Nos gustaría agradecer al servicio de Medicina Interna de Pequeños Animales de la WSU (Dra. Jillian Haines, Dra. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) y a la Coordinadora de Estudios Clínicos de WSU VTH, Valorie Wiss, por su apoyo en el reclutamiento de casos y la recolección de muestras de científicos ciudadanos (pacientes donantes). Este trabajo fue apoyado en parte por la Oficina del Director de los Institutos Nacionales de Salud (K01OD030515 y R21OD031903 a Y.M.A.) y el Programa de Desafío en el Extranjero de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia en el Extranjero para Jóvenes Investigadores (202280196 a I.N.). La Figura 1A y la Figura 3A se crearon con BioRender.com.

Establecimiento de la morfogénesis 3D en un sistema de intestino en un chip de EII canina

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Este estudio marca la demostración pionera de la compatibilidad de los organoides intestinales caninos con el desarrollo de un modelo canino de EII Gut-on-a-Chip. La integración de organoides intestinales y cultivos monocapa derivados de organoides en un sistema microfluídico (es decir, el sistema Gut-on-a-Chip) ha evolucionado aún más la tecnología, lo que ha permitido la creación de modelos intestinales in vitro que imitan de cerca la dinámica fisiológica y son más representativos de las condiciones biológicas. En particular, dado que hay muy pocos informes de cultivo de Gut-on-a-Chip utilizando organoides derivados de la EII en humanos, el estudio actual que utiliza Gut-on-a-Chip derivado de la EII canina puede proporcionar información líder en el estudio de la EII en humanos.
El desarrollo exitoso de la morfogénesis 3D del epitelio intestinal canino en un Gut-on-a-Chip requiere una cuidadosa atención a varios pasos críticos. En primer lugar, la superficie hidrofóbica de los canales microfluídicos de PDMS puede impedir la adhesión de la MEC y la posterior unión celular, lo que requiere la activación de la superficie de la MDP antes del recubrimiento de la MEC y la siembra de células (ver sección 1 del protocolo). Para lograr un cultivo monocapa estable, la eliminación del exceso de células no adheridas es crucial después de la unión celular (pasos del protocolo 4.6-4.7). Además, la estimulación dinámica, como el flujo medio constante y el movimiento de vacío peristáltico, es necesaria para la morfogénesis 3D del epitelio intestinal (paso 5.2 del protocolo). El manejo cuidadoso es esencial para evitar burbujas de aire en el microcanal durante cualquier paso del cultivo Gut-on-a-Chip.
Si se encuentra con una mala siembra de células en el Gut-on-a-Chip, podría deberse a un bajo número de células o a una mala adhesión celular. Para solucionar problemas de bajo número de células, es importante inspeccionar la salud de los organoides intestinales preparados observando su crecimiento en Matrigel. La viabilidad celular se puede evaluar mediante la tinción con azul de tripano después de la disociación celular para garantizar que no más del 20% de las células estén muertas. Si el número de células viables es insuficiente, se puede intentar optimizar las condiciones del medio organoide. Otra posibilidad es la disociación incompleta de los organoides, lo que da lugar a un exceso de grupos celulares de más de 70 μm que quedan atrapados por el filtro. Para resolver esto, una opción es extender la duración del pipeteo durante la disociación celular. Alternativamente, el tubo cónico de 15 ml se puede agitar suavemente cada minuto mientras se somete al tratamiento con una proteasa similar a la tripsina. Una mala adhesión de la célula al Gut-on-a-Chip puede deberse a un recubrimiento inadecuado de la ECM. Durante el proceso de recubrimiento, se recomienda verificar cuidadosamente la presencia de burbujas de aire y evitar su formación agregando suavemente más solución de recubrimiento según sea necesario. El hacinamiento de las células y la falta de lavado de las células no adheridas pueden dar lugar a una monocapa inicial insuficiente. En tal caso, se puede aplicar una pulsación leve al empujar el émbolo de la jeringa. Estos pasos de solución de problemas pueden ayudar a identificar y abordar problemas durante el proceso de cultivo de Gut-on-a-Chip.
