ברצוננו להודות למתקן הגנומיקה הפונקציונלית של סטנפורד (SFGF), במיוחד לדהננג'אי וואג וג'ון קולר, ול-10x Genomics על עזרתם במיטוב הניסויים שלנו. ברצוננו גם להודות לד"ר ג'ורג' פולטסיידס, מוניקה דואה, ברנדן ויסר ובירן לי על עזרתם בהשגת דגימות מטופלים. ברצוננו להודות לארט ולאיליין טיילור, קרן רנץ, וורן וג'ודי קפלן על תמיכתם הנדיבה במאמצי המחקר שלנו. מקורות המימון כוללים מענקי NIH 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), קרן גולדמן זאקס (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), הקרן לחקר הסרטן ע"ש דיימון ראניון (D.D., M.T.L.), קרן גאן/אוליבייה, המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה, קרן סטיינהרט/ריד ומעבדת הייגי לרפואה רגנרטיבית בילדים. הריצוף הושג באמצעות מכונות שנרכשו בקרנות NIH (S10OD025212, S10OD018220 ו- 1S10OD01058001A1).

דגימות סרטן הלבלב האנושי (אדנוקרצינומה של צינור הלבלב) נרכשו על פי פרוטוקול שאושר על ידי IRB במעבדה שלנו. התקבלה הסכמה מדעת של המטופלים לאיסוף רקמות. הרקמה הועברה מחדר הניתוח למעבדה ולאחר מכן טופלה באופן הבא.
1. דיסוציאציה רקמות (עיכול)
<ol><li>הכן את מאגר Digest (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>השג את הרקמה המעניינת בהקדם האפשרי לאחר כריתת הגידול והעביר את הדגימה במאגר מרווה (DMEM F-12 עם ~ 5% נסיוב בקר עוברי) או 1x PBS על קרח.</li>
	<li>טחנו את הרקמה באמצעות מלקחיים נקיים ומספריים ב-3-5 מ"ל של חיץ Digest בצלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ (איור 2A).</li>
	<li>מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור חרוטי של 50 מ"ל ומנתקים ב~10 מ"ל של חיץ Digest למשך 30 דקות ב-37°C באמצעות אמבט מים עם פונקציית רעד או תסיסה יבשה.</li>
	<li>הסר מן התסיסה להרוות עם ~ 20 מ"ל של מדיום מרווה. סנן את התמיסה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי נקי.</li>
	<li>אספו את כל הרקמה המוצקה שנותרה מהמסננת (טחנו מחדש את חתיכות הרקמה הנותרות במידת הצורך), והניחו ב~10 מ"ל של חיץ Digest טרי למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של 37°C עם תסיסה. חזור על הפעולה עד שכל רקמת הגידול מנותקת.</li>
	<li>תרחיף תאי הבריכה מתעלים ומסננים דרך 70 מיקרומטר ואחריו מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי נקי על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן decant supernatant.</li>
</ol>2. שימור בהקפאה
<ol><li>לשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של הגלולה ב 1 מ"ל של 1x PBS.</li>
	<li>העבר את תרחיף התא (~ 1-10 מיליון תאים / צינור להקפאה אופטימלית) לקריביאל של 1.5 מ"ל על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן decant supernatant.</li>
	<li>השהה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של תמיסת במבנקר, העבר לקריביאל של 1.5 או 2 מ"ל (איור 2B), והקפיא באמצעות מיכל הקפאה בקצב קירור של -1°C/min (המכיל 100% אלכוהול איזופרופיל) ב-80°C-, או העבירו לחנקן נוזלי אם צפוי אחסון ארוך טווח של הדגימה.</li>
</ol>3. בידוד גרעינים
<ol><li>הפשירו במהירות את ההקפאה של תרחיף התאים והניחו אותו על קרח רטוב.</li>
	<li>העבירו את מתלה התאים המופשר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל ומלאו את הבקבוקון לתמיסת 2 מ"ל ב-1x PBS כדי לשטוף את התאים.</li>
	<li>השיגו ספירת תאים ידנית באמצעות המוציטומטר כדי להעריך הן את כמות התאים והן את איכותם (איור 2C).</li>
