorough 1,536 screen has yielded only a single crystal hit24, and a very recent study highlighted that most commercial screens undersample the crystallization space known to be associated with screening hits25. Not all crystallization leads will yield a diffraction quality crystal suitable for data collection due to inherent disorder within the crystal, diffraction limitations, or crystal flaws; therefore, casting a wider net for conditions has the additional benefit of providing alternative crystal forms for optimization.
The format of protein crystallization experiments also has an impact on the success of the screen. Vapor diffusion is the most commonly used setup for high-throughput crystallization applications and is utilized at state-of-the art crystallization centers, including the EMBL Hamburg and Institut Pasteur high-throughput screening centers26,27,28. The HTX Center uses the microbatch-under-oil method; while less commonly used, it is a robust method that minimizes the consumption of sample and crystallization cocktails20,21,22. One advantage of the microbatch-under-oil method, particularly when using a high-viscosity paraffin oil, is that only slight evaporation occurs within the drop during the experiment, meaning that the equilibrium concentration is achieved upon drop mixing. If positive crystallization results are observed in the microbatch-under-oil method, the reproduction of these conditions is typically more straightforward than in vapor diffusion setups, in which crystallization occurs at some undefined point during the equilibration between the crystallization drop and the reservoir. The reproducibility of hits is desirable for high-throughput crystallization approaches, which produce prohibitively tiny protein crystals that typically need to be optimized for single-crystal X-ray experiments.
The high-throughput crystallization screen for soluble proteins is made up of cocktails that are prepared in-house, ready-made commercial screens, and in-house-modified commercial screens22. The cocktails were initially developed using the incomplete factorial strategy using previously successful crystallization cocktails20. The reagents in the screen that are commercially available include arrays of polymers, crystallization salts, PEG, and ion combinations and screens that utilize sparse matrix and incomplete factorial approaches. There are also reagents that are modified before inclusion in the screen: an additive screen, a pH and buffer screen, an ionic liquid additive screen, and a polymer screen.
The power of known crystallization conditions and strategies has been leveraged in the 1,536 crystallization cocktails, along with the benefits of the microbatch-under-oil system to generate a pipeline that employs automated liquid handling, automated brightfield imaging, and second order nonlinear imaging of chiral crystals (SONICC). The automation of both the liquid handling and imaging provides the benefits of fewer wet lab hours and higher reproducibility. The high-throughput nature of automated crystallization screening necessitates the automation of the process of monitoring for crystal growth. These advances are achieved with state-of-the-art imaging technologies to assist in the identification of positive crystal hits. Both standard brightfield imaging of plates, as well as multi-photon methods for enhanced detection, are used via a crystal imaging system with SONICC (Figure 2). SONICC combines second harmonic generation (SHG)29 microscopy and ultraviolet two-photon excited fluorescence (UV-TPEF)30 microscopy to detect very small crystals, as well as those obscured by precipitate. The SONICC imaging informs on whether the wells contain protein (via UV-TPEF) and crystals (via SHG). Beyond the positive identification of protein crystals, additional information can also be obtained using state-of-the-art imaging methods. Cocktail-only imaging prior to sample addition serves as a negative control; these images can identify the well appearance prior to sample addition, including in terms of salt crystals and debris. Additionally, SHG and UV-TPEF imaging help differentiate protein crystals from salt crystals and can be used for visualizing protein-nucleic acid complexed material31.
High-throughput crystallization experiments undergoing repeated monitoring via imaging result in a very large volume of images needing examination. Automated crystal scoring methods have been developed to reduce the burden on the user and increase the probability of identifying positive crystal hits. The HTX Center partcipated in the development of the MAchine Recognition of Crystallization Outcomes (MARCO) scoring algorithm, a trained deep convolutional neural network architecture developed by a consortium of academic, non-profit, government, and industry partners to classify brightfield well images32. The algorithm was trained on nearly half a million brightfield images from crystallization experiments from multiple institutions using different crystallization methods and different imagers. The algorithm outputs a probabilistic score indicating whether a given image falls into four possible image classes: &#34;crystal&#34;, &#34;clear&#34;, &#34;precipitate&#34;, and &#34;other&#34;. MARCO has a reported classification accuracy of 94.5%. Crystal detection is further enhanced with software that implements the algorithm and provides a graphical user interface (GUI) for accessible and simple image viewing, enabled with the AI-enabled scoring capabilities32,33. The MARCO Polo GUI is designed to work seamlessly with the setup of the imaging and data management system in the HTX Center to identify hits in the 1,536-well screen, with human engagement to examine the output of sorted lists. Additionally, as open-source software available on GitHub, the GUI is readily available for modification to reflect the specific needs of other laboratory groups.
Here, the process of setting up a high-throughput microbatch-under-oil experiment using robotic liquid handling to deliver both the cocktail and protein is described. The HTX Center has a unique array of instrumentation and resources that are not found at other institutions, with the goal of providing screening services and educational resources to interested users. Demonstrating the methods and capabilities of robotics-enabled high-throughput techniques will enable the community to have knowledge of available technologies and make decisions for their own structure determination efforts.

