עבודה זו נתמכה על הרולד ויילה י Mathers פרס G. לHL ומענק NIH (R24 GM080527) לRESCEJ ידי היה דוקטורים עמית NRSA (NIH F32GM9037222) והוא נתמך כיום מדען פיתוח פרס מחקר מודרך מהלאומי על ידי מכון להזדקנות (K01AG04435). ברצוננו להודות לביקורות על הערותיו מועילות.

.1 הכנת פלסמיד דנ&quot;א, מחטים, וכלי הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פלסמיד דנ&quot;א באמצעות ערכת High Speed ​​מקסי או מידי ולהתרכז DNA ל2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​באמצעות משקעים אתנול. גלולה DNA צריכה להיות מומסת במים ללא יוני nuclease חינם. אחסן את הדנ&quot;א ב10-20 aliquots μl ב -20 מעלות צלזיוס. (ראה טבלת משלים 1 לרשימה של וקטורים זמינים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן מנה הזרקה באמצעות agarose לבנות שוקת להחזקת עוברים בצלחת פטרי 100 x 15 מ&quot;מ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית מיקרוסקופ 75 x 50 זכוכית לתוך 100 x 15 מ&quot;מ צלחת פטרי בזווית. יוצקים כ 50 מ&quot;ל של 2% מומס agarose במדיום הידרה 24 לתוך צלחת פטרי. , לחלופין לשפוך agarose לתוך הצלחת הראשונה ולצוף &quot;עובש Microinjection דגים&quot; על גבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose יש הקרושה, להסיר את שקופית הזכוכית או העובש. אם שקופיות זכוכית שימשה, לחתוך agarose העודף עם bla גילוחדה ליצירת קיר. יוצקים בינוני הידרה לתוך הצלחת ולהשתמש בו באופן מיידי או לשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס עד צורך. ניתן לעשות שימוש חוזר מנות הזרקה אם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס בין שימושים: הערה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך מחטים מנימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה על חולץ micropipette באמצעות התנאים הבאים: לחמם 525, למשוך 75, מהירות 100, זמן 50. חנות המחטים על ידי לחיצה על אותם לתוך רצועה צרה של חימר בצלחת פטרי באופן שהם במקביל מוחזק לתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את פתרון ההזרקה, לשלב 3 μl של 2.5 מ&quot;ג / פתרון פלסמיד דנ&quot;א מ&quot;ל עם 2 μl של 10% פנול אדומים. מערבולת הפתרון לזמן קצר ולאחר מכן לסובב אותו עבור 10 דקות במהירות המרבית בmicrocentrifuge כדי להסיר כל חלקיקים שעלולות לסתום את המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, קליפ המחט כמה מילימטרים מהקצה עם מלקחיים כדי ליצור פתח קטן. הערה: יש גמישות מסוימת בגודל המתאים של פתוחing כי הלחץ יכול להיות מותאם בשלב 3.3 ליתאים למגוון הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי, כך שהוא מחזיק את המחט במצב אנכי עם את הקצה. טען את המחט עם כ 0.5 μl של פתרון הזרקה ידי pipetting את הנוזל לתוך הקצה האחורי של המחט. לאפשר פעולת נימים למשוך את הפתרון לקצה המחט. </li></ol> 2 הכנת עוברים להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על בסיס יומי לסרוק תרבות זן הידרה AEP לפוליפים בייצור ביצים. לאסוף פוליפים אלה ולהגדיר אותם בצד בצלחת תרבות נפרדת. שים לב פוליפים אלה כל כמה שעות במהלך היום כדי לעקוב אחר ההתקדמות של היווצרות ביצה. כאשר ביצים לפרוץ את האאקטודרם ולשבת על טבעת של תאי ectodermal חזרו בו הם מוכנים להזרקה 25. הנח פוליפים אלה בצלחת עם כמה הידרה שיש לי אשכים במשך שעה לפחות 1 לפני ההזרקה כדי לאפשר הפריה. הידרה &lt;/ Em&gt; זכרים ישחררו זרע ללא כל מניפולציה מיוחדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נשים נמצאות במושבה AEP עם ביצים בנויות באופן מלא, שהם כ 400 מיקרומטר בקוטר 25, או 1 לעוברי שלב 8 תאים, גם לאסוף אלה להזרקה. מייד להזריק עוברים שנכתבו על דבקות. הערה: לא ניתן להבחין בהבדל בין ביצים בנויות באופן מלא וzygotes חד תאי, ובכך אלה