	<li>צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן בעדינות decarant supernatant באמצעות קצות פיפטה קטנים יותר ויותר כדי להשאיר מאחור גלולה יבשה ולשמור אותו על קרח.<ol><li>השתמש ברוטור דלי נדנדה עבור כל שלבי הצנטריפוגה. לתפוקת תאים מרבית, הניחו את הצינורות בצנטריפוגה כשהציר פונה החוצה ולאחר מכן דקאנט כשקצה הפיפטה מכוון לצד הנגדי של הצינור (איור 2D). הערה: כדי לנטרל את הסופרנטנט, השתמש בקצוות פיפטה קטנים יותר ויותר כדי להסיר נוזל כדי להגביל את ההפרעה של הגלולה תוך הגדלת נפח הנוזל decanted. אסטרטגיה זו מועילה במיוחד בהמשך הפרוטוקול לאחר מיצוי גרעינים מכיוון שכדורית הגרעינים בדרך כלל אינה נראית לעין.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו 1x מאגר ליזה של תאים, מאגר דילול ליזה של תאים ומאגר שטיפה (איור 3A) בהתאם לפרוטוקול שפורסם עם השינויים הבאים (ראו טבלה 1, טבלת חומרים): הערה: הניחו את הדיגיטונין על גוש חימום בטמפרטורה של 65°C לפני השימוש כדי להמיס את המשקע (איור 3B). פעולה זו נמשכת בדרך כלל כ-10 דקות.</li>
	<li>הכינו את מאגר הליזה של התאים 0.1x על ידי שילוב של 100 μL של 1x Cell Lysis Buffer ו-900 μL של Cell Lysis Dilution Buffer, פיפטה עדינה לערבוב והניחו אותה על קרח.</li>
	<li>יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-100 μL של חיץ ליזיס תאי 0.1x מקורר ולערבב פיפטה עדינה פי 5.</li>
	<li>דגרו על קרח במשך 3 דקות (איור 3C).</li>
	<li>הוסיפו 1 מ"ל של Wash Buffer צונן ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב בעדינות פי 5.</li>
	<li>צנטריפוגה כדי להניע את הגרעינים ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, בעדינות decant supernatant לגלולה יבשה, ולשמור על קרח. הערה: אם מספר התא ההתחלתי נמוך (100,000-200,000 תאים), בצע את שלבי הליזה והשטיפה של התא בצינור PCR של 200 מיקרוליטר במקום בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל כדי להקטין את שטח הפנים של הצינור ולמזער הפסדים. במקרה זה, כוונן את עוצמת הקול של מאגר הכביסה כלפי מטה כדי להתאים לנפח הצינור הקטן יותר.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.9-3.10 2x עבור שלוש כביסות בסך הכל.</li>
	<li>ספור ידנית את הגרעינים באמצעות שקופית המוציטומטר מתחת למיקרוסקופ. השתמש בצבע כחול טריפאן אם תרצה כדי לספק ניגודיות לצפייה בגרעינים וכדי לעזור להבחין בין גרעינים לתאים שלא עברו ניתוח.</li>
	<li>הכינו את מאגר הגרעינים 1x לפי הפרוטוקול שפורסם: מלאי מאגר גרעינים 20x, 1 mM DTT, 1 U/μL RNase Inhibitor במים נטולי נוקלאז ושמרו על קרח (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>השהה מחדש את כדורית הגרעינים במאגר גרעינים 1x בהתבסס על שחזור גרעינים ממוקד מטרה. הערה: אם הריכוז גבוה מספיק, יש לשאוף להתאוששות ממוקדת של 10,000 או מעט גבוה יותר בשלב זה (3,230-8,060 גרעינים/μL) בעת קביעת נפח התרחיף ההתחלתי, בהתחשב באובדן הנפח הצפוי של 25 μL והירידה של 20% בריכוז עם סינון (שלב 3.15).</li>
	<li>העבירו בעדינות את נפח הגרעינים המרחפים מחדש דרך מסננת פיפטה של 40 מיקרומטר והניחו את הגרעינים על קרח (איור 3D).</li>
	<li>ספרו מחדש את הגרעינים (איור 4A-C). דללו את הפתרון הסופי עוד יותר עם Nuclei Buffer במידת הצורך.</li>
	<li>העבירו את הגרעינים על קרח והמשיכו מיד בלכידת גרעינים לפי פרוטוקולים שפורסמו.</li>
</ol>

