ברצוננו להודות לשירות WSU Small Animal Internal Medicine Service (ד"ר ג'יליאן היינס, ד"ר שרה גוס, Shelley Ensign LVT) ולמתאמת המחקרים הקליניים של WSU VTH Valorie Wiss על תמיכתם בגיוס מקרים ואיסוף דגימות ממדענים אזרחיים (תורמי מטופלים). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי משרד המנהל, המכונים הלאומיים לבריאות (K01OD030515 ו-R21OD031903 ל-Y.M.A.) והאגודה היפנית לקידום המדע בחו"ל תוכנית אתגר לחוקרים צעירים (202280196 ל-I.N). איור 1A ואיור 3A נוצרו עם BioRender.com.

הקמת מורפוגנזה תלת ממדית במערכת מעיים על שבב של IBD לכלבים

למחברים אין שום ניגוד עניינים להצהיר.

מחקר זה מסמן את ההדגמה החלוצית של התאימות של אורגנואידים במעיים של כלבים עם פיתוח מודל IBD Gut-on-a-Chip של כלבים. השילוב של אורגנואידים במעי ותרביות חד-שכבתיות שמקורן באורגנואידים למערכת מיקרופלואידית (כלומר, מערכת מעיים על שבב) פיתח עוד יותר את הטכנולוגיה, ומאפשר יצירת מודלים של מעיים במבחנה המחקים באופן הדוק דינמיקה פיזיולוגית ומייצגים יותר מצבים ביולוגיים. בפרט, מאחר שיש מעט מאוד דיווחים על תרבית מעיים על שבב באמצעות אורגנואידים שמקורם ב- IBD בבני אדם, המחקר הנוכחי המשתמש ב- Gut-on-a-Chip שמקורו ב- IBD עשוי לספק תובנות מובילות לחקר IBD בבני אדם.
הפיתוח המוצלח של מורפוגנזה תלת-ממדית של אפיתל המעי הכלבי על גבי מעיים על שבב דורש תשומת לב קפדנית למספר שלבים קריטיים. ראשית, פני השטח ההידרופוביים של תעלות מיקרופלואידיות PDMS עלולים לעכב הידבקות ECM וחיבור תאים לאחר מכן, מה שמחייב הפעלת משטח של PDMS לפני ציפוי ECM וזריעת תאים (ראה פרוטוקול סעיף 1). כדי להשיג תרבית חד-שכבתית יציבה, הסרת תאים עודפים שאינם מחוברים היא חיונית לאחר חיבור תאים (שלבי פרוטוקול 4.6-4.7). בנוסף, גירוי דינמי, כגון זרימה בינונית קבועה ותנועת ואקום פריסטלטית, הכרחי למורפוגנזה תלת-ממדית של אפיתל המעי (שלב פרוטוקול 5.2). טיפול זהיר חיוני כדי למנוע בועות אוויר במיקרו-ערוץ במהלך כל שלב של תרבית Gut-on-a-Chip.
אם נתקלים בזריעת תאים לקויה לתוך המעיים על השבב, זה יכול להיות בגלל מספר תאים נמוך או חיבור תאים לקוי. כדי לפתור בעיות של מספרי תאים נמוכים, חשוב לבדוק את בריאותם של אורגנואידי מעיים מוכנים על ידי התבוננות בצמיחתם במטריגל. ניתן להעריך את כדאיות התא על ידי צביעה כחולה של טריפאן לאחר דיסוציאציה של התא כדי להבטיח שלא יותר מ-20% מהתאים מתים. אם מספרי תאים בני קיימא אינם מספיקים, ניתן לנסות למטב תנאים בינוניים אורגנואידים. אפשרות נוספת היא דיסוציאציה אורגנואידית חלקית, וכתוצאה מכך עודף של גושי תאים גדולים מ-70 מיקרומטר שנלכדים על ידי המסנן. כדי לפתור זאת, אפשרות אחת היא להאריך את משך הפיפטינג במהלך דיסוציאציה של תאים. לחלופין, צינור חרוטי 15 מ"ל יכול להיות נסער בעדינות כל דקה תוך כדי טיפול עם פרוטאז דמוי טריפסין. חיבור תאים לקוי למעי על שבב עשוי לנבוע מציפוי ECM לא תקין. במהלך תהליך הציפוי, מומלץ לבדוק היטב נוכחות של בועות אוויר ולמנוע את היווצרותן על ידי הוספה עדינה של תמיסת ציפוי נוספת לפי הצורך. צפיפות יתר של תאים ואי שטיפת תאים לא מחוברים עלולה לגרום לחד-שכבה ראשונית לא מספקת. במקרה כזה, פעימה קלה ניתן ליישם בעת דחיפת הבוכנה מזרק. שלבים אלה לפתרון בעיות יכולים לעזור לזהות בעיות ולטפל בהן במהלך תהליך התרבית של Gut-on-a-Chip.
