Gostaríamos de agradecer ao serviço de Medicina Interna de Pequenos Animais da WSU (Dr. Jillian Haines, Dra. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) e à Coordenadora de Estudos Clínicos da WSU VTH, Valorie Wiss, por seu apoio no recrutamento de casos e coleta de amostras de cientistas cidadãos (doadores de pacientes). Este trabalho foi apoiado em parte pelo Office of The Director, National Institutes Of Health (K01OD030515 e R21OD031903 à Y.M.A.) e pela Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (202280196 to I.N.). A Figura 1A e a Figura 3A foram criadas com BioRender.com.

Estabelecimento da morfogênese 3D em um sistema canino IBD Gut-on-a-Chip

Os autores declaram não haver qualquer conflito de interesses.

Este estudo marca a demonstração pioneira da compatibilidade dos organoides intestinais caninos com o desenvolvimento de um modelo canino IBD Gut-on-a-Chip. A integração de organoides intestinais e culturas de monocamadas derivadas de organoides em um sistema microfluídico (ou seja, sistema Gut-on-a-Chip) evoluiu ainda mais a tecnologia, permitindo a criação de modelos intestinais in vitro que mimetizam a dinâmica fisiológica e são mais representativos das condições biológicas. Em particular, uma vez que há muito poucos relatos de cultura de Gut-on-a-Chip usando organoides derivados de IBD em humanos, o estudo atual usando canino IBD-derivado Gut-on-a-Chip pode fornecer insights líderes sobre o estudo de IBD em humanos.
O desenvolvimento bem-sucedido da morfogênese 3D epitelial intestinal canina em um Gut-on-a-Chip requer atenção cuidadosa a várias etapas críticas. Primeiro, a superfície hidrofóbica dos canais microfluídicos do PDMS pode impedir a adesão da MEC e a subsequente fixação celular, necessitando da ativação superficial do PDMS antes do revestimento da MEC e da semeadura celular (ver secção 1 do protocolo). Para alcançar uma cultura estável de monocamada, a remoção do excesso de células não anexadas é crucial após a ligação celular (etapas do protocolo 4.6-4.7). Além disso, a estimulação dinâmica, como fluxo médio constante e movimento de vácuo peristáltico, é necessária para a morfogênese 3D do epitélio intestinal (etapa 5.2 do protocolo). O manuseio cuidadoso é essencial para evitar bolhas de ar no microcanal durante qualquer etapa da cultura Gut-on-a-Chip.
Se encontrar uma semeadura de células pobre no Gut-on-a-Chip, pode ser devido a um baixo número de células ou má ligação celular. Para solucionar o baixo número de células, é importante inspecionar a saúde dos organoides intestinais preparados, observando seu crescimento em Matrigel. A viabilidade celular pode ser avaliada pela coloração com azul de Trypan após a dissociação celular para garantir que não mais do que 20% das células estejam mortas. Se o número de células viáveis for insuficiente, pode-se tentar otimizar as condições do meio organoide. Outra possibilidade é a dissociação incompleta dos organoides, resultando em um excesso de aglomerados celulares maiores que 70 μm que ficam presos pelo filtro. Para resolver isso, uma opção é estender a duração da pipetagem durante a dissociação celular. Alternativamente, o tubo cônico de 15 mL pode ser agitado suavemente a cada minuto durante o tratamento com uma protease semelhante à tripsina. A má fixação celular ao Gut-on-a-Chip pode ser devido ao revestimento inadequado de ECM. Durante o processo de revestimento, é aconselhável verificar cuidadosamente a presença de bolhas de ar e evitar sua formação, adicionando suavemente mais solução de revestimento conforme necessário. A superlotação das células e a falha em lavar as células não anexadas podem resultar em uma monocamada inicial insuficiente. Nesse caso, uma pulsação leve pode ser aplicada ao empurrar o êmbolo da seringa. Essas etapas de solução de problemas podem ajudar a identificar e resolver problemas durante o processo de cultura Gut-on-a-Chip.