מחבר זרקור: סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות גבישים לקריסטלוגרפיה של חלבונים  

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים

Getting a crystal to perform diffraction experiments remains a challenge because it's difficult to predict what parameters will influence crystallization. We favor the experimenter by screening 1536 crystallization conditions in a single plate and use advanced imaging technologies to identify even the smallest crystal hits. Structural biology techniques are developing rapidly and the field has been revolutionized by computational structure prediction.This has caused the field to become more integrative with several experimental or computational approaches more commonly being combined to generate a more detailed and accurate representation of biological mechanisms. Generating crystal hits is a key step to performing single crystal x-ray diffraction experiments and to developing techniques like micro ED and serial crystallography. Using advanced imaging methods, UVTBF and SHG along with the power of the Marco algorithm helps us identify useful crystals at all size scales.Our high throughput crystallization methods have generated a large amount of data for probing questions regarding efficiency of crystallization cocktail components. The specialized imaging we do reveal how non-linear optical methods can be used to detect vanishingly small crystals. Finding crystallization conditions is critical for crystal based structural methods, which account for 90%of all structural models in the protein data bank.In 2021, close to 2 million files were downloaded per day from the PDB emphasizing the impact structures have in paving the way for further scientific investigations.

התוצאות של ניסוי סינון גבישי בן 1,536 בארות מורכבות משבע מערכות שלמות של תמונות שדה בהיר שנאספו ביום 0 (בקרה שלילית), יום 1, שבוע 1, שבוע 2, שבוע 3, שבוע 4 ושבוע 6 (איור 4). תמונות SONICC נאספות בנקודת הזמן של 4 שבועות עבור צלחות מודגרות ב -23 ° C ובנקודת הזמן של 6 שבועות עבור צלחות מודגרות ב -4 ° C או 14 ° C. בסך הכל, לאחר שדגימה נשלחה, משתמשים יכולים לצפות להגדרת הצלחות שלהם תוך יום אחד מההגעה. התמונות יועלו תוך כדי איסוף. ניסוי סינון ההתגבשות מסתיים לאחר 6 שבועות.
מערך הלוחות בן 1,536 הקידוחים מאפשר לבצע את כל ניסויי הסינון בתוך אותה לוחית, ובכך להגביל את צריכת הדגימה ולהקל על הדמיה והשוואה ישירה בין שיטות ההדמיה. תוצאות מייצגות עבור מהלך הזמן של גדילת גבישים עבור קוקטייל יחיד מוצגות באיור 4. הדמיית לוחות אוטומטית במהלך הניסוי מאפשרת זיהוי של גבישים הגדלים במהירות ובאיטיות על ידי הדמיה של שדה בהיר. הדמיית UV-TPEF ו-SHG מאפשרת אימות צולב של הפגיעות שנצפו על-ידי הדמיה של שדה בהיר ומצביעות על כך שהגבישים שנצפו הם חלבוניים וגבישיים, בהתאמה (איור 5A,B). יתר על כן, הדמיה של SONICC מאפשרת זיהוי של גבישים שמוסתרים חזותית על-ידי משקעים או יריעות (איור 5C) או מיקרו-גבישים שאחרת עלולים להיחשב בטעות כמשקעים (איור 5D). עבור גבישים מסוימים, היעדר אות SHG אינו פוסל, מאחר שקבוצות נקודתיות מסוימות אינן מייצרות אות SHG35,36, כפי שמדגים גביש התאומטין הטטרגונלי באיור 5C. לעומת זאת, יש לצפות לחוסר אות UV-TPEF עבור חלבונים חסרי שאריות טריפטופן. התצפית של אותות UV-TPEF ו-SHG גם מאפשרת זיהוי של גבישי מלח שאינם חלבונים, אשר יופיעו בשדה בהיר ויציגו אות SHG חיובי חזק, אך יחסרו אות UV-TPEF (איור 5E).