Si bien esta plataforma Gut-on-a-Chip permite la creación de capas epiteliales 3D onduladas, reconocemos la necesidad de una complejidad biológica adicional para replicar completamente el microambiente intestinal. Es crucial considerar las interacciones entre las células epiteliales y mesenquimales, el depósito de MEC para la regeneración 3D y la presencia de características de cripta-vellosidades que establecen un nicho adecuado de células madre. Las células estromalas, como los fibroblastos, desempeñan un papel vital en la producción de proteínas de la MEC y en la regulación de la morfogénesis intestinal34,35,36. La inclusión de células mesenquimales en este modelo tiene el potencial de mejorar tanto la morfogénesis como la eficiencia de la unión celular. Las capas endoteliales, que abarcan la vasculatura capilar y los vasos linfáticos, desempeñan un papel crucial en el control del transporte molecular y el reclutamiento de células inmunitarias37,38. La inclusión de células inmunitarias derivadas del paciente podría ser esencial en la modelización de enfermedades intestinales, ya que permite demostrar la interacción entre la inmunidad innata y la adaptativa, así como el establecimiento de una inmunidad específica de tejido39. Tras la finalización de la morfogénesis 3D en Gut-on-a-Chip, el medio de cultivo de organoides puede modificarse a un medio de diferenciación de organoides. Este puede ser un enfoque viable para inducir una diferenciación celular adicional, dependiendo de los objetivos experimentales.
Obtener imágenes de la microarquitectura 3D in situ es un desafío debido a la larga distancia de trabajo requerida, que se puede superar con un objetivo de larga distancia. Además, los métodos de microfabricación y unión capa por capa dificultan el acceso a las capas superiores para su examen con SEM. Para el diseño actual de Gut-on-a-Chip, se necesita una bomba de jeringa por microdispositivo Gut-on-a-Chip, lo que ocupa espacio en la incubadora deCO2 y evita experimentos a gran escala. Se necesitan innovaciones para aumentar la escalabilidad de una plataforma fácil de usar y un cribado de alto rendimiento.
Estos protocolos actuales permiten el desarrollo espontáneo de capas epiteliales 3D in vitro, superando las limitaciones de los organoides 3D tradicionales, las monocapas 2D y los sistemas de cultivo estático de microdispositivos. Este microambiente intestinal dinámico in vitro puede controlarse mediante la introducción del cocultivo de diversos tipos de células. Estudios anteriores han explorado métodos para manipular el microambiente Gut-on-a-Chip, incluyendo el cocultivo del microbioma intestinal14,23 y las células mononucleares periféricas30. Este microambiente reconstituido tiene numerosas aplicaciones potenciales, incluidas las pruebas de fármacos, los estudios mecanicistas fundamentales y el modelado de enfermedades. El microambiente reconstruido tiene un potencial significativo para una amplia gama de aplicaciones, como las pruebas de drogas 23,40,41 y el modelado de enfermedades 12,13,14,30, así como las investigaciones mecanicistas fundamentales de la morfogénesis intestinal 42. Se puede realizar una variedad de ensayos, ya sea mediante la recolección de sobrenadantes para la evaluación de metabolitos 43, mediante la recolección de células para el examen genómico 2,32, o mediante el examen visual de las células utilizando colorantes de células vivas o la fijación para la posterior obtención de imágenes de inmunofluorescencia 23,44.
Este estudio presenta un protocolo reproducible para el desarrollo de la morfogénesis 3D de las capas epiteliales intestinales caninas en una plataforma Gut-on-a-Chip. La estructura epitelial 3D resultante proporciona una representación más realista del microambiente intestinal, que tiene un inmenso potencial para aplicaciones en diversos estudios biomédicos. Al utilizar esta arquitectura intestinal, podemos llevar a cabo más investigación traslacional y potencialmente producir resultados prometedores.