Embora esta plataforma Gut-on-a-Chip permita a criação de camadas epiteliais 3D onduladas, reconhecemos a necessidade de complexidade biológica adicional para replicar o microambiente intestinal completamente. É crucial considerar as interações entre células epiteliais e mesenquimais, a deposição de MEC para regeneração 3D e a presença de características cript-vilosidades que estabeleçam um nicho adequado de células-tronco. As células estromais, como os fibroblastos, desempenham papel vital na produção de proteínas da MEC e na regulação da morfogênese intestinal34,35,36. A inclusão de células mesenquimais neste modelo tem o potencial de aumentar tanto a morfogênese quanto a eficiência da ligação celular. As camadas endoteliais, que englobam a vasculatura capilar e os vasos linfáticos, desempenham papel crucial no controle do transporte molecular e do recrutamento de células imunes37,38. A inclusão de células imunes derivadas do paciente poderia ser essencial na modelagem de doenças intestinais, pois permite a demonstração da interação entre imunidade inata e adaptativa, bem como o estabelecimento de imunidade tecido-específica39. Após a conclusão da morfogênese 3D em Gut-on-a-Chip, o meio de cultura organoide pode ser modificado para um meio de diferenciação organoide. Esta pode ser uma abordagem viável para induzir diferenciação celular adicional, dependendo dos objetivos experimentais.
A obtenção de imagens da microarquitetura 3D in situ é um desafio devido à longa distância de trabalho necessária, que pode ser superada com um objetivo de longa distância. Além disso, os métodos de microfabricação e colagem camada por camada dificultam o acesso às camadas superiores para exame com MEV. Para o projeto atual do Gut-on-a-Chip, é necessária uma bomba de seringa por microdispositivo Gut-on-a-Chip, ocupando o espaço da incubadora de CO2 e evitando experimentos em larga escala. Inovações são necessárias para aumentar a escalabilidade para uma plataforma amigável e triagem de alto rendimento.
Esses protocolos atuais permitem o desenvolvimento espontâneo de camadas epiteliais 3D in vitro, superando as limitações dos organoides 3D tradicionais, monocamadas 2D e sistemas estáticos de cultura de microdispositivos. Este microambiente intestinal dinâmico in vitro pode ser controlado pela introdução de co-cultura de diversos tipos celulares. Estudos prévios exploraram métodos de manipulação do microambiente Gut-on-a-Chip, incluindo a co-cultura do microbioma intestinal14,23 e células mononucleares periféricas30. Esse microambiente reconstituído tem inúmeras aplicações potenciais, incluindo testes de drogas, estudos mecanísticos fundamentais e modelagem de doenças. O microambiente reconstruído possui potencial significativo para uma ampla gama de aplicações, tais como testes de fármacos 23,40,41 e modelagem de doenças 12,13,14,30, bem como investigações mecanicistas fundamentais da morfogênese intestinal 42. Uma variedade de ensaios pode ser realizada por meio da coleta de sobrenadantes para avaliação de metabólitos 43, pela coleta de células para exame genômico 2,32 ou pelo exame visual das células usando corantes de células vivas ou fixação para posterior imagem de imunofluorescência 23,44.
Este estudo apresenta um protocolo reprodutível para o desenvolvimento da morfogênese 3D das camadas epiteliais intestinais caninas em uma plataforma Gut-on-a-Chip. A estrutura epitelial 3D resultante fornece uma representação mais realista do microambiente intestinal, que tem imenso potencial para aplicações em vários estudos biomédicos. Ao utilizar essa arquitetura intestinal, podemos conduzir mais pesquisas translacionais e potencialmente produzir resultados promissores.