ניתוח תמונה עבור הגדרת הצלחת הוא יעיל עם MARCO פולו GUI, אשר גם מאגד את העברת הנתונים ftp משרתי HWI (כחלופה להעברת קבצים עם FileZilla). ממשק המשתמש הגרפי MARCO Polo מאפשר צפייה קלה בלוחות ובתמונות ומבצע ניקוד תמונה חישובי באמצעות אלגוריתם MARCO, כך שניתן להוריד, להציג ולנתח במהירות את תוצאות התמונה ממרכז HTX. אלגוריתם הניקוד של MARCO, כפי שהוא מיושם בממשק המשתמש הגרפי של MARCO Polo, מסוגל להבקיע תמונות מכל הלוח בן 1,536 הבארות בפחות מ-5 דקות. תמונות המסומנות כגבישיות על-ידי אלגוריתם MARCO ניתנות למיון לאחר מכן על-ידי ממשק המשתמש הגרפי של Polo לתצוגה. מכיוון שאלגוריתם MARCO הותאם לזיהוי גבישים ולמזעור שליליים כוזבים כדי לא לפספס פגיעות חיוביות, הניקוד יכול לגרום לדגלים חיוביים כוזבים. עם זאת, היכולת של MARCO להגביל את קבוצת התמונות שיש לבחון על ידי מיקוד תשומת הלב בבארות עם סבירות גבוהה להכיל גבישים מביאה להפחתה משמעותית בנטל עיבוד הנתונים עבור המשתמשים. היישום הנוח של האלגוריתם בפלטפורמת הצפייה הידידותית למשתמש MARCO Polo, עם היכולת למיין תמונות על בסיס ציוני MARCO, משפר מאוד את יכולת המשתמש לנתח את מערך הנתונים במהירות ולקבוע במדויק פגיעות קריסטל.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65211/65211fig01.jpg"> איור 1: סכמטי של ניסוי סינון התגבשות של 1,536 בארות בתפוקה גבוהה שבוצע במרכז HTX. (1) בשלב זה מוסיפים לכל באר 5 מיקרוליטר שמן פרפין ו-200 ליטר קוקטייל (שלב פרוטוקול 3.1 ושלב 3.5). איור מצויר של באר אחת המכילה רק שמן וקוקטייל ותמונה מייצגת מוצגים מימין. (2) הדגימות מגיעות למרכז HTX (שלב פרוטוקול 5.1). 3) בשלב זה, 200 nL של מדגם מתווסף לכל באר (פרוטוקול שלב 5.4). (4) כל 1,536 הבארות מנוטרות לאורך זמן באמצעות הדמיית שדה בהיר, 5) וכן שיטות UV-TPEF ו-SHG (שלב פרוטוקול 6). 6) ממשק המשתמש הגרפי בקוד פתוח התומך בבינה מלאכותית משמש לצפייה, ניקוד וניתוח של תמונות ההתגבשות (שלב פרוטוקול 7). קיצורים: HTX = התגבשות בתפוקה גבוהה; UV-TPEF = UV-שני פוטון פלואורסצנטי מעורר; SHG = דור הרמוני שני; AI = בינה מלאכותית; GUI = ממשק משתמש גרפי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65211/65211fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65211/65211fig02.jpg"> איור 2: לוחות בודדים של 1,536 בארות המכילים ניסויי הקרנה, שצולמו באמצעות הדמיה של שדה בהיר, UV-TPEF ו-SHG. הצלחות בנות 1,536 הבארות מוצגות עם פרוטה אמריקאית לקנה מידה (למעלה). כל ניסוי סינון מצולם פעם אחת לפני ההתקנה ושש פעמים לאחר הוספת הדגימה עם הדמיית שדה בהיר (שבע ערכות תמונה כוללות של שדה בהיר, משמאל). הלוחות עוברים הדמיה UV-TPEF (במרכז) ו-SHG (מימין) לאחר 4 שבועות או 6 שבועות. קיצורים: UV-TPEF = UV-two-photon excited fluorescence; SHG = דור הרמוני