La morfogénesis epitelial intestinal se ha estudiado en gran medida a través de modelos animales de laboratorio, que son costosos, requieren mucho tiempo y no representan con precisión los procesos de desarrollo humano1. Además, los modelos de cultivo celular estáticos 2D convencionales carecen de la capacidad de imitar la compleja organización espacial de una arquitectura epitelial 3D2. Como resultado, existe la necesidad de un protocolo para inducir la morfogénesis 3D in vitro utilizando células epiteliales intestinales de modelos animales relevantes para humanos para avanzar en nuestra comprensión de la arquitectura epitelial intestinal.
Los perros de compañía han desarrollado una anatomía intestinal y una composición del microbioma que son notablemente similares a las de los humanos debido a su entorno y dieta compartidosdurante la domesticación. Además de esta similitud, tanto los humanos como los perros comparten varias morbilidades crónicas que se cree que se atribuyen a la salud intestinal. Los perros, al igual que los humanos, pueden desarrollar espontáneamente afecciones crónicas como obesidad, disfunción cognitiva, diabetes mellitus, enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y adenocarcinoma colorrectal 4,5,6,7,8,9,10. A pesar del desarrollo y uso de células epiteliales humanas y murinas en estudios previos de Gut-on-a-Chip 2,11,12,13,14, el epitelio intestinal canino no se ha utilizado hasta ahora. Nuestro novedoso enfoque, que utiliza epitelio organoide intestinal canino en un sistema de cultivo dinámico con una morfogénesis epitelial en 3D, tiene implicaciones significativas tanto para la medicina canina como para la humana.
Los avances recientes en el cultivo de organoides intestinales han llevado al establecimiento del cultivo de organoides intestinales caninos15. Este sistema de cultivo consiste en el cultivo de células madre intestinales bajo un condicionamiento de morfógenos definido, lo que da como resultado un modelo 3D con propiedades autorrenovadoras derivadas de células madre adultas16. Sin embargo, la realización de ensayos de transporte o cocultivos huésped-microbioma plantea dificultades con este modelo 3D debido a la naturaleza cerrada de la luz intestinal17. Para abordar esto, los investigadores han generado una monocapa 2D derivada de organoides intestinales, lo que permite la exposición de la superficie luminal18,19. Sin embargo, tanto los organoides 3D como las monocapas 2D se mantienen en condiciones estáticas, que no reflejan con precisión la biomecánica in vivo del microambiente intestinal. La combinación de la tecnología de organoides caninos derivados de pacientes con la morfogénesis 3D in vitro presenta una oportunidad para la investigación traslacional en enfermedades crónicas multifactoriales. Este enfoque permite a los investigadores desarrollar tratamientos más eficaces que beneficien tanto a los humanos como a los perros y avanzar aún más en la investigación traslacional, alineándose con la Iniciativa One Health, que es un enfoque colaborativo que reconoce la interconexión de la salud humana, animal y ambiental. Promueve la cooperación interdisciplinaria para abordar desafíos de salud complejos y lograr resultados de salud óptimos para todos. Al comprender las interdependencias entre los seres humanos, los animales y los ecosistemas, la iniciativa tiene como objetivo mitigar los riesgos de las enfermedades infecciosas emergentes, la degradación ambiental y otros problemas de salud compartidos20,21,22.
Este protocolo describe métodos integrales para cultivar células epiteliales intestinales caninas obtenidas de organoides de pacientes en un microdispositivo Gut-on-a-Chip con una membrana porosa basada en polidimetilsiloxano (PDMS). Establecer la morfogénesis epitelial 3D mediante la integración de organoides intestinales caninos y esta tecnología Gut-on-a-Chip nos permite estudiar cómo el intestino desarrolla y mantiene su organización celular y su nicho de células madre. Esta plataforma ofrece una valiosa oportunidad para investigar el impacto de las comunidades del microbioma en la salud intestinal y comprender cómo estas comunidades generan metabolitos microbianos que contribuyen a la fisiopatología intestinal 14,23. Estos avances ahora se pueden extender a muestras intestinales caninas, lo que brinda a los investigadores la oportunidad de explorar la intrincada relación entre el microbioma intestinal y la fisiología del huésped. Esto abre vías para obtener información valiosa sobre los mecanismos subyacentes de la fisiopatología intestinal y comprender el papel potencial de los metabolitos microbianos en la salud canina y humana, así como en diversas enfermedades. El protocolo utilizado para el Gut-on-a-Chip canino es reproducible, lo que lo convierte en un modelo experimental adecuado para la medicina comparativa, ya que este enfoque permite investigar las interacciones entre el huésped y el microbioma, las infecciones por patógenos y los efectos terapéuticos basados en probióticos tanto en perros como en humanos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>2 mM, glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT30009CI</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids and organoid medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>9094360</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td>2.5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells engineered to secrete Noggin&#160;</td>
			<td>Baylor College of Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 MAX Media supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1x&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin Conditioned Medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>10% vol/vol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin1 (Rspo1) cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td>Rspo1 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin-1 Conditioned Medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20% vol/vol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td>&#160;10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>StemCellTechnologies</td>
			<td>72308</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15 ]-Gastrin I human&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td>x250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG H&#38;L labeled with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>x1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>x50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>x1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Glutaraldehyde Aqueous 50%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine) solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408700-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>87V Industrial Multimeter</td>
			<td>Fluke Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C170i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-103-0519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexCell FX-5000 Tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase-contrast microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8-X inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>SP8-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>model no. BS-8000 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 1 mL sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/ozone generator</td>
			<td>Jelight Company</td>
			<td>model no. 30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X imaging software&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional morphogenesis in canine gut-on-a-chip using intestinal organoids derived from inflammatory bowel disease patients