A morfogênese epitelial intestinal tem sido amplamente estudada por meio de modelos animais de laboratório, que são dispendiosos, demorados e não representam com precisão os processos de desenvolvimentohumano1. Além disso, os modelos convencionais estáticos de cultura de células 2D não têm a capacidade de mimetizar a complexa organização espacial de uma arquitetura epitelial 3D2. Como resultado, há a necessidade de um protocolo para induzir morfogênese 3D in vitro usando células epiteliais intestinais de modelos animais relevantes para humanos para avançar nossa compreensão da arquitetura epitelial intestinal.
Cães de companhia desenvolveram anatomia intestinal e composições do microbioma que são notavelmente semelhantes aos humanos devido ao seu ambiente e dieta compartilhados durante a domesticação3. Além dessa semelhança, tanto humanos quanto cães compartilham várias morbidades crônicas que se acredita serem atribuídas à saúde intestinal. Cães, assim como humanos, podem desenvolver espontaneamente condições crônicas como obesidade, disfunção cognitiva, diabetes mellitus, doença inflamatória intestinal (DII) e adenocarcinoma colorretal4,5,6,7,8,9,10. Apesar do desenvolvimento e uso de células epiteliais humanas e murinas em estudos prévios de Gut-on-a-Chip 2,11,12,13,14, o epitélio intestinal canino não tem sido utilizado até o momento. Nossa nova abordagem, utilizando epitélio organoide intestinal canino em um sistema de cultura dinâmico com morfogênese epitelial 3D, tem implicações significativas para a medicina canina e humana.
Avanços recentes na cultura de organoides intestinais levaram ao estabelecimento da cultura de organoides intestinais caninos15. Esse sistema de cultura envolve a cultura de células-tronco intestinais sob condicionamento morfogênico definido, resultando em um modelo 3D com propriedades auto-renovadoras derivadas de células-troncoadultas16. No entanto, a realização de ensaios de transporte ou coculturas hospedeiro-microbioma apresenta dificuldades com esse modelo 3D devido à natureza fechada do lúmen intestinal17. Para resolver isso, pesquisadores geraram uma monocamada 2D derivada de organoides intestinais, permitindo a exposição da superfície luminal18,19. No entanto, tanto organoides 3D quanto monocamadas 2D são mantidos sob condições estáticas, que não refletem com precisão a biomecânica in vivo do microambiente intestinal. A combinação da tecnologia de organoides caninos derivados de pacientes com morfogênese 3D in vitro apresenta uma oportunidade para a pesquisa translacional em doenças crônicas multifatoriais. Essa abordagem permite que os pesquisadores desenvolvam tratamentos mais eficazes beneficiando humanos e cães e avancem ainda mais a pesquisa translacional, alinhando-se com a One Health Initiative, que é uma abordagem colaborativa que reconhece a interconexão da saúde humana, animal e ambiental. Promove a cooperação interdisciplinar para enfrentar desafios complexos de saúde e alcançar resultados de saúde ideais para todos. Ao compreender as interdependências entre humanos, animais e ecossistemas, a iniciativa visa mitigar os riscos de doenças infecciosas emergentes, degradação ambiental e outras preocupações de saúde compartilhadas20,21,22.
Este protocolo descreve métodos abrangentes para a cultura de células epiteliais intestinais caninas obtidas de organoides de pacientes em um microdispositivo Gut-on-a-Chip com uma membrana porosa baseada em polidimetilsiloxano (PDMS). Estabelecer a morfogênese epitelial 3D integrando organoides intestinais caninos e esta tecnologia Gut-on-a-Chip nos permite estudar como o intestino se desenvolve e mantém sua organização celular e nicho de células-tronco. Esta plataforma oferece uma oportunidade valiosa para investigar o impacto das comunidades do microbioma na saúde intestinal e entender como essas comunidades geram metabólitos microbianos que contribuem para a fisiopatologia intestinal14,23. Esses avanços agora podem ser estendidos a amostras intestinais caninas, fornecendo aos pesquisadores oportunidades de explorar a intrincada relação entre o microbioma intestinal e a fisiologia do hospedeiro. Isso abre caminhos para obter informações valiosas sobre os mecanismos subjacentes da fisiopatologia intestinal e compreender o papel potencial dos metabólitos microbianos na saúde canina e humana, bem como em várias condições de doenças. O protocolo utilizado para o Gut-on-a-Chip canino é reprodutível, tornando-o um modelo experimental adequado para medicina comparativa, uma vez que esta abordagem permite a investigação de interações hospedeiro-microbioma, infecções por patógenos e efeitos terapêuticos baseados em probióticos em cães e humanos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>2 mM, glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT30009CI</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids and organoid medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>9094360</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td>2.5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells engineered to secrete Noggin&#160;</td>
			<td>Baylor College of Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 MAX Media supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1x&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin Conditioned Medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>10% vol/vol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin1 (Rspo1) cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td>Rspo1 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin-1 Conditioned Medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20% vol/vol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td>&#160;10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>StemCellTechnologies</td>
			<td>72308</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15 ]-Gastrin I human&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td>x250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG H&#38;L labeled with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>x1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>x50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>x1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Glutaraldehyde Aqueous 50%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine) solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408700-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>87V Industrial Multimeter</td>
			<td>Fluke Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C170i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-103-0519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexCell FX-5000 Tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase-contrast microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8-X inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>SP8-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>model no. BS-8000 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 1 mL sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/ozone generator</td>
			<td>Jelight Company</td>
			<td>model no. 30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X imaging software&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional morphogenesis in canine gut-on-a-chip using intestinal organoids derived from inflammatory bowel disease patients