שני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65211/65211fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65211/65211fig03.jpg"> איור 3: סכמטי המראה כיצד נוצרים לוחות של 1,536 בארות. שישה עשר בלוקים של 96 בארות DW משמשים להחתמת ארבע צלחות של 384 בארות, כאשר כל רביע מכל צלחת של 384 בארות ממולא על ידי חלוקת קוקטיילים של התגבשות. ארבעה בלוקים DW של 96 בארות ממלאים צלחת אחת של 384 בארות (באמצע). ארבע צלחות בנות 384 בארות משמשות להטבעה של צלחת בודדת בת 1,536 בארות (מימין). קיצור: DW = באר עמוקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65211/65211fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65211/65211fig04.jpg"> איור 4: מהלך זמן מייצג של באר בודדת בניסוי סינון של 1,536 בארות. הלוחות מצולמים לפני הגדרת הדגימה (יום 0), כמו גם עם הדמיה של שדה בהיר ביום 1, שבוע 1, שבוע 2, שבוע 3, שבוע 4 ושבוע 6. הלוחות המודגרים בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס מצולמים עם SONICC בשבוע 4. פסי קנה מידה = 80 מיקרומטר (שדה בהיר), 200 מיקרומטר (SHG, UV-TPEF). קיצורים: SONICC = הדמיה לא ליניארית מסדר שני של גבישים כיראליים; UV-TPEF = UV-שני פוטון פלואורסצנטי מעורר; SHG = דור הרמוני שני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65211/65211fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65211/65211fig05.jpg"> איור 5: תוצאות הדמיה מייצגות עבור ניסויי הקרנת גבישים HT 1,536. תוצאות הדמיה של Brightfield, UV-TPEF ו- SHG מוצגות עבור חמש בארות לדוגמה. (א,ב) גבישי חלבון שנצפו על ידי הדמיה של brightfield, UV-TPEF ו- SHG נראים בבירור בכל שלושת אופני ההדמיה. (C) גביש חלבון המוסתר על ידי סרט צילום בדימות שדה בהיר נראה על ידי הדמיית UV-TPEF; הגביש אינו נצפה על ידי הדמיית SHG עקב חוסר תאימות של קבוצת נקודות. (D) דוגמה למיקרו-גבישים שאומתו על ידי הדמיית UV-TPEF ו-SHG שאחרת עשויים להיחשב כמזרזים. (E) דוגמה לגבישי מלח שנראים גבישיים על ידי הדמיית שדה בהיר ו-SHG אך אינם מציגים אות UV-TPEF. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קוטר באר = 0.9 מ"מ. קיצורים: UV-TPEF = UV-two-photon excited fluorescence; SHG = דור הרמוני שני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65211/65211fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים S1: פתיחת קובצי תמונה ב-MARCO Polo. ניתן לפתוח קובצי תמונה בתוך ממשק המשתמש הגרפי MARCO Polo על-ידי ניווט אל ייבוא |הכרטיסיה 'תמונות' בחלק העליון (א). שים לב שניתן להעביר קבצים גם באמצעות הכלי From FTP ישירות ב- MARCO Polo (a) או שניתן להעביר אותם באמצעות FileZilla כמתואר בפרוטוקול שלב 7.2. כדי לייבא קבצים שכבר הורדו, בחר תמונות | מתוך ארכיון Rar / ספרייה. בחלון המוקפץ שמופיע, בחר אתר תיקייה (b) ונווט אל ספריית הקבצים שבה נשמרים קובצי תמונת הלוחות. לאחר שהקבצים נמצאים בחלון נתיבים נבחרים (c), סמן קובץ ולחץ על Import Runs (d). ממשק המשתמש הגרפי של MARCO Polo יזהה את המטא-נתונים הנכונים של קובץ קוקטייל לייבוא עם התמונות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65211/SuppFig1.png" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography at JoVE.com