Los intestinos caninos poseen similitudes en anatomía, microbiología y fisiología con los de los humanos, y los perros desarrollan naturalmente trastornos intestinales espontáneos similares a los humanos. La superación de la limitación inherente de los organoides tridimensionales (3D) para acceder a la superficie apical del epitelio intestinal ha llevado a la generación de cultivos monocapa bidimensionales (2D), que exponen la superficie luminal accesible utilizando células derivadas de los organoides. La integración de estos organoides y cultivos monocapa derivados de organoides en un sistema microfluídico Gut-on-a-Chip ha evolucionado aún más la tecnología, lo que ha permitido el desarrollo de modelos dinámicos in vitro in vitro más relevantes desde el punto de vista fisiológico.
En este estudio, presentamos un protocolo para generar morfogénesis 3D del epitelio intestinal canino utilizando muestras de tejido intestinal primario obtenidas de perros afectados por enfermedad inflamatoria intestinal (EII). También describimos un protocolo para generar y mantener cultivos monocapa 2D y sistemas de intestino en un chip utilizando células derivadas de organoides intestinales 3D. Los protocolos presentados en este estudio sirven como marco fundamental para establecer un sistema microfluídico Gut-on-a-Chip diseñado específicamente para caninos. Al sentar las bases de este enfoque innovador, nuestro objetivo es ampliar la aplicación de estas técnicas en la investigación biomédica y traslacional, alineándonos con los principios de la iniciativa One Health. Al utilizar este enfoque, podemos desarrollar modelos dinámicos in vitro más relevantes desde el punto de vista fisiológico para estudiar la fisiología intestinal tanto en perros como en humanos. Esto tiene implicaciones significativas para las aplicaciones biomédicas y farmacéuticas, ya que puede ayudar en el desarrollo de tratamientos más efectivos para las enfermedades intestinales en ambas especies.