בידוד גרעינים לריצוף מולטיומי בדגימת גידול מוצק

<ol>
	<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+and+spatial+transcriptomics+reveal+cancer-associated+fibroblasts+in+glioblastoma+with+protumoral+effects.">Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects.</a> J Clin Invest. 133 (5), e147087 (2023).</li><li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+advancing+our+understanding+of+cancer-associated+fibroblasts.">A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts.</a> Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).</li><li>Foster, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomic+analysis+reveals+conservation+of+cancer-associated+fibroblast+phenotypes+across+species+and+tissue+of+origin.">Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin.</a> Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).</li><li>Hasan, S., Buechler, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+in+a+name?+An+emerging+framework+for+cancer-associated+fibroblasts,+myofibroblasts,+and+fibroblasts.">What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts.</a> Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).</li><li>. Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022)</li><li>. Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022)</li><li>Januszyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+diabetic+and+non-diabetic+foot+ulcers+using+single-cell+RNA-sequencing.">Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing.</a> Micromachines (Basel). 11 (9), 815 (2020).</li><li>Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+relationship+of+wound+healing+and+tumor+stroma.">The evolving relationship of wound healing and tumor stroma.</a> JCI Insight. 3 (18), e99911 (2018).</li><li>Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+isolation+of+multiple+brain+cell+types+for+omics+interrogation.">Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).</li><li>Foster, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+spatial+multiomics+reveals+fibroblast+fate+during+tissue+repair.">Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118 (2021).</li><li>Leiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+isolation+from+adult+mouse+kidney+for+single-nucleus+RNA-sequencing.">Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing.</a> J Vis Exp. (175), (2021).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+isolation+from+fresh+frozen+brain+tumors+for+single-nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq.">Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> J Vis Exp. (162), e61542 (2020).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

התרת הסבך של אוכלוסיות התאים ההטרוגניות הקיימות במיקרו-סביבה של הגידול היא תחום פעיל של התמקדות בביולוגיה של סרטן. באופן דומה, רקמות מורכבות קיימות בפתולוגיות שפירות כגון ריפוי פצעים ופיברוזיס. ריצוף Multiome התגלה ככלי רב עוצמה המאפשר רכישה של נתוני scRNA ו- ATAC-seq מזווגים של תאים זהים. פרוטוקול ...