בעוד שפלטפורמת Gut-on-a-Chip זו מאפשרת יצירת שכבות אפיתל תלת-ממדיות חשופות, אנו מכירים בצורך במורכבות ביולוגית נוספת כדי לשכפל את מיקרו-סביבת המעי במלואה. חשוב לקחת בחשבון את יחסי הגומלין בין תאי אפיתל לתאים מזנכימליים, את התצהיר של ECM להתחדשות תלת-ממדית, ואת נוכחותם של מאפייני קריפטו-וילוס המקימים נישה מתאימה של תאי גזע. תאי סטרומה, כגון פיברובלסטים, ממלאים תפקיד חיוני בייצור חלבוני ECM ובוויסות מורפוגנזה של המעי34,35,36. להכללת תאים מזנכימליים במודל זה יש פוטנציאל לשפר הן את המורפוגנזה והן את יעילות ההתקשרות של התא. שכבות אנדותליות, הכוללות כלי דם נימיים וכלי לימפה, ממלאות תפקיד מכריע בשליטה על הובלה מולקולרית וגיוס תאי חיסון37,38. הכללת תאי חיסון שמקורם בחולה יכולה להיות חיונית במידול מחלות מעיים מכיוון שהיא מאפשרת הדגמה של יחסי הגומלין בין חסינות מולדת ונרכשת, כמו גם הקמת חסינות ספציפית לרקמות39. לאחר השלמת מורפוגנזה תלת-ממדית ב-Gut-on-a-Chip, ניתן לשנות את מדיום תרבית האורגנואידים למדיום התמיינות אורגנואידים. זו יכולה להיות גישה מעשית לגרימת התמיינות תאית נוספת, בהתאם למטרות הניסוי.
הדמיה של מיקרו-ארכיטקטורה תלת-ממדית באתרה מאתגרת בשל מרחק העבודה הארוך הנדרש, שניתן להתגבר עליו באמצעות מטרה למרחקים ארוכים. בנוסף, שיטות המיקרו-ייצור וההדבקה של שכבה אחר שכבה מקשות על הגישה לשכבות העליונות לבדיקה עם SEM. לצורך התכנון הנוכחי של Gut-on-a-Chip, יש צורך במשאבת מזרק אחת לכל מיקרו-מכשיר Gut-on-a-Chip, שתתפוס את שטח אינקובטורCO2 ותמנע ניסויים בקנה מידה גדול. יש צורך בחידושים כדי להגביר את המדרגיות עבור פלטפורמה ידידותית למשתמש וסינון בתפוקה גבוהה.
פרוטוקולים נוכחיים אלה מאפשרים התפתחות ספונטנית של שכבות אפיתל תלת-ממדיות במבחנה, העולות על המגבלות של אורגנואידים תלת-ממדיים מסורתיים, חד-שכבות דו-ממדיות ומערכות תרבית מיקרו-מכשירים סטטיות. ניתן לשלוט בדינמיקה זו של מיקרו-סביבת מעיים חוץ גופית על ידי החדרת תרבית משותפת של סוגי תאים מגוונים. מחקרים קודמים בחנו שיטות למניפולציה של מיקרו-סביבת מעיים-על-שבב, כולל תרבית משותפת של מיקרוביום המעי14,23 ותאים חד-גרעיניים היקפיים30. למיקרו-סביבה משוחזרת זו יש יישומים פוטנציאליים רבים, כולל בדיקות סמים, מחקרים מכניסטיים בסיסיים ומידול מחלות. המיקרו-סביבה המשוחזרת טומנת בחובה פוטנציאל משמעותי למגוון רחב של יישומים, כגון בדיקות סמים 23,40,41 ומידול מחלות 12,13,14,30, כמו גם חקירות מכניסטיות בסיסיות של מורפוגנזה של המעי 42. מגוון בדיקות יכול להתבצע על ידי איסוף supernatants להערכה של מטבוליטים 43, על ידי איסוף תאים לבדיקה גנומית 2,32, או על ידי בדיקה חזותית של התאים באמצעות צבעים של תאים חיים או קיבוע עבור הדמיה immunofluorescence לאחר מכן23,44.
מחקר זה מציג פרוטוקול הניתן לשחזור לפיתוח מורפוגנזה תלת-ממדית של שכבות אפיתל במעיים של כלבים בפלטפורמת Gut-on-a-Chip. מבנה האפיתל התלת-ממדי שנוצר מספק ייצוג מציאותי יותר של מיקרו-סביבת המעי, שיש לה פוטנציאל עצום ליישומים במחקרים ביו-רפואיים שונים. על ידי שימוש בארכיטקטורת מעיים זו, אנו יכולים לערוך מחקר תרגומי יותר ופוטנציאלית להניב תוצאות מבטיחות.

