Stanford Functional Genomics Facility(SFGF), 특히 Dhananjay Wagh와 John Coller, 그리고 10x Genomics의 실험 최적화에 도움을 주신 데 대해 감사드립니다. 또한 환자 표본 획득에 도움을 주신 George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser, Byrne Lee 박사님께도 감사드립니다. 우리의 연구 노력에 대한 아낌없는 지원에 대해 Art와 Elaine Taylor, Rantz Foundation, Warren and Judy Kaplan에게 감사드립니다. 자금 출처에는 NIH 보조금 1F32CA23931201A1(D.S.F.), 1R01GM116892(M.T.L.), 1R01GM136659(M.T.L.), Goldman Sachs Foundation(J.A.N., D.S.F., M.T.L.), Damon Runyon Cancer Research Foundation(D.D., M.T.L.), Gunn/Olivier Fund, California Institute for Regenerative Medicine, Stinehart/Reed Foundation 및 Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine이 포함됩니다. 염기서열분석은 NIH 기금(S10OD025212, S10OD018220 및 1S10OD01058001A1)으로 구입한 기계를 사용하여 얻었다.

인간 췌장암(췌관 선암) 샘플은 우리 실험실에서 IRB 승인 프로토콜에 따라 획득되었습니다. 조직 채취를 위해 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 조직을 수술실에서 실험실로 이송한 후 다음과 같이 처리하였다.
1. 조직 해리(소화)
<ol><li>다이제스트 버퍼를 준비합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>종양 절제 후 가능한 한 빨리 관심 조직을 확보하고 검체를 담금질 완충액(~5% 소 태아 혈청이 포함된 DMEM F-12) 또는 얼음 위의 1x PBS로 운반합니다.</li>
	<li>깨끗한 겸자와 가위를 사용하여 90mm 페트리 접시에 담긴 3-5mL의 분해 완충액에 조직을 다집니다(그림 2A).</li>
	<li>다진 조직을 50mL 원뿔형 튜브에 옮기고 진탕 기능이 있는 수조 또는 건식 교반기를 사용하여 37°C에서 30분 동안 ~10mL의 분해 완충액에서 해리합니다.</li>
	<li>교반기에서 제거하고 ~20mL의 담금질 배지로 담금질합니다. 100μm 셀 스트레이너를 통해 용액을 깨끗한 원뿔형 튜브로 여과합니다.</li>
	<li>스트레이너에서 남아 있는 고형 조직을 수집하고(필요한 경우 남은 조직 조각을 다시 다져서) ~10mL의 신선한 Digest Buffer에 교반하면서 37°C에서 30분 더 넣습니다. 모든 종양 조직이 해리될 때까지 반복합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 합치고 70μm를 통과한 다음 40μm 세포 여과기를 통해 얼음 위의 깨끗한 원뿔형 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 500× g 의 펠릿 셀로 원심분리한 다음 상층액을 디캔팅합니다.</li>
</ol>2. 냉동 보존
<ol><li>펠릿을 1x PBS 1mL에 재현탁시켜 세포를 헹굽니다.</li>
	<li>세포 현탁액(최적의 동결을 위한 ~1-1,000만 세포/튜브)을 얼음 위의 1.5mL cryovial로 옮깁니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 500× g 의 펠릿 셀로 원심분리한 다음 상층액을 디캔팅합니다.</li>
	<li>1mL의 Bambanker 용액에 세포를 재현탁시키고, 1.5 또는 2mL 극저온으로 옮기고(그림 2B), -80°C에서 -1°C/min 냉각 속도 동결 용기(100% 이소프로필 알코올 포함)를 사용하여 동결하거나, 시료를 장기간 보관할 것으로 예상되는 경우 액체 질소로 옮깁니다.</li>
</ol>3. 핵 분리
<ol><li>세포 현탁액의 냉동을 빠르게 해동하고 젖은 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>해동된 세포 현탁액을 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮기고 1x PBS로 바이알을 2mL 용액에 채워 세포를 헹굽니다.</li>
	<li>세포의 양과 질을 모두 평가하기 위해 혈구계를 사용하여 수동 세포 수를 얻습니다(그림 2C).</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 500× g 의 펠릿 셀로 원심분리한 다음 점차적으로 더 작은 피펫 팁을 사용하여 상층액을 부드럽게 디캔팅하여 마른 펠릿을 남기고 얼음 위에 유지합니다.<ol><li>모든 원심분리 단계에 스윙 버킷 로터를 사용하십시오. 셀 수율을 극대화하려면 힌지가 바깥쪽을 향하도록 튜브를 원심분리기에 넣은 다음 피펫 팁이 튜브의 반대쪽을 향하도록 디캔팅합니다(그림 2D). 알림: 상층액을 디캔팅하려면 점진적으로 더 작은 피펫 팁을 사용하여 유체를 제거하여 펠릿의 중단을 제한하고 디캔팅된 유체의 부피를 최대화합니다. 이 전략은 핵 펠릿이 일반적으로 보이지 않기 때문에 핵 추출 후 프로토콜의 후반부에 특히 유용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>공개된 프로토콜에 따라 1x Cell Lysis Buffer, Cell Lysis Dilution Buffer 및 Wash Buffer(그림 3A)를 다음과 같이 수정하여 준비합니다( 표 1, 재료 표 참조). 알림: 침전물을 용해시키기 위해 사용하기 전에 디지토닌을 65°C의 가열 블록에 놓습니다(그림 3B). 일반적으로 약 10분이 소요됩니다.</li>