ככל שהידע שלנו על ביולוגיה של הגידול גדל, החשיבות של ניתוח תאים הטרוגניים על פני מיקרו-סביבה של הגידול גדלה גם היא 1,2. היכולת לרכוש RNA חד-תאי והבדיקה לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם נתוני ריצוף (ATAC-sequencing) מאותו תא בצורה זוגית (ריצוף מולטיום) מספקת התקדמות משמעותית לקראת מטרה זו 3,4. עם זאת, ניסויים אלה יקרים וגוזלים זמן, ואיכות וההשפעה של הנתונים המתקבלים תלויים מאוד באיכות תנאי הניסוי והחומרים. פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד גרעינים פורסמו 5,6. רקמות טריות והטרוגניות דורשות אופטימיזציה של פרוטוקול מכיוון שתאים שבודדו טריים מדגימות גידול מוצקות הם שבירים יותר מאלה שבודדו משורות תאים.
שיקול נוסף הוא שעבור גידולים מוצקים, דגימות כירורגיות לרוב אינן זמינות מחדר הניתוח עד מאוחר ביום. ככזה, זה בדרך כלל לא ריאלי להמשיך ישירות מרכישת דגימה ללכידת גרעינים ללא שלב שימור בהקפאה. מניסיוננו, הקפאת תרחיף חד-תאי מניבה גרעינים באיכות הגבוהה ביותר (ולא רקמה שלמה קפואה בהבזק או שיטות שימור אחרות). זה נכון במיוחד עבור סוגי רקמות אנזימטיות עם תוכן RNase גבוה כגון הלבלב.
תנאי עיכול רקמות צריכים גם להיות מתוכננים כדי למקסם את תפוקת התאים מבלי להקריב איכות7. בהקשר של סוגי גידולים מוצקים עם מטריצות דסמופלסטיות צפופות8, יש לפרק בעדינות את המטריצה החוץ תאית לשחרור תאים. בנוסף, מאחר שסוגי התאים המבודדים הם הטרוגניים, יש להתאים את התנאים לתמיכה באוכלוסיית התאים הכוללת. דגימות סרטן הלבלב האנושי (אדנוקרצינומה של צינור הלבלב) משמשות בפרוטוקול המתואר. סרטן הלבלב מייצג סוג גידול דסמופלסטי מאוד, אשר מבשר רקמות ותאים דביקים יחסית. יתר על כן, מכיוון שדגימות גידול הלבלב הזמינות למחקר נוטות להיות קטנות יחסית, נעשים מאמצים למקסם את כמות התאים שנלכדים.
בידוד גרעינים דורש את האופטימיזציה הרבה ביותר במונחים של תנאי ליזה התא ועיתוי, כמו גם סוגים ויחסים מגיבים. גם הטיפול בגרעינים במהלך הבידוד דורש זהירות רבה. במאמר זה אנו מתארים את הניסיון שלנו במיטוב בידוד גרעיני עבור פלטפורמת ריצוף מולטי-ome 10x Genomics מרקמת גידול מוצקה (איור 1). אנו מספקים המלצות לעיכול רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים (אם רוצים) ובידוד גרעיני.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100, 70, and 40 &#956;m Falcon cell strainers&#160;</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Genomics Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker&#160;</td>
			<td>Wako, Fisher Scientitic</td>
			<td>NC9582225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>499609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Collagenase Type IV)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BN2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS006330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11320082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmi 40 &#956;m&#160; Pipette Tip Cell Strainer&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAH136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi GentleMACSTM digest kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Cryo &#34;Mr. Frosty&#34; Freezing Container</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonident P40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 188</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3335399001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>85113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized nuclei isolation from fresh and frozen solid tumor specimens for multiome sequencing

ריצוף מולטיום, המספק RNA חד-תאי זהה/מזווג והבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם נתוני ריצוף (ATAC-sequencing), מייצג פריצת דרך ביכולתנו להבחין בהטרוגניות של תאי הגידול - מוקד עיקרי של מחקר סרטן תרגומי בשלב זה. עם זאת, איכות נתוני הרצף הנרכשים באמצעות מודל מתקדם זה תלויה מאוד באיכות חומר הקלט. 
תנאי העיכול צריכים להיות אופטימליים כדי למקסם את תפוקת התאים מבלי להקריב את האיכות. זה מאתגר במיוחד בהקשר של גידולים מוצקים עם מטריצות דסמופלסטיות צפופות שיש לפרק בעדינות לשחרור תאים. תאים שבודדו טריים מרקמת גידול מוצקה הם שבירים יותר מאלה שבודדו משורות תאים. בנוסף, מכיוון שסוגי התאים המבודדים הם הטרוגניים, יש לבחור תנאים שיתמכו באוכלוסיית התאים הכוללת. 
לבסוף, תנאי בידוד גרעיני חייבים להיות אופטימליים בהתבסס על תכונות אלה במונחים של זמני ליזה וסוגים/יחסים מגיבים. במאמר זה, אנו מתארים את הניסיון שלנו עם בידוד גרעיני עבור פלטפורמת ריצוף 10x Genomics multiome מדגימות גידול מוצק. אנו מספקים המלצות לעיכול רקמות, אחסון של תרחיפים חד-תאיים (אם רוצים), בידוד גרעיני והערכה.