Os intestinos caninos possuem semelhanças em anatomia, microbiologia e fisiologia com os dos humanos, e os cães desenvolvem naturalmente distúrbios intestinais espontâneos semelhantes aos humanos. A superação da limitação inerente dos organoides tridimensionais (3D) no acesso à superfície apical do epitélio intestinal levou à geração de culturas bidimensionais (2D) monocamadas, que expõem a superfície luminal acessível usando células derivadas dos organoides. A integração desses organoides e culturas de monocamadas derivadas de organoides em um sistema microfluídico Gut-on-a-Chip evoluiu ainda mais a tecnologia, permitindo o desenvolvimento de modelos intestinais dinâmicos in vitro fisiologicamente mais relevantes.
Neste estudo, apresentamos um protocolo para geração de morfogênese 3D do epitélio intestinal canino utilizando amostras de tecido intestinal primário obtidas de cães acometidos por doença inflamatória intestinal (DII). Também delineamos um protocolo para geração e manutenção de culturas de monocamada 2D e sistemas intestino-em-um-chip usando células derivadas dos organoides intestinais 3D. Os protocolos apresentados neste estudo servem como uma estrutura fundamental para o estabelecimento de um sistema microfluídico Gut-on-a-Chip projetado especificamente para caninos. Ao lançar as bases para essa abordagem inovadora, pretendemos expandir a aplicação dessas técnicas na pesquisa biomédica e translacional, alinhando-se aos princípios da One Health Initiative. Utilizando esta abordagem, podemos desenvolver modelos dinâmicos in vitro fisiologicamente mais relevantes para o estudo da fisiologia intestinal em cães e humanos. Isso tem implicações significativas para aplicações biomédicas e farmacêuticas, pois pode auxiliar no desenvolvimento de tratamentos mais eficazes para doenças intestinais em ambas as espécies.