מורפוגנזה אפיתל של המעי נחקרה בעיקר באמצעות מודלים של חיות מעבדה, שהם יקרים, גוזלים זמן רב ואינם מייצגים במדויק תהליכים התפתחותיים אנושיים1. יתר על כן, מודלים קונבנציונליים של תרביות תאים דו-ממדיות סטטיות חסרים את היכולת לחקות את הארגון המרחבי המורכב של ארכיטקטורת אפיתל תלת-ממדית2. כתוצאה מכך, יש צורך בפרוטוקול להשראת מורפוגנזה תלת-ממדית במבחנה באמצעות תאי אפיתל מעיים ממודלים רלוונטיים לבני אדם של בעלי חיים כדי לקדם את הבנתנו את ארכיטקטורת אפיתל המעי.
כלבי לוויה פיתחו אנטומיה של המעי והרכבי מיקרוביום הדומים להפליא לבני אדם בשל סביבתם המשותפת ותזונתם במהלך הביות3. בנוסף לדמיון זה, גם בני אדם וגם כלבים חולקים תחלואה כרונית שונים המיוחסת ככל הנראה לבריאות המעי. כלבים, כמו בני אדם, יכולים לפתח באופן ספונטני מצבים כרוניים כגון השמנת יתר, תפקוד קוגניטיבי, סוכרת, מחלות מעי דלקתיות (IBD) ואדנוקרצינומה של המעי הגס 4,5,6,7,8,9,10. למרות הפיתוח והשימוש בתאי אפיתל אנושיים ומורין במחקרי מעיים על שבב קודמים 2,11,12,13,14, אפיתל מעיים של כלבים לא היה בשימוש עד כה. לגישה החדשנית שלנו, המשתמשת באפיתל אורגנואיד של המעי הכלבי במערכת תרבית דינמית עם מורפוגנזה אפיתל תלת-ממדית, יש השלכות משמעותיות הן על הרפואה הכלבית והן על רפואת האדם.
ההתקדמות האחרונה בתרבית אורגנואידים במעיים הובילה להקמת תרבית אורגנואידים במעיים של כלבים15. מערכת תרבית זו כוללת גידול תאי גזע במעי תחת התניה מורפוגנית מוגדרת, והתוצאה היא מודל תלת-ממדי בעל תכונות התחדשות עצמית הנגזרות מתאי גזע בוגרים16. עם זאת, ביצוע מבחני הובלה או תרבויות מיקרוביום מארח מציב קשיים עם מודל תלת ממדי זה בגלל האופי הסגור של לומן המעי17. כדי להתמודד עם זה, חוקרים יצרו חד-שכבה דו-ממדית שמקורה באורגנואידים במעי, ומאפשרת חשיפה של פני השטח הלומינליים18,19. עם זאת, הן אורגנואידים תלת-ממדיים והן חד-שכבות דו-ממדיות נשמרים בתנאים סטטיים, שאינם משקפים במדויק את הביומכניקה in vivo של מיקרו-סביבת המעי. שילוב טכנולוגיית אורגנואידים כלביים שמקורם במטופל עם מורפוגנזה תלת-ממדית במבחנה מהווה הזדמנות למחקר תרגומי למחלות כרוניות רב-גורמיות. גישה זו מאפשרת לחוקרים לפתח טיפולים יעילים יותר לטובת בני אדם וכלבים כאחד ולקדם עוד יותר מחקר תרגומי, בהתאם ליוזמת הבריאות האחת, שהיא גישה שיתופית המכירה בקשרים ההדדיים בין בריאות האדם, בעלי החיים והסביבה. היא מקדמת שיתוף פעולה בין-תחומי כדי להתמודד עם אתגרי בריאות מורכבים ולהשיג תוצאות בריאותיות אופטימליות לכולם. על ידי הבנת התלות ההדדית בין בני אדם, בעלי חיים ומערכות אקולוגיות, היוזמה שואפת להפחית סיכונים ממחלות זיהומיות מתפתחות, הידרדרות סביבתית ודאגות בריאותיות משותפות אחרות20,21,22.
פרוטוקול זה מתאר שיטות מקיפות לגידול תאי אפיתל של מעי כלבים המתקבלים מאורגנואידים של מטופלים על גבי מיקרו-מכשיר Gut-on-a-Chip עם קרום נקבובי מבוסס פולידימתילסילוקסאן (PDMS). ביסוס מורפוגנזה תלת-ממדית של אפיתל על ידי שילוב אורגנואידים של מעיים כלבים וטכנולוגיית Gut-on-a-Chip זו מאפשרת לנו לחקור כיצד המעי מתפתח ומתחזק את הארגון התאי שלו ואת נישת תאי הגזע שלו. פלטפורמה זו מציעה הזדמנות רבת ערך לחקור את ההשפעה של קהילות מיקרוביום על בריאות המעי ולהבין כיצד קהילות אלה מייצרות מטבוליטים מיקרוביאליים התורמים לפתופיזיולוגיה של המעי14,23. כעת ניתן להרחיב את ההתקדמות הזו גם לדגימות מעיים של כלבים, ולספק לחוקרים הזדמנויות לחקור את הקשר המורכב בין מיקרוביום המעי לבין הפיזיולוגיה של המאכסן. זה פותח דרכים להשגת תובנות יקרות ערך לגבי המנגנונים הבסיסיים של פתופיזיולוגיה של המעי והבנת התפקיד הפוטנציאלי של מטבוליטים מיקרוביאליים הן בבריאות הכלבים והן בבריאות האדם, כמו גם במצבי מחלה שונים. הפרוטוקול המשמש למעיים על שבב כלבים ניתן לשחזור, מה שהופך אותו למודל ניסיוני מתאים לרפואה השוואתית, שכן גישה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות מיקרוביום מארח, זיהומים פתוגנים והשפעות טיפוליות מבוססות פרוביוטיקה הן בכלבים והן בבני אדם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>2 mM, glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT30009CI</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids and organoid medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>9094360</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td>2.5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells engineered to secrete Noggin&#160;</td>
			<td>Baylor College of Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 MAX Media supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1x&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin Conditioned Medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>10% vol/vol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin1 (Rspo1) cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td>Rspo1 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin-1 Conditioned Medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20% vol/vol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td>&#160;10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>StemCellTechnologies</td>
			<td>72308</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15 ]-Gastrin I human&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td>x250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG H&#38;L labeled with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>x1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>x50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>x1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Glutaraldehyde Aqueous 50%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine) solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408700-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>87V Industrial Multimeter</td>
			<td>Fluke Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C170i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-103-0519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexCell FX-5000 Tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase-contrast microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8-X inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>SP8-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>model no. BS-8000 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 1 mL sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/ozone generator</td>
			<td>Jelight Company</td>
			<td>model no. 30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X imaging software&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional morphogenesis in canine gut-on-a-chip using intestinal organoids derived from inflammatory bowel disease patients