צריכים להיות מודגרות עם זכרים לפני ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההזרקה, להסיר את רוב רקמת ההורים מעל ומתחת לעובר באמצעות אזמל עם להב # 15. השאר רק את העובר עם חתיכה קטנה של טור גוף המצורף, כדי לשמש כדי לתפעל את העובר עם מלקחיים במידת צורך. הערה: הרקמה שגזורה מאת העובר יהיה להתחדש וצריך להישמר כדי להבטיח שנשים יישארו במושבה הידרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר, להעביר עוברים למנת ההזרקה, סידר אותם במקביל לקיר שלשוקת agarose. </li></ol> .3 Microinjection של פלסמיד דנ&quot;א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר microinjector על דוכן מגנטי שיושב על צלחת ברזל. הר בעל ההזרקה, המהווה את החלק של microinjector שמחזיק את המחט, על micromanipulator ג&#39;ויסטיק. הר מניפולטור ג&#39;ויסטיק לצלחת הברזל, עם דוכן מגנטי. מניחים כל המכלול הזה בצד ימין של מיקרוסקופ לנתח ומקם את בעל ההזרקה כך שזה נראה לעין בתחום התצפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת ההזרקה עם עוברים מתחת למיקרוסקופ לנתח, אוריינטציה כך שהקיר האנכי של שוקת agarose הוא בצד השמאל. הכנס את המחט לתוך מחזיק ההזרקה ולהוריד את קצה המחט לתוך מדיום הידרה בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לסובב את הידית של המזרק בכיוון השעון עד ששמן מינרלים ממלא את החלק העליון של המחט וזרם קבוע של פתרון הזרקה הוא ציין יציאת המחט לתוך hydrבינוני. אם הזרם חזק מדי, צריך להוריד את הלחץ על ידי סיבוב הידית נגד כיוון השעון. לתרגל את הצעד הזה כדי להשיג לחץ מתאים, אשר תלוי בגודל של פתיחת המחט (כלומר, איך המחט הייתה מוצמדת בשלב 1.5) באופן שיגרתי. הערה: אם הזרם חזק מדי, העובר לא ישרוד את הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת הצפייה באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להעביר את צלחת ההזרקה כך שהעובר הראשון הוא במרכז השדה. להזיז את המחט כך שהוא נוגע בעובר ש. השתמש micromanipulator כדי לחדור את העובר עם המחט. הערה: הקיר האנכי של שוקת agarose ישמור את העובר מהדחיפה הצידה על ידי המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון ההזרקה לזרום אל תוך שניות 1 או 2 עובר ולאחר מכן הסר את המחט במהירות. אם העובר יש תא אחד או יותר, להזריק כל תא בנפרד. שימוש במלקחיים לארגון מחדש של העובר כדי ליישר את התא הבא עם קצה המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אמברי הראשוןo מוזרקת, להזיז את הצלחת כדי שהעובר הבא הוא בעמדת הזריקה ולחזור על התהליך; תמשיך עד שכל העוברים כבר הזריק. </li></ol> .4 Culturing ובקיעה של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל העוברים הוחדרו לתוך צלחת עם כמה הידרה שיש לי אשכים (זה הוא להבטיח כי כל העוברים הם מופרה). דגירה עובר בחממת C ° 18 בעוד הם ממשיכים עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהוא הגיע לשלב שהציפורן, לעבור כל עובר מוזרק ולבודד של צלחת 24 גם מלאה בינוני הידרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר המוזרקת ל2 שבועות בחושך ב18 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה 2 בשבוע, לבדוק כל עובר מוזרק מתחת למיקרוסקופ לנתח. שים לב כל המקרים שבהם עובר ציפורן בשלב ניתק מהפיסה הקטנה של רקמת הורים ורקמת ההורים כבר התאחתה. הסר פוליפ מחדש זה מייד, כך שהוא לא מילstaken לגוזל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הצלחת של עוברים מוזרקים תחת אור אקווריום ב RT. בדוק את הצלחות בכל יום ולאסוף גוזלים. גוזלים חדשים יהיו לבנים כי הצבע הוורוד האופייני לפוליף הידרה מגיע מהארטמיה שהם אוכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לגוזלים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות ביטוי transgene. </li></ol>