Intestinal epithelial morphogenesis has been largely studied through laboratory animal models, which are costly, time-consuming, and do not accurately represent human developmental processes1. Furthermore, conventional static 2D cell culture models lack the ability to mimic the complex spatial organization of a 3D epithelial architecture2. As a result, there is a need for a protocol to induce in vitro 3D morphogenesis using intestinal epithelial cells from human-relevant animal models to advance our understanding of gut epithelial architecture.
Companion dogs have developed intestinal anatomy and microbiome compositions that are remarkably similar to humans due to their shared environment and diet during domestication3. In addition to this similarity, both humans and dogs share various chronic morbidities that are thought to be attributed to intestinal health. Dogs, like humans, can spontaneously develop chronic conditions such as obesity, cognitive dysfunction, diabetes mellitus, inflammatory bowel disease (IBD), and colorectal adenocarcinoma4,5,6,7,8,9,10. Despite the development and use of human and murine epithelial cells in previous Gut-on-a-Chip studies2,11,12,13,14, canine intestinal epithelium has not been utilized until now. Our novel approach, utilizing canine intestinal organoid epithelium in a dynamic culture system with a 3D epithelial morphogenesis, has significant implications for both canine and human medicine.
Recent advancements in intestinal organoid culture have led to the establishment of canine intestinal organoid culture15. This culture system involves culturing intestinal stem cells under defined morphogen conditioning, resulting in a 3D model with self-renewing properties derived from adult stem cells16. However, conducting transport assays or host-microbiome cocultures poses difficulties with this 3D model because of the enclosed nature of the intestinal lumen17. To address this, researchers have generated a 2D monolayer derived from intestinal organoids, allowing for exposure of the luminal surface18,19. However, both 3D organoids and 2D monolayers are maintained under static conditions, which do not accurately reflect the in vivo biomechanics of the intestinal microenvironment. Combining patient-derived canine organoids technology with in vitro 3D morphogenesis presents an opportunity for translational research into chronic multifactorial diseases. This approach enables researchers to develop more effective treatments benefiting both humans and dogs and further advance translational research, aligning with the One Health Initiative, which is a collaborative approach that recognizes the interconnectedness of human, animal, and environmental health. It promotes interdisciplinary cooperation to address complex health challenges and achieve optimal health outcomes for all. By understanding the interdependencies between humans, animals, and ecosystems, the initiative aims to mitigate risks from emerging infectious diseases, environmental degradation, and other shared health concerns20,21,22.
This protocol outlines comprehensive methods for culturing canine intestinal epithelial cells obtained from patient organoids on a Gut-on-a-Chip microdevice with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membrane. Establishing the 3D epithelial morphogenesis by integrating canine intestinal organoids and this Gut-on-a-Chip technology enables us to study how the gut develops and maintains its cellular organization and stem cell niche. This platform offers a valuable opportunity to investigate the impact of microbiome communities on gut health and understand how these communities generate microbial metabolites that contribute to intestinal pathophysiology14,23. These advancements can now be extended to canine intestinal samples, providing researchers with opportunities to explore the intricate relationship between the gut microbiome and host physiology. This opens up avenues for gaining valuable insights into the underlying mechanisms of intestinal pathophysiology and understanding the potential role of microbial metabolites in both canine and human health, as well as various disease conditions. The protocol used for canine Gut-on-a-Chip is reproducible, making it a suitable experimental model for comparative medicine, as this approach enables investigation of host-microbiome interactions, pathogen infections, and probiotic-based therapeutic effects in both dogs and humans.

Autor em destaque: Desenvolvimento e aplicação de um modelo canino de intestino em chip de DII para estudos de morfogênese intestinal 3D 

Morfogênese Tridimensional em Intestino Canino Utilizando Organoides Intestinais Derivados de Pacientes com Doença Inflamatória Intestinal