פרוטוקול זה מפרט סינון התגבשות בתפוקה גבוהה, החל מהכנת 1,536 לוחות מיקרו-אסאי ועד לסוף חלון זמן ניסיוני של 6 שבועות. פרטים כלולים על הגדרת הדגימה, ההדמיה המתקבלת וכיצד משתמשים יכולים לבצע ניתוחים באמצעות ממשק משתמש גרפי התומך בבינה מלאכותית כדי לזהות במהירות וביעילות תנאי התגבשות מקרומולקולרית.

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

השגת גביש לביצוע ניסויי עקיפה נותרה אתגר מכיוון שקשה לחזות אילו פרמטרים ישפיעו על ההתגבשות. אנו מעדיפים את הנסיין על ידי סינון 1536 תנאי התגבשות בצלחת אחת ומשתמשים בטכנולוגיות הדמיה מתקדמות כדי לזהות אפילו את פגיעות הגביש הקטנות ביותר. טכניקות ביולוגיה מבנית מתפתחות במהירות והתחום עבר מהפכה על ידי חיזוי מבנה חישובי.זה גרם לתחום להיות אינטגרטיבי יותר עם מספר גישות ניסיוניות או חישוביות בדרך כלל משולבות כדי ליצור ייצוג מפורט ומדויק יותר של מנגנונים ביולוגיים. יצירת פגיעות גבישיות היא צעד מפתח לביצוע ניסויי עקיפה של קרני רנטגן של גביש יחיד ולפיתוח טכניקות כמו מיקרו ED וקריסטלוגרפיה טורית. באמצעות שיטות הדמיה מתקדמות, UVTBF ו-SHG יחד עם כוחו של אלגוריתם מרקו מסייעים לנו לזהות גבישים שימושיים בכל סקאלות הגודל.שיטות ההתגבשות בתפוקה גבוהה שלנו הניבו כמות גדולה של נתונים לבדיקת שאלות לגבי יעילות רכיבי קוקטייל ההתגבשות. ההדמיה המיוחדת שאנו עושים חושפת כיצד ניתן להשתמש בשיטות אופטיות לא ליניאריות כדי לזהות גבישים קטנים שנעלמים. מציאת תנאי התגבשות היא קריטית לשיטות מבניות מבוססות גביש, המהוות 90% מכל המודלים המבניים בבנק נתוני החלבונים.בשנת 2021 הורדו קרוב ל-2 מיליון קבצים ביום מה-PDB, תוך הדגשת ההשפעה שיש למבנים בסלילת הדרך למחקרים מדעיים נוספים.

high-throughput-screening-to-obtain-crystal-hits-for-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

2.3K Views.  Hauptman-Woodward Medical Research Institute. השגת גביש לביצוע ניסויי עקיפה נותרה אתגר מכיוון שקשה לחזות אילו פרמטרים ישפיעו על ההתגבשות. אנו מעדיפים את הנסיין על ידי סינון 1536 תנאי התגבשות בצלחת אחת ומשתמשים בטכנולוגיות הדמיה מתקדמות כדי לזהות אפילו את פגיעות הגביש הקטנות ביותר. טכניקות ביולוגיה מבנית מתפתחות במהירו...

Video: מחבר זרקור: סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות גבישים לקריסטלוגרפיה של חלבונים  

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into an ordered lattice amenable to diffraction remains challenging. The crystallization of biomolecules is largely experimentally defined, and this process can be labor-intensive and prohibitive to researchers at resource-limited institutions. At the National High-Throughput Crystallization (HTX) Center, highly reproducible methods have been implemented to facilitate crystal growth, including an automated high-throughput 1,536-well microbatch-under-oil plate setup designed to sample a wide breadth of crystallization parameters. Plates are monitored using state-of-the-art imaging modalities over the course of 6 weeks to provide insight into crystal growth, as well as to accurately distinguish valuable crystal hits. Furthermore, the implementation of a trained artificial intelligence scoring algorithm for identifying crystal hits, coupled with an open-source, user-friendly interface for viewing experimental images, streamlines the process of analyzing crystal growth images. Here, the key procedures and instrumentation are described for the preparation of the cocktails and crystallization plates, imaging the plates, and identifying hits in a way that ensures reproducibility and increases the likelihood of successful crystallization.