As our knowledge of tumor biology grows, the importance of analyzing heterogeneous cells across the tumor microenvironment has also increased1,2. The ability to acquire single-cell RNA and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) data from the same cell in a paired-cell fashion (multiome sequencing) provides a significant advance towards this end3,4. These experiments are expensive and time-consuming, however, and the quality and impact of the data acquired are highly dependent on the quality of the experimental conditions and materials. Standardized protocols for nuclei isolation have been published5,6. Fresh and heterogeneous tissues require protocol optimization since freshly isolated cells from solid tumor specimens are more fragile than those isolated from cell lines.
Another consideration is that for solid tumors, surgical specimens are often not available from the operating room until late in the day. As such, it is generally not feasible to proceed directly from sample acquisition to nuclei capture without a cryopreservation step. In our experience, freezing a single-cell suspension yields the highest-quality nuclei (rather than flash-frozen whole tissue or other modalities of preservation). This is particularly true for enzymatic tissue types with high RNase content such as the pancreas.
Tissue digestion conditions also need to be designed to maximize cell yield without sacrificing quality7. In the context of solid tumor types with dense desmoplastic matrices8, the extracellular matrix must be gently broken down for cell release. Additionally, because the cell types isolated are heterogeneous, conditions should be adjusted to support the total cell population. Human pancreatic cancer (pancreatic ductal adenocarcinoma) samples are used in the described protocol. Pancreatic cancer represents a highly desmoplastic tumor type, which portends relatively sticky tissue and cells. Moreover, as pancreatic tumor specimens available for research also tend to be relatively small, efforts are made to maximize the quantity of cells captured.
Isolation of nuclei requires the most optimization in terms of cell lysis conditions and timing, as well as reagent types and ratios. Handling the nuclei over the course of isolation also requires great care. In this article, we describe our experience optimizing nuclear isolation for the 10x Genomics multiome sequencing platform from solid tumor tissue (Figure 1). We provide recommendations for tissue digestion, cryopreservation of single-cell suspensions (if desired), and nuclear isolation.

מחבר זרקור: שיפור בידוד גרעינים לריצוף מולטיומי במיקרו-סביבות גידול מאתגרות

בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי

As our knowledge of tumor biology grows and interest to understand the intricacies of how cells interact within the tumor and influence patient outcomes, the importance of analyzing heterogeneous cells across the tumor microenvironment has also increased. Multiome sequencing, which permits the acquisition of single cell RNA and attack sequencing from the same cell in a paired cell fashion provides a significant advance towards this end. However, the quality of the data obtained from these experiments is highly dependent on the quality of the experimental conditions and inputted biological material.This protocol provides a reliable and optimized approach to the isolation of nuclei from solid tumor specimens for multiome sequencing using the 10x Genomics platform. This protocol is reliable using either fresh or frozen single cell suspensions. We provide recommendations for tissue dissociation conditions, cryopreservation of single cell suspensions, and assessment of isolated nuclei.In this protocol, we used human pancreatic ductal adenocarcinoma specimens, which are a primary tissue type of focus in our laboratory. Pancreas cancer represents a highly desmoplastic tumor type, which portends relatively sticky tissue as well as cells. Moreover, as pancreatic tumor specimens available for research also tend to be relatively small, efforts are made to maximize the quantity of the cells captured.

כדי לבודד גרעינים באיכות גבוהה מדגימות של גידולים מוצקים של מטופלים לצורך ריצוף מולטיומי (איור 1), רקמת הגידול נותקה ותרחיף של תא בודד נשמר בהקפאה (איור 2A-D). לאחר מכן הופשר מתלה התא בזמן לכידת המולטיום המתוכננת. לכידת גרעינים בוצעה עם ריאגנ...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancing Nuclei Isolation for Multiome Sequencing in Challenging Tumor Microenvironments at JoVE.com

הפרוטוקול מספק גישה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידולים מוצקים לצורך ריצוף מולטיומי באמצעות פלטפורמת 10x Genomics, כולל המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים והערכה של גרעינים מבודדים.

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) ...

ככל שהידע שלנו בביולוגיה של הגידול גדל והעניין להבין את המורכבות של האופן שבו תאים מתקשרים בתוך הגידול ומשפיעים על תוצאות המטופלים, גדלה גם החשיבות של ניתוח תאים הטרוגניים ברחבי המיקרו-סביבה של הגידול. ריצוף מולטיום, המאפשר רכישת RNA של תא בודד וריצוף תקיפה מאותו תא בצורה של תא מזווג, מספק התקדמות משמעותית לקראת מטרה זו. עם זאת, איכות הנתונים המתקבלים מניסויים אלה תלויה מאוד באיכות תנאי הניסוי ובחומר הביולוגי המוקלט.פרוטוקול זה מספק גישה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידול מוצקות לצורך ריצוף מולטיומי באמצעות פלטפורמת 10x Genomics. פרוטוקול זה אמין באמצעות מתלים טריים או קפואים של תא בודד. אנו מספקים המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים של תא בודד והערכה של גרעינים מבודדים.בפרוטוקול זה, השתמשנו בדגימות אדנוקרצינומה של צינור הלבלב האנושי, שהן סוג רקמה עיקרי במעבדה שלנו. סרטן הלבלב מייצג סוג גידול דסמופלסטי מאוד, אשר מבשר רקמה דביקה יחסית, כמו גם תאים. יתר על כן, מכיוון שדגימות גידול הלבלב הזמינות למחקר נוטות גם הן להיות קטנות יחסית, נעשים מאמצים למקסם את כמות התאים שנלכדו.