<ol>
	<li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis.">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li><li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydra.">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li><li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra.">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li><li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra.">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li><li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation.">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li><li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells.">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li><li>David, C. N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning.">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li><li>Chapman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+genome+of+Hydra.">The dynamic genome of Hydra.</a> Nature. 464, 592-596 (2010).</li><li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra.">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li><li>Glauber, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra.">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li><li>Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+complexity+in+the+basal+metazoan+Hydra+is+maintained+by+both+stem+cell+based+mechanisms+and+transdifferentiation.">Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation.</a> Dev Biol. 313, 13-24 (2008).</li><li>Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+epithelial+cell+shape+in+response+to+upstream+signals:+a+whole-organism+study+using+transgenic+Hydra.">Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra.</a> Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).</li><li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity.">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li><li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells.">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li><li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra.">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li><li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type.">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8 (2009).</li><li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer.">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li><li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra.">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li><li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+an+early+branching+metazoan,+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides.">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li><li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris.">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686 (2010).</li><li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra.">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li><li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers.">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li><li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution.">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643 (2012).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).</li><li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells.">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 53-62 (1983).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

הידרה מתרבה באופן שגרתי לא מינית, אבל דורשת גירויים סביבתיים כדי להתחיל תאי מין הפקה. גירויים אלה אינם מוגדרים היטב עבור רוב מיני הידרה ועשויים להיות שונה מזן לזן. המשוכה משמעותית לייצור של הידרה המהונדס היא קבלת עוברים על בסיס קבוע, כי זה יכול להיות קש?...