למעיים של כלבים יש דמיון באנטומיה, מיקרוביולוגיה ופיזיולוגיה לאלה של בני אדם, וכלבים מפתחים באופן טבעי הפרעות מעיים ספונטניות בדומה לבני אדם. התגברות על המגבלה המובנית של אורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) בגישה למשטח האפי של אפיתל המעי הובילה ליצירת תרביות חד-שכבתיות דו-ממדיות (דו-ממדיות), החושפות את פני השטח הלומינליים הנגישים באמצעות תאים שמקורם באורגנואידים. השילוב של אורגנואידים אלה ותרביות חד-שכבתיות שמקורן באורגנואידים במערכת מעיים על שבב מיקרופלואידית פיתח עוד יותר את הטכנולוגיה, ואיפשר פיתוח של מודלים דינמיים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית במעי חוץ גופי .
במחקר זה אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מורפוגנזה תלת-ממדית של אפיתל המעי הכלבי באמצעות דגימות רקמת מעי ראשוניות שהתקבלו מכלבים שנפגעו ממחלות מעי דלקתיות (IBD). כמו כן, אנו מתווים פרוטוקול ליצירה ותחזוקה של תרביות חד-שכבתיות דו-ממדיות ומערכות מעי-על-שבב באמצעות תאים שמקורם באורגנואידים תלת-ממדיים של המעי. הפרוטוקולים המוצגים במחקר זה משמשים מסגרת בסיסית להקמת מערכת מעיים על שבב מיקרופלואידית שתוכננה במיוחד עבור כלבים. על ידי הנחת היסודות לגישה חדשנית זו, אנו שואפים להרחיב את היישום של טכניקות אלה במחקר ביו-רפואי ותרגומי, בהתאם לעקרונות של יוזמת הבריאות האחת. על ידי שימוש בגישה זו, אנו יכולים לפתח מודלים דינמיים במבחנה רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית לחקר הפיזיולוגיה של המעי הן אצל כלבים והן אצל בני אדם. יש לכך השלכות משמעותיות על יישומים ביו-רפואיים ותרופתיים, שכן זה יכול לסייע בפיתוח טיפולים יעילים יותר למחלות מעיים בשני המינים.