optimized-nuclei-isolation-from-fresh-frozen-solid-tumor-specimens

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Optimized Nuclei Isolation from Fresh and Frozen Solid Tumor Specimens for Multiome Sequencing

811 Views.  Stanford University. ככל שהידע שלנו בביולוגיה של הגידול גדל והעניין להבין את המורכבות של האופן שבו תאים מתקשרים בתוך הגידול ומשפיעים על תוצאות המטופלים, גדלה גם החשיבות של ניתוח תאים הטרוגניים ברחבי המיקרו-סביבה של הגידול. ריצוף מולטיום, המאפשר רכישת RNA של תא בודד וריצוף תקיפה מאותו תא בצורה של...

Video: מחבר זרקור: שיפור בידוד גרעינים לריצוף מולטיומי במיקרו-סביבות גידול מאתגרות

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) data, represents a breakthrough in our ability to discern tumor cell heterogeneity-a primary focus of translational cancer research at this time. However, the quality of sequencing data acquired using this advanced modality is highly dependent on the quality of the input material. 
Digestion conditions need to be optimized to maximize cell yield without sacrificing quality. This is particularly challenging in the context of solid tumors with dense desmoplastic matrices that must be gently broken down for cell release. Freshly isolated cells from solid tumor tissue are more fragile than those isolated from cell lines. Additionally, as the cell types isolated are heterogeneous, conditions should be selected to support the total cell population. 
Finally, nuclear isolation conditions must be optimized based on these qualities in terms of lysis times and reagent types/ratios. In this article, we describe our experience with nuclear isolation for the 10x Genomics multiome sequencing platform from solid tumor specimens. We provide recommendations for tissue digestion, storage of single-cell suspensions (if desired), and nuclear isolation and assessment.

The protocol provides a reliable and optimized approach to the isolation of nuclei from solid tumor specimens for multiome sequencing using the 10x Genomics platform, including recommendations for tissue dissociation conditions, cryopreservation of single-cell suspensions, and assessment of isolated nuclei.

Nuclei Isolation from Human Pancreatic Tumor Cells for Multiome Sequencing

Begin by transferring previously thawed pancreatic tumor cell suspension to a two-milliliter microcentrifuge tube and add PBS to reach a final volume of two milliliters. Then, use a hemocytometer to evaluate the quantity and quality of the cells. Once the cell pellet is obtained through centrifugation, using progressively smaller pipette tips, carefully decant the supernatant to minimize pellet distribution while maximizing the fluid decanted.Prepare 1X cell lysis buffer, then add 100 microliters of it to 900 microliters of previously prepared cell lysis dilution buffer to obtain 0.1X cell lysis buffer. Transfer 100 microliters of chilled 0.1X cell lysis buffer to the cell pellet and gently pipette five times to ensure complete resuspension. After incubation on ice for three minutes, add one milliliter of chilled wash buffer to the resuspended pellet and gently pipette it five times.Following centrifugation, discard the supernatant as demonstrated, and repeat this washing process two more times. Load trypan blue-stained suspension into a hemocytometer to count the number of nuclei. Resuspend the nuclei pellet in 1X nuclei buffer based on goal-targeted nuclei recovery.Carefully pass the resuspended nuclei through a 40-micrometer pipette tip cell strainer, and then maintain it on ice. Now recount the nuclei. The nuclei obtained using this method exhibited appropriate size and shape.Occasional mild stippling of the nuclear envelope can be observed and should be monitored at the final nuclear evaluation via hemocytometer.