Intestinal epithelial morphogenesis has been largely studied through laboratory animal models, which are costly, time-consuming, and do not accurately represent human developmental processes1. Furthermore, conventional static 2D cell culture models lack the ability to mimic the complex spatial organization of a 3D epithelial architecture2. As a result, there is a need for a protocol to induce in vitro 3D morphogenesis using intestinal epithelial cells from human-relevant animal models to advance our understanding of gut epithelial architecture.
Companion dogs have developed intestinal anatomy and microbiome compositions that are remarkably similar to humans due to their shared environment and diet during domestication3. In addition to this similarity, both humans and dogs share various chronic morbidities that are thought to be attributed to intestinal health. Dogs, like humans, can spontaneously develop chronic conditions such as obesity, cognitive dysfunction, diabetes mellitus, inflammatory bowel disease (IBD), and colorectal adenocarcinoma4,5,6,7,8,9,10. Despite the development and use of human and murine epithelial cells in previous Gut-on-a-Chip studies2,11,12,13,14, canine intestinal epithelium has not been utilized until now. Our novel approach, utilizing canine intestinal organoid epithelium in a dynamic culture system with a 3D epithelial morphogenesis, has significant implications for both canine and human medicine.
Recent advancements in intestinal organoid culture have led to the establishment of canine intestinal organoid culture15. This culture system involves culturing intestinal stem cells under defined morphogen conditioning, resulting in a 3D model with self-renewing properties derived from adult stem cells16. However, conducting transport assays or host-microbiome cocultures poses difficulties with this 3D model because of the enclosed nature of the intestinal lumen17. To address this, researchers have generated a 2D monolayer derived from intestinal organoids, allowing for exposure of the luminal surface18,19. However, both 3D organoids and 2D monolayers are maintained under static conditions, which do not accurately reflect the in vivo biomechanics of the intestinal microenvironment. Combining patient-derived canine organoids technology with in vitro 3D morphogenesis presents an opportunity for translational research into chronic multifactorial diseases. This approach enables researchers to develop more effective treatments benefiting both humans and dogs and further advance translational research, aligning with the One Health Initiative, which is a collaborative approach that recognizes the interconnectedness of human, animal, and environmental health. It promotes interdisciplinary cooperation to address complex health challenges and achieve optimal health outcomes for all. By understanding the interdependencies between humans, animals, and ecosystems, the initiative aims to mitigate risks from emerging infectious diseases, environmental degradation, and other shared health concerns20,21,22.
This protocol outlines comprehensive methods for culturing canine intestinal epithelial cells obtained from patient organoids on a Gut-on-a-Chip microdevice with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membrane. Establishing the 3D epithelial morphogenesis by integrating canine intestinal organoids and this Gut-on-a-Chip technology enables us to study how the gut develops and maintains its cellular organization and stem cell niche. This platform offers a valuable opportunity to investigate the impact of microbiome communities on gut health and understand how these communities generate microbial metabolites that contribute to intestinal pathophysiology14,23. These advancements can now be extended to canine intestinal samples, providing researchers with opportunities to explore the intricate relationship between the gut microbiome and host physiology. This opens up avenues for gaining valuable insights into the underlying mechanisms of intestinal pathophysiology and understanding the potential role of microbial metabolites in both canine and human health, as well as various disease conditions. The protocol used for canine Gut-on-a-Chip is reproducible, making it a suitable experimental model for comparative medicine, as this approach enables investigation of host-microbiome interactions, pathogen infections, and probiotic-based therapeutic effects in both dogs and humans.

Autor destacado: Desarrollo y aplicación de un modelo de intestino en un chip de EII canina para estudios 3D de morfogénesis intestinal 

Morfogénesis tridimensional en el intestino canino en un chip utilizando organoides intestinales derivados de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal

Este protocolo facilita de forma fiable el desarrollo espontáneo de la morfogénesis intestinal en 3D en un sistema Gut-on-a-Chip. Este enfoque utiliza células epiteliales intestinales caninas obtenidas de organoides intestinales derivados de perros afectados por enfermedad inflamatoria intestinal (EII) (Figura 1B). Se puede observar un agrupamiento ocasional de la morfogénesis 3D de las células epiteliales intestinales caninas a lo largo del microcanal después de 6-9 días de flujo medio (Figura 3C). Estos cambios morfológicos pueden ser monitorizados mediante técnicas de contraste de fases. En este estudio, utilizamos organoides derivados de dos perros diagnosticados con EII. En particular, se observó una morfogénesis 3D exitosa en dos réplicas biológicas, cada una de las cuales se realizó con dos réplicas técnicas. Los hallazgos de este estudio proporcionan una base para futuras investigaciones que involucren organoides intestinales derivados de otros donantes caninos. Estos resultados demuestran la potencial aplicabilidad y repetibilidad de nuestro enfoque experimental, que se ha informado previamente en muestras humanas. Estos hallazgos proporcionan una confirmación adicional de que la tecnología Gut-on-a-Chip es aplicable a las células epiteliales intestinales caninas, como se informó anteriormente con los estudios que utilizan células epiteliales intestinaleshumanas.
Este protocolo demostró que la tinción de inmunofluorescencia se puede utilizar para evaluar la estructura 3D de monocapas derivadas de organoides que han formado estructuras similares a vellosidades en chips microfluídicos utilizando microscopía de fluorescencia convencional (Figura 4 A, B). Este protocolo se puede adaptar para validar los fenotipos celulares diferenciados y organizados espacialmente mediante tinción de inmunofluorescencia. La visualización de una morfogénesis 3D dentro de un Gut-on-a-Chip proporciona una excelente oportunidad para investigar la respuesta del huésped durante diversas interacciones patológicas 14,23,31. Cuando se combina con células epiteliales derivadas de pacientes donantes, como se describió previamente en humanos, esta tecnología puede utilizarse para construir modelos personalizados de enfermedades intestinales13. A través de la integración de imágenes de inmunofluorescencia con técnicas de visualización de ARN dirigido, como la hibridación fluorescente in situ, puede ser factible analizar visualmente los transcriptomas y proteomas del huésped dentro de un sistema Gut-on-a-Chip.
Preservar la integridad de la membrana intestinal es vital para mantener la homeostasis intestinal, y la plataforma Gut-on-a-Chip proporciona una valiosa ventaja al permitir un seguimiento y una cuantificación precisos de esta función crucial. La medición de TEER mediante la tecnología Gut-on-a-Chip ofrece varias ventajas. Por ejemplo, estudios anteriores han evaluado con éxito el TEER mientras se cocultivan células intestinales con bacterias no patógenas y probióticas32, así como en condiciones de intestino permeable23. Esto permite a los investigadores estudiar el impacto de diferentes afecciones en la función de la barrera intestinal e identificar posibles intervenciones para promover la salud intestinal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig01.jpg"> Figura 1: Establecimiento de la EII canina derivada del paciente Gut-on-a-Chip. (A) Integración de los organoides intestinales derivados del paciente y la plataforma Gut-on-a-Chip. La biopsia endoscópica se puede realizar para aislar las células de la cripta intestinal y desarrollar organoides intestinales específicos del donante. Las células epiteliales se pueden disociar en células individuales de los organoides, luego sembrarse en un Gut-on-a-Chip basado en PDMS y cultivarse en un microambiente dinámico único. (B) Imágenes representativas de colonoides de un perro con EII. Barra de escala = 100 μm. (C) Este esquema ilustra un dispositivo Gut-on-a-Chip que consiste en una membrana porosa colocada entre los microcanales superior e inferior. El microcanal superior se indica con el área azul, mientras que el microcanal inferior se indica con el área roja. A cada lado del microcanal hay cámaras de vacío que deforman la membrana porosa para imitar el movimiento peristáltico24. (D) Una configuración de Gut-on-a-Chip canino incluye un Gut-on-a-Chip basado en PDMS ensamblado con tubos que se colocan en un cubreobjetos 2,24. El tubo de derivación es fundamental para evitar la acumulación de presión dentro del microcanal durante la manipulación (es decir, la conexión a las jeringas). Los clips de aglutinante se utilizan para sujetar el tubo. Los materiales sensibles al volumen se pueden infundir a través de los orificios abiertos de la salida superior o inferior. El medio de cultivo de organoides se puede infundir conectando las jeringas a las agujas de extremo romo y el flujo a través de la entrada superior e inferior. Abreviaturas: EII = enfermedad inflamatoria intestinal; PDMS = polidimetilsiloxano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig02.jpg"> Figura 2: Formación de estructuras en forma de vellosidades en el intestino en un chip canino de EII. Las células epiteliales disociadas se sembraron en un Gut-on-a-Chip recubierto de ECM. Una vez que las células disociadas se unieron a la membrana de