Intestinal epithelial morphogenesis has been largely studied through laboratory animal models, which are costly, time-consuming, and do not accurately represent human developmental processes1. Furthermore, conventional static 2D cell culture models lack the ability to mimic the complex spatial organization of a 3D epithelial architecture2. As a result, there is a need for a protocol to induce in vitro 3D morphogenesis using intestinal epithelial cells from human-relevant animal models to advance our understanding of gut epithelial architecture.
Companion dogs have developed intestinal anatomy and microbiome compositions that are remarkably similar to humans due to their shared environment and diet during domestication3. In addition to this similarity, both humans and dogs share various chronic morbidities that are thought to be attributed to intestinal health. Dogs, like humans, can spontaneously develop chronic conditions such as obesity, cognitive dysfunction, diabetes mellitus, inflammatory bowel disease (IBD), and colorectal adenocarcinoma4,5,6,7,8,9,10. Despite the development and use of human and murine epithelial cells in previous Gut-on-a-Chip studies2,11,12,13,14, canine intestinal epithelium has not been utilized until now. Our novel approach, utilizing canine intestinal organoid epithelium in a dynamic culture system with a 3D epithelial morphogenesis, has significant implications for both canine and human medicine.
Recent advancements in intestinal organoid culture have led to the establishment of canine intestinal organoid culture15. This culture system involves culturing intestinal stem cells under defined morphogen conditioning, resulting in a 3D model with self-renewing properties derived from adult stem cells16. However, conducting transport assays or host-microbiome cocultures poses difficulties with this 3D model because of the enclosed nature of the intestinal lumen17. To address this, researchers have generated a 2D monolayer derived from intestinal organoids, allowing for exposure of the luminal surface18,19. However, both 3D organoids and 2D monolayers are maintained under static conditions, which do not accurately reflect the in vivo biomechanics of the intestinal microenvironment. Combining patient-derived canine organoids technology with in vitro 3D morphogenesis presents an opportunity for translational research into chronic multifactorial diseases. This approach enables researchers to develop more effective treatments benefiting both humans and dogs and further advance translational research, aligning with the One Health Initiative, which is a collaborative approach that recognizes the interconnectedness of human, animal, and environmental health. It promotes interdisciplinary cooperation to address complex health challenges and achieve optimal health outcomes for all. By understanding the interdependencies between humans, animals, and ecosystems, the initiative aims to mitigate risks from emerging infectious diseases, environmental degradation, and other shared health concerns20,21,22.
This protocol outlines comprehensive methods for culturing canine intestinal epithelial cells obtained from patient organoids on a Gut-on-a-Chip microdevice with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membrane. Establishing the 3D epithelial morphogenesis by integrating canine intestinal organoids and this Gut-on-a-Chip technology enables us to study how the gut develops and maintains its cellular organization and stem cell niche. This platform offers a valuable opportunity to investigate the impact of microbiome communities on gut health and understand how these communities generate microbial metabolites that contribute to intestinal pathophysiology14,23. These advancements can now be extended to canine intestinal samples, providing researchers with opportunities to explore the intricate relationship between the gut microbiome and host physiology. This opens up avenues for gaining valuable insights into the underlying mechanisms of intestinal pathophysiology and understanding the potential role of microbial metabolites in both canine and human health, as well as various disease conditions. The protocol used for canine Gut-on-a-Chip is reproducible, making it a suitable experimental model for comparative medicine, as this approach enables investigation of host-microbiome interactions, pathogen infections, and probiotic-based therapeutic effects in both dogs and humans.

Author Spotlight: פיתוח ויישום של מודל מעי דלקתי של כלבים עבור מחקרי מורפוגנזה תלת-ממדית במעיים 

מורפוגנזה תלת ממדית במעי על שבב של כלבים באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם במחלות מעי דלקתיות

Our research goal is to create a method for growing 3D structures using intestinal cells from animals similar to humans, specifically dogs. Intestinal cellular morphogenesis has been largely studied through laboratory animal models, which are costly, time consuming, and do not accurately represent human developmental processes. Furthermore, conventional static 2D cell culture models lack the ability to mimic the complex spatial organization of a 3D abSerial architecture.Achieving the attachment of individual cells derived from intestinal organoids onto the ECM-coated PDMS surface has posed a significant challenge. A pivotal step in addressing this challenge in both ensuring a uniform ECM coating through surface activation and allowing it to dry overnight. The integration of patient-derived canine organoid technology with in-vitro 3D Morphogenesis offers a promising avenue for conducting translational research into chronic multifactorial diseases, aligning with the One Health Initiative.The protocol for canine IBD, got on a chip, offers a replicable model for comparative medicine, enabling studies on intestinal morphogenesis, host-microbiome interactions, infections, drug and probiotic screenings, and has cross-species applicability.