Este protocolo facilita de forma confiável o desenvolvimento espontâneo da morfogênese intestinal 3D em um sistema Gut-on-a-Chip. Esta abordagem utiliza células epiteliais intestinais caninas obtidas de organoides intestinais derivados de cães acometidos por doença inflamatória intestinal (DII) (Figura 1B). Ocasionalmente agrupamentos da morfogênese 3D de células epiteliais intestinais caninas podem ser observados em todo o microcanal após 6-9 dias de fluxo médio (Figura 3C). Essas alterações morfológicas podem ser monitoradas usando técnicas de contraste de fase. Neste estudo, foram utilizados organoides derivados de dois cães com diagnóstico de DII. Notavelmente, a morfogênese 3D bem-sucedida foi observada em duas réplicas biológicas, cada uma das quais foi realizada com duas réplicas técnicas. Os resultados deste estudo fornecem uma base para futuras investigações envolvendo organoides intestinais derivados de outros doadores caninos. Estes resultados demonstram a potencial aplicabilidade e repetibilidade de nossa abordagem experimental, que já foi relatada em amostras humanas. Esses achados confirmam que a tecnologia Gut-on-a-Chip é aplicável às células epiteliais intestinais caninas, conforme relatado anteriormente com os estudos utilizando células epiteliais intestinais humanas2.
Este protocolo mostrou que a coloração por imunofluorescência pode ser usada para avaliar a estrutura 3D de monocamadas derivadas de organoides que formaram estruturas vilosidades em chips microfluídicos usando microscopia de fluorescência convencional (Figura 4 A,B). Este protocolo pode ser adaptado para validar os fenótipos celulares diferenciados e espacialmente organizados através da coloração por imunofluorescência. A visualização de uma morfogênese 3D dentro de um Gut-on-a-Chip fornece uma excelente oportunidade para investigar a resposta do hospedeiro durante várias interações patológicas 14,23,31. Quando combinada com células epiteliais derivadas de pacientes doadores, como previamente descrito em humanos, essa tecnologia pode ser utilizada na construção de modelos personalizados de doençasintestinais13. Através da integração de imagens de imunofluorescência com técnicas de visualização de RNA direcionadas, como hibridização in situ por fluorescência, pode ser viável analisar visualmente os transcriptomas e proteomas do hospedeiro dentro de um sistema Gut-on-a-Chip.
Preservar a integridade da membrana intestinal é vital para manter a homeostase intestinal, e a plataforma Gut-on-a-Chip fornece uma vantagem valiosa ao permitir o monitoramento preciso e a quantificação dessa função crucial. A medição de TEER usando a tecnologia Gut-on-a-Chip oferece vários benefícios. Por exemplo, estudos anteriores avaliaram com sucesso o TEER ao co-cultivar células intestinais com bactérias não patogênicas e probióticas32, bem como sob condições de intestino permeável23. Isso permite que os pesquisadores estudem o impacto de diferentes condições na função da barreira intestinal e identifiquem potenciais intervenções para promover a saúde intestinal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig01.jpg"> Figura 1: Estabelecimento do IBD canino derivado do paciente Gut-on-a-Chip. (A) Integração dos organoides intestinais derivados do paciente e da plataforma Gut-on-a-Chip. A biópsia endoscópica pode ser realizada para isolar células das criptas intestinais para desenvolver organoides intestinais específicos do doador. As células epiteliais podem ser dissociadas em células únicas dos organoides, depois semeadas em um Gut-on-a-Chip baseado em PDMS e cultivadas em um microambiente dinâmico único. (B) Imagens representativas de colonóides de um cão IBD. Barra de escala = 100 μm. (C) Este esquema ilustra um dispositivo Gut-on-a-Chip que consiste em uma membrana porosa colocada entre os microcanais superior e inferior. O microcanal superior é indicado pela área azul, enquanto o microcanal inferior é indicado pela área vermelha. Câmaras de vácuo estão presentes em cada lado do microcanal, que deformam a membrana porosa para mimetizar o movimento peristáltico24. (D) Uma configuração de Gut-on-a-Chip canino inclui um Gut-on-a-Chip baseado em PDMS montado com tubulação que é colocada em uma tampa 2,24. A tubulação de bypass é fundamental para evitar o acúmulo de pressão dentro do microcanal durante o manuseio (ou seja, conexão com seringas). Clipes de ligante são usados para prender a tubulação. Os materiais sensíveis ao volume podem ser infundidos através dos orifícios abertos da saída superior ou inferior. O meio de cultura organoide pode ser infundido conectando-se as seringas às agulhas rombas e o fluxo através da entrada superior e inferior. Abreviações: DII = doença inflamatória intestinal; PDMS = polidimetilsiloxano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig02.jpg"> Figura 2: Formação de estruturas vilosidades em IBD canino Gut-on-a-Chip. As células epiteliais dissociadas foram semeadas em um Gut-on-a-Chip revestido com MEC. Uma vez que as células dissociadas estavam aderidas à membrana do PDMS, o fluxo apical foi