הידרה נעשתה שימוש כדי ללמוד התחדשות, היווצרות דפוס, ותאי גזע עבור כ 250 שנים 2 יש הידרה תכנית גוף פשוטה המורכבת של שושלות שלושה תאים:. אפיתל ectodermal, אפיתל endodermal, וביניים. הגוף צינורי נוצר על ידי ectodermal ושושלות אפיתל endodermal, כל אחד מהם הוא שכבת תא בודדת. כל תאי האפיתל בעמודת הגוף הם mitotic. כאשר תאי האפיתל הם עקורים לגפיים 3, הראש (פה וזרועות) בסוף הפה או ברגל (הדיסק הבסיסי) בסוף aboral, הם יעצרו בשלב G2 של מחזור התא ולשנות תא גורל 4. התאים של שושלת ביניים מתגוררים בתוך החללים שבין תאי האפיתל. שושלת זו נתמכת על ידי תאי גזע multipotent הנמצאים בשכבת האפיתל ectodermal של העמודה גוף 5. תאי גזע ביניים מעוררים שלושה cel סומטייםסוגי l (עצבים, תאי בלוטה, וnematocytes) ותאי הנבט 6,7. כחבר המיון הצמחי Cnidaria, קבוצת האחות לכל bilaterians, הידרה יכולה לשפוך אור על תהליכים ביולוגיים בסיסיים המשותפים בין בעלי חיים רב תאיים. עד לאחרונה, מאמצים אלה הקשו על ידי החוסר של שיטות אמינות להפרעות של תפקוד גן. עם זאת, עם התפתחותה של המתודולוגיה מהונדס 1, אנו יכולים לנצל את מלוא יתרונות של הידרה כדי להשיג הבנה טובה יותר של המנגנונים הבסיסיים המשותפים לבעלי חיים רב תאיים, כגון תפקוד תאי גזע, התחדשות, ודפוסים עכשיו. קווים המהונדס הידרה נקבעים על ידי הזרקה של DNA פלסמיד לעוברי, מה שגורם אינטגרציה אקראית וביטוי chimeric בתדירות משמעותית של גוזלים. קו עם ביטוי אחיד בשושלת מסוימת יכול להיות שהוקם על ידי התפשטות מינית. היכולת להפיץ transg clonallyenic הידרה קווים היא יתרון על רוב המודלים של בעלי חיים, אשר יכול להיות מופץ רק על ידי רבייה מינית. בנוסף, ניתן לעקוב אחר תאים מהונדסים בקלות in vivo בשל השקיפות של בעלי החיים והעדר חלבוני ניאון אנדוגני 8. בשבע השנים שחלפה מאז קווי הידרה מהונדסים הראשונים נעשו 1, קווים כאלה היו בשימוש עבור מגוון רחב של יישומים. ביטוי של חלבוני ניאון בתאים מסוגים שונים, הפך אותו ניתן לעקוב אחר תנועת תא, לצפות בשינויים בצורת תא, ולעקוב אחר גורל תא הן בתנאים מסוג בר ולאחר ההפרעות כימיות 1,5,9-12. בנוסף, ביטוי של חלבוני ניאון שונים בשושלות השונות מאפשר לבידוד FACS של אוכלוסיות תאים ספציפיות. טכניקה זו הייתה בשימוש כבר הרצף של mRNAs הספציפי בתאי הגזע וRNA הקטן השושלת הספציפית 13,14. בעוד האמרגן שלאחד משני הגנים אקטין הידרה כבר בשימוש נרחב ביותר, יזמים מסוימים כמה תאים מסוג זוהו ולהשתמש בכונן ביטוי של GFP בהידרה המהונדס 9,11,15,16. בעתיד, יזמים ספציפיים תא מהסוג יאפשר לתצפית והאיסוף של כל סוג תא מסוים. בנוסף, גישה מהונדס הייתה בהצלחה המשמשת להגדרת האלמנטים רגולטוריים cis-בפועל של אמרגן Wnt3 17. פיתוח שיטות מהונדסים בהידרה מספק גישה חזקה לבדיקת תפקודם של גנים על ידי ביטוי מחוץ לרחם, ביטוי יתר, ומציאה. בעלי חיים מהונדסים נעשו שמבטאים חלבוני fluorescently- מתוייגים על מנת לבחון שתי פונקציה ולוקליזציה סלולרית 18-20. בנוסף, הביטוי של סיכות ראש RNA ב3&#39;UTR של transgene GFP מוביל למציאה של גני המטרה 21,22. בגישות אלה נדרש GFP לזהותולעקוב אחר הרקמות מהונדסים במהלך היצירה של הקו המהונדס. עם זאת, סביר להניח כי במקרים מסוימים מולקולת GFP הייתה מפריעה לתפקוד של החלבון מתויג. מחקר שנערך לאחרונה מוכיח כי ניתן לארגן גני הידרה בתצורת אופרון, כלומר, תעתיקי polycistronic נעשים, אשר לאחר מכן הם מופרדים על ידי בנוסף, מנהיג שחבור טרנס ותורגמו בנפרד 23. על ידי הצבת גן קידוד חלבון או סיכת ראש RNA במצב במעלה הזרם של אופרון וגן חלבון פלואורסצנטי בעמדה במורד הזרם, אחד יכול לעקוב אחר רקמות מהונדסים מבלי לתייג את הגן המקודד את חלבון סיכת הראש או RNA. שיטה זו נעשתה שימוש כדי להביע את סיכת ראש RNA בתצורת אופרון עם DsRed2 על מנת להשיג גן מציאה 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AEP Hydra Strain</td>
			<td style="width:112px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:576px;">Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High Speed Maxi Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 15 mm Petri Dishes</td>
			<td style="width:112px;">BD Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">75 x 50 mm Glass Microscope Slide</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection Fish Mold</td>
			<td style="width:112px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FM-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Borosilicate Glass with Filament</td>
			<td style="width:112px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">BF100-50-10</td>
			<td>O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:112px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers Forceps, Durmont #5</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel Blade #15</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-822-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IM-9B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnetic Stand</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iron Plate</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Joystick Micromanipulator</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of transgenic hydra by embryo microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

הקמת קווי הידרה מהונדסים להאכיל את הגוזלים מהונדסים כל 2-3 ימים עם Nauplii הארטמיה. גוזלים לפעמים לא אוכלים ליום או ימים לאחר הבקיעה. כמה גוזלים חדשים לעולם לא לאכול, ולכן לא ישרדו. אם הגוזל הוא מהונדס באו ectodermal (איור 1 א)</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection at JoVE.com

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

דור של הטרנסגניים<em&gt; הידרה</em&gt; על ידי Microinjection העובר

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

generation-of-transgenic-hydra-by-embryo-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

13.9K Views.  Yale University School of Medicine. Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi. 

Video: Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

Culturing<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em &gt; בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

מדידת תגובת האכלה מושרה גלוטתיון בהידרה

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...