This protocol details high-throughput crystallization screening, ranging from the 1,536 microassay plate preparation to the end of a 6 week experimental time window. Details are included about the sample setup, the imaging obtained, and how users can perform analyses using an artificial intelligence-enabled graphical user interface to quickly and efficiently identify macromolecular crystallization conditions.

﻿Oil and Crystallization Cocktail Well Plate Preparation

Oil and Crystallization Cocktail Well Plate Preparation  

To begin, use a robotic liquid handling system for delivering five microliters of paraffin oil to the wells of a 1536 well plate. Invert the thawed cocktail containing 384 well plates to mix the solutions. Incubate the plates at 30 degrees celsius to dissolve any persistent precipitates.Dispense equal measures of the buffered PEG 3350, and the additive screen components from the 96 well plate into the 384 well plate to a final volume of 50 microliters. Stamp four 384 well plates into a 1536 well plate filling all four quadrants. Using a liquid handling robot equipped with a 384-syringe head, deliver 200 nanoliters of cocktail solution into each well of the 1536 well plate.

שמן והתגבשות קוקטייל הכנת צלחת היטב

Protein Sample Setup and Crystallization

Centrifuge the unpacked thawed sample at 10, 000g for two minutes at room temperature. Observe the sample to identify any precipitation, color, and condition. Warm the prepared 1, 536 well plate to 23 degrees Celsius, and then centrifuge it at 150g for five minutes.Using a brightfield microscope, take pictures of the plate containing the cocktail only to be used as a negative control. Dispense 200 nanoliters of the sample to each well using a liquid handling robot. after centrifuging the plate at 150g, incubate it at the desired temperature for six weeks.Capture brightfield images of the plates with samples at weekly intervals from day 1 to week 6. Perform sonic imaging with the SHG and UV-TPEF. Automated plate imaging throughout the experiment duration allowed for the brightfield identification of rapidly and slow-growing crystals.The UV-TPEF imaging indicated the proteinaceous nature, while the SHG imaging confirmed the crystalline nature of the sample. Sonic imaging enabled the identification of crystals obscured by precipitation or film which do not produce an SHG signal, or microcrystals that may be mistaken as precipitate. Nonprotein crystals lacking UV-TPEF signal but displaying strong brightfield and SHG signals were also identified.

הגדרת דגימת חלבונים והתגבשותם

Image Analysis to Identify Protein Crystals

To analyze the crystallization images, first open the AI-enabled open-source graphical user interface. Next, click on Import, select Images from the dropdown menu, and then choose From Rar Archive/Directory. Click on Browse For Folder in the popup window and then navigate to the folder containing the images.Choose the desired files and import them into the interface by clicking Open. Once the selected files appear in the selected paths window, select one or more to download into the interface and then click on Import Runs. To view the image of the first well, click on the greater than symbol to the left of the sample name on the window of the slideshow viewer, then double-click on the appropriate read.Resize the whole window to enlarge the image. The Image Details box includes information about the image and scoring. The Cocktail Details box contains metadata about the cocktail components.To move to the next well, click on the Next button in the Navigation panel or press the right arrow key on the keyboard. A specific well can be navigated by entering the well number in the By Well Number window. All reads can be viewed by checking the Show All Dates box.All spectra can be viewed by checking the Show All Spectrum box. Each individual spectrum image can be viewed by clicking on the Swap Spectrum button. To score the crystal images using the MARCO algorithm, first select a specific run from the list on the left side of the window, then click on Classify Selected Run and view the MARCO scoring information in the Image Details window once all 1, 536 wells have been scored.To view a subset of the scored images, for example, the images classified as crystals by MARCO, in the Image Filtering panel, tick the crystals and MARCO boxes and then click on the Submit Filters button. To generate a manual human-scored set, assign scores to each well by clicking the appropriate button, located in the Classification panel at the bottom of the window, or use the keyboard number pad to assign a score.