iniciado por 3 dias (D0-D3). Quando uma monocamada 2D confluente é formada (D3), inicia-se o fluxo basolateral com alongamentos frequentes (Stretching, AP e BL Flow). Após 2-3 dias de fluxo duplo e estiramento da membrana, a monocamada 2D começa a desenvolver morfogênese 3D, e estruturas semelhantes a vilosidades são formadas após 9 dias de cultura (morfogênese 3D, D9-D12). Abreviações: MEC = matriz extracelular; PDMS = polidimetilsiloxano; AP = apical; BL = basolateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig03.jpg"> Figura 3: Semeadura organoide intestinal canina e morfogênese 3D em um Gut-on-a-Chip. (A) As etapas experimentais para a ativação superficial de uma membrana porosa em um Gut-on-a-Chip baseado em PDMS. A utilização do tratamento UV/Ozônio, PEI e tratamento com AG em conjunto facilita a reticulação das aminas presentes nas soluções de MEC. Esse processo leva à imobilização estável das proteínas da MEC na membrana porosa. (B) As imagens de contraste de fase demonstram as morfologias das células imediatamente após a semeadura (esquerda) e 3-5 h após a semeadura (direita). A membrana porosa após 3 h de semeadura exibe áreas mais finas e escuras onde células únicas se fixaram, destacando o processo de fixação. (C) As imagens de contraste de fase retratam a morfogênese 3D das monocamadas intestinais dentro de um sistema Gut-on-a-Chip. Essas monocamadas foram derivadas de cães afetados com DII e essas células organoides foram cultivadas por um período de 12 dias sob condições dinâmicas, que envolveram fluxo de fluido e movimentos de alongamento. Barras de escala = 50 μm (B,C). Abreviações: DII = doença inflamatória intestinal; MEC = matriz extracelular; PDMS = polidimetilsiloxano; PEI = polietilenimina; GA = glutaraldeído. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig04.jpg"> Figura 4: Avaliação do desenvolvimento morfológico 3D em Gut-on-a-Chip canino derivado do paciente. (A) Imagem de imunofluorescência de um IBD canino Gut-on-a-Chip, mostrando uma visão de cima para baixo de um epitélio 3D totalmente desenvolvido após 12 dias de cultura, que é avaliado por um microscópio de fluorescência. A proteína tight junction (ZO-1) é visualizada em amarelo; a membrana da borda em escova (F-actina) aparece em vermelho; e os núcleos são corados com DAPI e aparecem azuis. (B) Imagem de imunofluorescência de um IBD canino Gut-on-a-Chip usando um microscópio confocal com lente de longa distância. Como mostrado no esquema, uma imagem fluorescente de uma seção transversal de uma estrutura semelhante a vilosidades de um epitélio 3D totalmente desenvolvido após 12 dias de cultura é mostrada. Além disso, o empilhamento Z mostra uma visão lateral do epitélio 3D, que revela a formação de estruturas semelhantes a vilosidades. A membrana da borda em escova (F-actina) aparece em vermelho, e os núcleos são corados com DAPI e aparecem em azul. (C) A função da barreira intestinal foi avaliada e medida pelo TEER em Gut-on-a-Chips caninos derivados do paciente. Valores estáveis de TEER foram alcançados no Dia 5 de cultura em Gut-on-a-Chip. As barras de erro expressam o MEV das medições. O valor de TEER foi medido entre duas réplicas biológicas com uma réplica técnica. Barras de escala = 50 μm (A), 25 μm (B). Abreviações: DII = doença inflamatória intestinal; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TEER = resistência elétrica transepitelial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura Suplementar S1: Caracterização do anticorpo policlonal anti-ZO-1 em monocamadas derivadas do colonóide canino e em dispositivos Gut-on-a-Chip. (A) Coloração por imunofluorescência de ZO-1 em amarelo com F-actina em vermelho e sua imagem de sobreposição. Barra de escala = 25 μm. (B) A visualização por imunofluorescência de ZO-1 em amarelo em 'Leaky Gut Chips' foi conduzida sob várias condições, incluindo estimulação com bactérias probióticas (LGG + Citocinas ou VSL#3 + Citocinas) e controles livres de germes sem estimulação probiótica (Citocinas). Barra de escala = 50 μm. Esse dado é reproduzido de Min et al.23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/FigureS1.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Quadro Complementar S1: Resumo das informações sobre os dadores de tecidos. Uma tabela resumo da idade, sexo, raça, avaliação histopatológica e pontuação do índice de atividade da DII canina (CIBDAI) dos doadores. O CIBDAI é um sistema de pontuação numérica utilizado para inferir a gravidade clínica em DII canina33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720_SupplementTable.JoVE.Nagao%20(2).xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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A integração de organoides intestinais caninos e um sistema microfluídico Gut-on-a-Chip oferece modelos translacionais relevantes para doenças intestinais humanas. Os protocolos apresentados permitem a morfogênese 3D e a modelagem dinâmica in vitro do intestino, auxiliando no desenvolvimento de tratamentos eficazes para doenças intestinais em cães e humanos com o One Health.