פרוטוקול זה מאפשר באופן אמין התפתחות ספונטנית של מורפוגנזה תלת-ממדית של המעי במערכת מעיים-על-שבב. גישה זו משתמשת בתאי אפיתל של המעי הכלבי המתקבלים מאורגנואידי מעיים שמקורם בכלבים שנפגעו ממחלות מעי דלקתיות (IBD) (איור 1B). ניתן לצפות בהתקבצות מזדמנת של מורפוגנזה תלת-ממדית של תאי אפיתל במעי כלבים לאורך המיקרו-ערוץ לאחר 6-9 ימים של זרימה בינונית (איור 3C). ניתן לעקוב אחר שינויים מורפולוגיים אלה באמצעות טכניקות ניגודיות פאזה. במחקר זה השתמשנו באורגנואידים שמקורם בשני כלבים שאובחנו עם IBD. יש לציין כי מורפוגנזה תלת-ממדית מוצלחת נצפתה בשני שכפולים ביולוגיים, שכל אחד מהם בוצע עם שני שכפולים טכניים. ממצאי מחקר זה מספקים בסיס לחקירות עתידיות הקשורות לאורגנואידים במעיים שמקורם בתורמים אחרים של כלבים. תוצאות אלה מדגימות את הישימות והחזרתיות הפוטנציאליות של הגישה הניסויית שלנו, שדווחה בעבר בדגימות אנושיות. ממצאים אלה מספקים אישור נוסף לכך שטכנולוגיית Gut-on-a-Chip ישימה לתאי אפיתל של מעי כלבים, כפי שדווח בעבר במחקרים שהשתמשו בתאי אפיתל של מעי אנושי2.
פרוטוקול זה הראה שניתן להשתמש בצביעת אימונופלואורסצנטיות כדי להעריך את המבנה התלת-ממדי של חד-שכבות שמקורן באורגנואידים שיצרו מבנים דמויי וילוס בשבבים מיקרופלואידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי (איור 4 A,B). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לאמת את הפנוטיפים התאיים המובחנים והמאורגנים במרחב באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית. הדמיה של מורפוגנזה תלת-ממדית בתוך מעיים על שבב מספקת הזדמנות מצוינת לחקור את תגובת המארח במהלך אינטראקציות פתולוגיות שונות 14,23,31. בשילוב עם תאי אפיתל שמקורם בתורמי חולים, כפי שתואר קודם לכן בבני אדם, ניתן להשתמש בטכנולוגיה זו לבניית מודלים מותאמים אישית של מחלות מעיים13. באמצעות שילוב של דימות אימונופלואורסצנטי עם טכניקות הדמיית RNA ממוקדות כמו הכלאה פלואורסצנטית באתר, זה יכול להיות אפשרי לנתח חזותית את התעתיק והפרוטאומים של המארח בתוך מערכת מעיים על שבב.
שמירה על שלמות קרום המעי חיונית לשמירה על הומאוסטזיס המעי, ופלטפורמת Gut-on-a-Chip מספקת יתרון רב ערך בכך שהיא מאפשרת ניטור וכימות מדויקים של פונקציה חיונית זו. מדידת TEER באמצעות טכנולוגיית Gut-on-a-Chip מציעה מספר יתרונות. לדוגמה, מחקרים קודמים העריכו בהצלחה TEER תוך גידול משותף של תאי מעיים עם חיידקים לא פתוגניים ופרוביוטיים32, כמו גם בתנאי מעי דולף23. זה מאפשר לחוקרים לחקור את ההשפעה של מצבים שונים על תפקוד מחסום המעי ולזהות התערבויות פוטנציאליות לקידום בריאות המעי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig01.jpg"> איור 1: התבססות של IBD כלב שמקורו במטופל מעי על שבב. (A) אינטגרציה של אורגנואידי מעיים שמקורם במטופל ופלטפורמת Gut-on-a-Chip. ניתן לבצע ביופסיה אנדוסקופית כדי לבודד תאי קריפטה במעי כדי לפתח אורגנואידים ספציפיים לתורם. תאי אפיתל יכולים להיות מנותקים לתאים בודדים מהאורגנואידים, ואז נזרעים לתוך מעיים על שבב מבוססי PDMS ומתורבתים במיקרו-סביבה דינמית ייחודית. (B) תמונות מייצגות של קולונואידים מכלב IBD. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (C) סכמה זו מדגימה מכשיר Gut-on-a-Chip המורכב מקרום נקבובי הממוקם בין מיקרו-ערוצים עליונים ותחתונים. המיקרו-ערוץ העליון מסומן על ידי האזור הכחול, ואילו המיקרו-ערוץ התחתון מסומן על ידי האזור האדום. תאי ואקום נמצאים בכל צד של המיקרו-ערוץ, אשר מעוותים את הממברנה הנקבובית כדי לחקות תנועה פריסטלטית24. (D) התקנה של Gut-on-a-Chip לכלבים כוללת Gut-on-a-Chip מבוסס PDMS המורכב עם צינורות המונחים על תלוש כיסוי 2,24. הצינור העוקף הוא קריטי כדי למנוע הצטברות לחץ בתוך המיקרו-תעלה במהלך הטיפול (כלומר, חיבור למזרקים). אטבי קלסרים משמשים להידוק הצינור. ניתן להחדיר חומרים רגישים לנפח דרך החורים הפתוחים של השקע העליון או התחתון. ניתן להחדיר מדיום תרבית אורגנואיד על ידי חיבור המזרקים למחטי הקצה הקהות והזרימה דרך הכניסה העליונה והתחתונה. קיצורים: IBD = מחלת מעי דלקתית; PDMS = polydimethylsiloxane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig02.jpg"> איור 2: היווצרות מבנים דמויי וילוס במעי דלקתי של כלבים. תאי האפיתל המנותקים נזרעו במעי על שבב מצופה ECM. לאחר שהתאים המנותקים חוברו לקרום PDMS, החלה זרימה אפית במשך 3 ימים (D0-D3). כאשר נוצרת