PDMS, se inició el flujo apical durante 3 días (D0-D3). Cuando se forma una monocapa 2D confluente (D3), se inicia el flujo basolateral con estiramientos frecuentes (Stretching, AP y BL Flow). Después de 2-3 días de flujo dual y estiramiento de la membrana, la monocapa 2D comienza a desarrollar morfogénesis 3D y se forman estructuras similares a vellosidades después de 9 días de cultivo (morfogénesis 3D, D9-D12). Abreviaturas: ECM = matriz extracelular; PDMS = polidimetilsiloxano; PA = apical; BL = basolateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig03.jpg"> Figura 3: Siembra de organoides intestinales caninos y morfogénesis 3D en un Gut-on-a-Chip. (A) Los pasos experimentales para la activación superficial de una membrana porosa en un Gut-on-a-Chip basado en PDMS. La utilización del tratamiento UV/Ozono, el tratamiento PEI y GA en conjunto facilita la reticulación de las aminas presentes en las soluciones de ECM. Este proceso conduce a la inmovilización estable de las proteínas de la MEC en la membrana porosa. (B) Las imágenes de contraste de fase demuestran las morfologías de las células inmediatamente después de la siembra (izquierda) y 3-5 h después de la siembra (derecha). La membrana porosa después de 3 h de siembra muestra áreas más delgadas y oscuras donde se han adherido células individuales, destacando el proceso de adhesión. (C) Las imágenes de contraste de fase representan la morfogénesis 3D de las monocapas intestinales dentro de un sistema Gut-on-a-Chip. Estas monocapas se derivaron de perros afectados con EII y estas células organoides se cultivaron durante un período de 12 días en condiciones dinámicas, que involucraron flujo de fluidos y movimientos de estiramiento. Barras de escala = 50 μm (B,C). Abreviaturas: EII = enfermedad inflamatoria intestinal; MEC = matriz extracelular; PDMS = polidimetilsiloxano; PEI = polietilenimina; GA = glutaraldehído. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig04.jpg"> Figura 4: Evaluación del desarrollo morfológico 3D en el Gut-on-a-Chip canino derivado del paciente . (A) Imágenes de inmunofluorescencia de un intestino en un chip de EII canina, que muestra una vista de arriba hacia abajo de un epitelio 3D completamente desarrollado después de 12 días de cultivo, que se evalúa con un microscopio de fluorescencia. La proteína de unión estrecha (ZO-1) se visualiza en amarillo; la membrana del borde del cepillo (F-actina) aparece en rojo; y los núcleos se tiñen con DAPI y aparecen azules. (B) Imágenes de inmunofluorescencia de un intestino en un chip de EII canina utilizando un microscopio confocal con una lente de larga distancia. Como se muestra en el esquema, se muestra una imagen fluorescente de una sección transversal de una estructura similar a una vellosidad de un epitelio 3D completamente desarrollado después de 12 días de cultivo. Además, el apilamiento en Z muestra una vista lateral del epitelio 3D, que revela la formación de estructuras en forma de vellosidades. La membrana del borde en cepillo (F-actina) aparece en rojo, y los núcleos se tiñen con DAPI y aparecen azules. (C) La función de la barrera intestinal se evaluó y midió mediante TEER en Gut-on-a-Chips caninos derivados de pacientes. Se alcanzaron valores estables de TEER en el día 5 de cultivo en Gut-on-a-Chip. Las barras de error expresan el SEM de las mediciones. El valor de TEER se midió entre dos réplicas biológicas con una réplica técnica. Barras de escala = 50 μm (A), 25 μm (B). Abreviaturas: EII = enfermedad inflamatoria intestinal; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TEER = resistencia eléctrica transepitelial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria S1: Caracterización del anticuerpo policlonal anti-ZO-1 en monocapas derivadas de colonoides caninos y en dispositivos Gut-on-a-Chip. (A) Tinción por inmunofluorescencia de ZO-1 en amarillo con F-actina en rojo y su imagen superpuesta. Barra de escala = 25 μm. (B) La visualización por inmunofluorescencia de ZO-1 en amarillo en 'Leaky Gut Chips' se llevó a cabo en diversas condiciones, incluida la estimulación con bacterias probióticas (LGG + Citoquinas o VSL # 3 + Citoquinas) y controles libres de gérmenes sin estimulación probiótica (Citoquinas). Barra de escala = 50 μm. Esta figura se reproduce de Min et al.23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/FigureS1.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria S1: Resumen de la información de los donantes de tejidos. Tabla resumen de la edad, el sexo, la raza, la evaluación histopatológica y la puntuación del índice de actividad de la EII canina (CIBDAI) de los donantes. El CIBDAI es un sistema de puntuación numérica utilizado para inferir la gravedad clínica en la EII canina33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720_SupplementTable.JoVE.Nagao%20(2).xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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La integración de organoides intestinales caninos y un sistema microfluídico Gut-on-a-Chip ofrece modelos traslacionales relevantes para las enfermedades intestinales humanas. Los protocolos presentados permiten la morfogénesis en 3D y el modelado dinámico in vitro del intestino, lo que ayuda en el desarrollo de tratamientos efectivos para enfermedades intestinales en perros y humanos con One Health.