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal ...

Nosso objetivo de pesquisa é criar um método para o cultivo de estruturas 3D usando células intestinais de animais semelhantes aos humanos, especificamente cães. A morfogênese celular intestinal tem sido amplamente estudada através de modelos animais de laboratório, que são caros, demorados e não representam com precisão os processos de desenvolvimento humano. Além disso, os modelos convencionais estáticos de cultura de células 2D não têm a capacidade de imitar a complexa organização espacial de uma arquitetura abSerial 3D.Conseguir a fixação de células individuais derivadas de organoides intestinais na superfície do PDMS revestida com ECM representou um desafio significativo. Um passo fundamental para enfrentar esse desafio é garantir um revestimento ECM uniforme por meio da ativação da superfície e permitir que ele seque durante a noite. A integração da tecnologia de organoides caninos derivados de pacientes com a morfogênese 3D in vitro oferece um caminho promissor para a realização de pesquisas translacionais em doenças crônicas multifatoriais, alinhando-se com a One Health Initiative.O protocolo para DII canina, obtido em um chip, oferece um modelo replicável para medicina comparada, possibilitando estudos sobre morfogênese intestinal, interações hospedeiro-microbioma, infecções, rastreios de fármacos e probióticos, e tem aplicabilidade entre espécies.

three-dimensional-morphogenesis-canine-gut-on-chip-using-intestinal

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients

2.0K visualizações.  Washington State University. Nosso objetivo de pesquisa é criar um método para o cultivo de estruturas 3D usando células intestinais de animais semelhantes aos humanos, especificamente cães. A morfogênese celular intestinal tem sido amplamente estudada através de modelos animais de laboratório, que são caros, demorados e não representam com precisão os processos de desenvolvimento humano. Além disso, os modelos convencionais estáticos de cultura de células 2D não têm a capacidade de imitar a complexa organ...

Vídeo: Autor em destaque: Desenvolvimento e aplicação de um modelo canino de intestino em chip de DII para estudos de morfogênese intestinal 3D 

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal disorders similar to humans. Overcoming the inherent limitation of three-dimensional (3D) organoids in accessing the apical surface of the intestinal epithelium has led to the generation of two-dimensional (2D) monolayer cultures, which expose the accessible luminal surface using cells derived from the organoids. The integration of these organoids and organoid-derived monolayer cultures into a microfluidic Gut-on-a-Chip system has further evolved the technology, allowing for the development of more physiologically relevant dynamic in vitro intestinal models.
In this study, we present a protocol for generating 3D morphogenesis of canine intestinal epithelium using primary intestinal tissue samples obtained from dogs affected by inflammatory bowel disease (IBD). We also outline a protocol for generating and maintaining 2D monolayer cultures and intestine-on-a-chip systems using cells derived from the 3D intestinal organoids. The protocols presented in this study serve as a foundational framework for establishing a microfluidic Gut-on-a-Chip system specifically designed for canines. By laying the groundwork for this innovative approach, we aim to expand the application of these techniques in biomedical and translational research, aligning with the principles of the One Health Initiative. By utilizing this approach, we can develop more physiologically relevant dynamic in vitro models for studying intestinal physiology in both dogs and humans. This has significant implications for biomedical and pharmaceutical applications, as it can aid in the development of more effective treatments for intestinal diseases in both species.

Integration of canine intestinal organoids and a Gut-on-a-Chip microfluidic system offers relevant translational models for human intestinal diseases. Protocols presented allow for 3D morphogenesis and dynamic in vitro modeling of the gut, aiding in the development of effective treatments for intestinal diseases in dogs and humans with One Health.