חד-שכבה דו-ממדית (D3), מתחילה זרימה בזולטרלית עם מתיחה תכופה (Stretching, AP ו-BL Flow). לאחר 2-3 ימים של זרימה כפולה ומתיחה של הממברנה, החד-שכבה הדו-ממדית מתחילה לפתח מורפוגנזה תלת-ממדית, ומבנים דמויי וילוס נוצרים לאחר 9 ימי תרבית (מורפוגנזה תלת-ממדית, D9-D12). קיצורים: ECM = מטריצה חוץ-תאית; PDMS = polydimethylsiloxane; AP = אפיקלי; BL = basolateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig03.jpg"> איור 3: זריעת אורגנואידים במעיים של כלבים ומורפוגנזה תלת-ממדית במעי על-שבב . (A) השלבים הניסיוניים להפעלת פני השטח של קרום נקבובי ב-Gut-on-a-Chip מבוסס PDMS. השימוש בטיפול UV / אוזון, PEI וטיפול GA בשילוב מקל על קישור צולב של אמינים הקיימים בתמיסות ECM. תהליך זה מוביל לאימוביליזציה יציבה של חלבוני ECM על הממברנה הנקבובית. (B) תמונות ניגודיות הפאזה מדגימות את המורפולוגיה של תאים מיד לאחר הזריעה (משמאל) ו-3-5 שעות לאחר הזריעה (מימין). הממברנה הנקבובית לאחר 3 שעות של זריעה מציגה אזורים דקים וכהים יותר שבהם התחברו תאים בודדים, ומדגישה את תהליך ההתקשרות. (C) תמונות ניגודיות הפאזה מתארות את המורפוגנזה התלת-ממדית של חד-שכבות מעיים בתוך מערכת Gut-on-a-Chip. חד-שכבות אלה נגזרו מכלבים שנפגעו ממחלת מעי דלקתית ותאי אורגנואיד אלה גודלו בתרבית לתקופה של 12 יום בתנאים דינמיים, שכללו זרימת נוזלים ותנועות מתיחה. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר (B,C). קיצורים: IBD = מחלת מעי דלקתית; ECM = מטריצה חוץ-תאית; PDMS = polydimethylsiloxane; PEI = פוליאתילן; GA = גלוטראלדהיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig04.jpg"> איור 4: הערכת ההתפתחות המורפולוגית התלת-ממדית ב-gut-on-a-Chip של כלבים שמקורם במטופלים . (A) הדמיה אימונופלואורסצנטית של מעי דלקתי של כלבים, המציגה תצוגה מלמעלה למטה של אפיתל תלת-ממדי מפותח במלואו לאחר 12 ימי תרבית, המוערך על-ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חלבון הצומת ההדוק (ZO-1) מוצג בצהוב; קרום גבול המברשת (F-actin) מופיע באדום; והגרעינים מוכתמים ב-DAPI ונראים כחולים. (B) הדמיה אימונופלואורסצנטית של מעי דלקתי של כלבים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם עדשה למרחקים ארוכים. כפי שניתן לראות בסכמה, מוצגת תמונה פלואורסצנטית של חתך רוחב של מבנה דמוי וילוס של אפיתל תלת-ממדי מפותח במלואו לאחר 12 ימי תרבית. בנוסף, ערימת Z מראה מבט צדדי על האפיתל התלת-ממדי, החושף היווצרות מבנים דמויי וילוס. קרום גבול המברשת (F-actin) מופיע באדום, והגרעינים מוכתמים ב-DAPI ונראים כחולים. (C) תפקוד מחסום המעי הוערך ונמדד על ידי TEER במעיים על שבבים שמקורם במטופלים. ערכי TEER יציבים הושגו ביום 5 של התרבית ב- Gut-on-a-Chip. קווי שגיאה מבטאים את ה- SEM של המדידות. ערך TEER נמדד בין שני משכפלים ביולוגיים עם שכפול טכני אחד. מוטות קנה מידה = 50 מיקרומטר (A), 25 מיקרומטר (B). קיצורים: IBD = מחלת מעי דלקתית; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; TEER = התנגדות חשמלית transepithelial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים S1: אפיון נוגדנים רב-שבטיים נגד ZO-1 בשכבות חד-שכבתיות שמקורן בקולונידים בכלבים ובמכשירי Gut-on-a-Chip. (A) צביעה אימונופלואורסצנטית של ZO-1 בצהוב עם F-actin באדום ותמונת הכיסוי שלהם. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. (B) הדמיה אימונופלואורסצנטית של ZO-1 בצהוב ב"שבבי מעיים דולפים" בוצעה בתנאים שונים, כולל גירוי עם חיידקים פרוביוטיים (LGG + ציטוקינים או VSL#3 + ציטוקינים) ובקרות ללא חיידקים ללא גירוי פרוביוטי (ציטוקינים). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. נתון זה משוכפל מתוך Min et al.23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/FigureS1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
טבלה משלימה S1: סיכום מידע על תורמי רקמות. טבלה מסכמת של גיל התורמים, מין, גזע, הערכה היסטופתולוגית וציון מדד פעילות IBD של כלבים (CIBDAI). CIBDAI היא מערכת ניקוד מספרי המשמשת להסיק חומרה קלינית ב- IBD33 של כלבים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720_SupplementTable.JoVE.Nagao%20(2).xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Application of a Canine IBD Gut-on-a-Chip Model for 3D Intestinal Morphogenesis Studies at JoVE.com