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal ...

Nuestro objetivo de investigación es crear un método para cultivar estructuras 3D utilizando células intestinales de animales similares a los humanos, específicamente perros. La morfogénesis celular intestinal se ha estudiado en gran medida a través de modelos animales de laboratorio, que son costosos, requieren mucho tiempo y no representan con precisión los procesos de desarrollo humano. Además, los modelos de cultivo celular estáticos 2D convencionales carecen de la capacidad de imitar la compleja organización espacial de una arquitectura abSerial 3D.Lograr la unión de células individuales derivadas de organoides intestinales en la superficie de PDMS recubierta de ECM ha planteado un desafío importante. Un paso fundamental para abordar este desafío es garantizar un recubrimiento ECM uniforme a través de la activación de la superficie y permitir que se seque durante la noche. La integración de la tecnología de organoides caninos derivados de pacientes con la morfogénesis 3D in vitro ofrece una vía prometedora para llevar a cabo investigaciones traslacionales en enfermedades crónicas multifactoriales, alineándose con la iniciativa One Health.El protocolo para la EII canina, que se puso en un chip, ofrece un modelo replicable para la medicina comparativa, lo que permite estudios sobre la morfogénesis intestinal, las interacciones huésped-microbioma, las infecciones, las pruebas de detección de fármacos y probióticos, y tiene aplicabilidad entre especies.

three-dimensional-morphogenesis-canine-gut-on-chip-using-intestinal

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients

2.0K vistas.  Washington State University. Nuestro objetivo de investigación es crear un método para cultivar estructuras 3D utilizando células intestinales de animales similares a los humanos, específicamente perros. La morfogénesis celular intestinal se ha estudiado en gran medida a través de modelos animales de laboratorio, que son costosos, requieren mucho tiempo y no representan con precisión los procesos de desarrollo humano. Además, los modelos de cultivo celular estáticos 2D convencionales carecen de la capacidad de i...

Video: Autor destacado: Desarrollo y aplicación de un modelo de intestino en un chip de EII canina para estudios 3D de morfogénesis intestinal 

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal disorders similar to humans. Overcoming the inherent limitation of three-dimensional (3D) organoids in accessing the apical surface of the intestinal epithelium has led to the generation of two-dimensional (2D) monolayer cultures, which expose the accessible luminal surface using cells derived from the organoids. The integration of these organoids and organoid-derived monolayer cultures into a microfluidic Gut-on-a-Chip system has further evolved the technology, allowing for the development of more physiologically relevant dynamic in vitro intestinal models.
In this study, we present a protocol for generating 3D morphogenesis of canine intestinal epithelium using primary intestinal tissue samples obtained from dogs affected by inflammatory bowel disease (IBD). We also outline a protocol for generating and maintaining 2D monolayer cultures and intestine-on-a-chip systems using cells derived from the 3D intestinal organoids. The protocols presented in this study serve as a foundational framework for establishing a microfluidic Gut-on-a-Chip system specifically designed for canines. By laying the groundwork for this innovative approach, we aim to expand the application of these techniques in biomedical and translational research, aligning with the principles of the One Health Initiative. By utilizing this approach, we can develop more physiologically relevant dynamic in vitro models for studying intestinal physiology in both dogs and humans. This has significant implications for biomedical and pharmaceutical applications, as it can aid in the development of more effective treatments for intestinal diseases in both species.

Integration of canine intestinal organoids and a Gut-on-a-Chip microfluidic system offers relevant translational models for human intestinal diseases. Protocols presented allow for 3D morphogenesis and dynamic in vitro modeling of the gut, aiding in the development of effective treatments for intestinal diseases in dogs and humans with One Health.