שילוב של אורגנואידים במעי הכלבי ומערכת מיקרופלואידית של מעיים על שבב מציע מודלים תרגומיים רלוונטיים למחלות מעיים אנושיות. הפרוטוקולים שהוצגו מאפשרים מורפוגנזה תלת-ממדית ומידול דינמי במבחנה של המעי, ומסייעים בפיתוח טיפולים יעילים למחלות מעיים בכלבים ובבני אדם עם One Health.

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal ...

מטרת המחקר שלנו היא ליצור שיטה לגידול מבנים תלת-ממדיים באמצעות תאי מעיים מבעלי חיים הדומים לבני אדם, במיוחד כלבים. מורפוגנזה של תאי מעיים נחקרה בעיקר באמצעות מודלים של חיות מעבדה, שהם יקרים, גוזלים זמן רב ואינם מייצגים במדויק תהליכים התפתחותיים אנושיים. יתר על כן, מודלים קונבנציונליים סטטיים של תרביות תאים דו-ממדיות חסרים את היכולת לחקות את הארגון המרחבי המורכב של ארכיטקטורת abSerial תלת-ממדית.השגת החיבור של תאים בודדים שמקורם באורגנואידים במעי על משטח PDMS מצופה ECM הציבה אתגר משמעותי. צעד מרכזי בהתמודדות עם אתגר זה הן בהבטחת ציפוי ECM אחיד באמצעות הפעלת פני השטח והן במתן אפשרות לייבוש בן לילה. השילוב של טכנולוגיית אורגנואיד כלבים שמקורו במטופל עם מורפוגנזה תלת-ממדית במבחנה מציע אפיק מבטיח לביצוע מחקר תרגומי למחלות כרוניות רב-גורמיות, בהתאם ליוזמת הבריאות האחת.הפרוטוקול למחלות מעי דלקתיות בכלבים, שעלה על שבב, מציע מודל הניתן לשכפול לרפואה השוואתית, המאפשר מחקרים על מורפוגנזה של המעי, אינטראקציות בין מיקרוביום המאכסן, זיהומים, בדיקות סקר של תרופות ופרוביוטיקה, ויש לו ישימות בין מינים.

three-dimensional-morphogenesis-canine-gut-on-chip-using-intestinal

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients

2.0K Views.  Washington State University. מטרת המחקר שלנו היא ליצור שיטה לגידול מבנים תלת-ממדיים באמצעות תאי מעיים מבעלי חיים הדומים לבני אדם, במיוחד כלבים. מורפוגנזה של תאי מעיים נחקרה בעיקר באמצעות מודלים של חיות מעבדה, שהם יקרים, גוזלים זמן רב ואינם מייצגים במדויק תהליכים התפתחותיים אנושיים. יתר על כן, מודלים קו?...

Video: Author Spotlight: פיתוח ויישום של מודל מעי דלקתי של כלבים עבור מחקרי מורפוגנזה תלת-ממדית במעיים 

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal disorders similar to humans. Overcoming the inherent limitation of three-dimensional (3D) organoids in accessing the apical surface of the intestinal epithelium has led to the generation of two-dimensional (2D) monolayer cultures, which expose the accessible luminal surface using cells derived from the organoids. The integration of these organoids and organoid-derived monolayer cultures into a microfluidic Gut-on-a-Chip system has further evolved the technology, allowing for the development of more physiologically relevant dynamic in vitro intestinal models.
In this study, we present a protocol for generating 3D morphogenesis of canine intestinal epithelium using primary intestinal tissue samples obtained from dogs affected by inflammatory bowel disease (IBD). We also outline a protocol for generating and maintaining 2D monolayer cultures and intestine-on-a-chip systems using cells derived from the 3D intestinal organoids. The protocols presented in this study serve as a foundational framework for establishing a microfluidic Gut-on-a-Chip system specifically designed for canines. By laying the groundwork for this innovative approach, we aim to expand the application of these techniques in biomedical and translational research, aligning with the principles of the One Health Initiative. By utilizing this approach, we can develop more physiologically relevant dynamic in vitro models for studying intestinal physiology in both dogs and humans. This has significant implications for biomedical and pharmaceutical applications, as it can aid in the development of more effective treatments for intestinal diseases in both species.

Integration of canine intestinal organoids and a Gut-on-a-Chip microfluidic system offers relevant translational models for human intestinal diseases. Protocols presented allow for 3D morphogenesis and dynamic in vitro modeling of the gut, aiding in the development of effective treatments for intestinal diseases in dogs and humans with One Health.