	<li>1x Cell Lysis Buffer 100μL와 Cell Lysis Dilution Buffer 900μL를 혼합하여 0.1x Cell Lysis Buffer를 준비하고 피펫에 부드럽게 섞은 후 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>식힌 0.1x 세포 용해 완충액 100μL에 세포 펠릿을 재현탁시키고 부드럽게 피펫팅하여 5배 혼합합니다.</li>
	<li>얼음 위에서 3분 동안 배양합니다(그림 3C).</li>
	<li>식힌 세척 버퍼 1mL와 피펫을 위아래로 추가하여 5배를 부드럽게 섞습니다.</li>
	<li>원심분리기를 하여 4°C에서 5분 동안 500× g 의 핵을 펠릿으로 펠트하고, 상층액을 건조한 펠릿으로 부드럽게 디캔팅하고, 얼음 위에서 유지합니다. 참고: 시작 세포 수가 적은 경우(100,000-200,000개 세포) 2mL 미세 원심분리기 튜브 대신 200μL PCR 튜브에서 세포 용해 및 세척 단계를 수행하여 튜브 표면적을 줄이고 손실을 최소화합니다. 이 경우 더 작은 튜브 부피를 수용하도록 세척 버퍼 부피를 낮추십시오.</li>
	<li>3.9-3.10단계를 2회 반복하여 총 3회 세탁합니다.</li>
	<li>현미경 아래의 혈구계 슬라이드를 사용하여 수동으로 핵을 계산합니다. 원하는 경우 트리판 블루 염료를 사용하여 핵을 볼 수 있는 대비를 제공하고 용해되지 않은 세포에서 핵을 식별하는 데 도움을 줍니다.</li>
	<li>공개된 프로토콜에 따라 1x Nuclei Buffer를 준비합니다: 20x Nuclei Buffer stock, 1 mM DTT, 1 U/μL RNase Inhibitor를 뉴클레아제가 없는 물에 넣고 얼음 위에 보관합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>목표 표적 핵 회수에 따라 1x Nuclei Buffer에서 핵 펠릿을 재현탁시킵니다. 참고: 농도가 충분히 높으면 25μL의 예상 부피 손실과 필터링(단계 3.15)으로 인한 농도 20% 감소를 감안할 때 시작 재현 부피를 결정할 때 이 단계(3,230-8,060핵/μL)에서 10,000 이상의 목표 회수율을 목표로 합니다(3.15단계).</li>
	<li>재현탁된 핵 부피를 40μm 피펫 팁 셀 스트레이너를 통해 부드럽게 통과시키고 핵을 얼음 위에 놓습니다(그림 3D).</li>
	<li>핵을 다시 계산합니다(그림 4A-C). 필요한 경우 최종 용액을 Nuclei Buffer로 더 희석합니다.</li>
	<li>얼음 위에서 핵을 운반하고 공개된 프로토콜에 따라 즉시 핵 포획을 진행합니다.</li>
</ol>

Isolation of nuclei for multiome sequencing in solid tumor specimen(고형 종양 표본에서 멀티옴 염기서열분석을 위한 핵 분리)

<ol>
	<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+and+spatial+transcriptomics+reveal+cancer-associated+fibroblasts+in+glioblastoma+with+protumoral+effects.">Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects.</a> J Clin Invest. 133 (5), e147087 (2023).</li><li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+advancing+our+understanding+of+cancer-associated+fibroblasts.">A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts.</a> Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).</li><li>Foster, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomic+analysis+reveals+conservation+of+cancer-associated+fibroblast+phenotypes+across+species+and+tissue+of+origin.">Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin.</a> Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).</li><li>Hasan, S., Buechler, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+in+a+name?+An+emerging+framework+for+cancer-associated+fibroblasts,+myofibroblasts,+and+fibroblasts.">What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts.</a> Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).</li><li>. Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022)</li><li>. Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022)</li><li>Januszyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+diabetic+and+non-diabetic+foot+ulcers+using+single-cell+RNA-sequencing.">Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing.</a> Micromachines (Basel). 11 (9), 815 (2020).</li><li>Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+relationship+of+wound+healing+and+tumor+stroma.">The evolving relationship of wound healing and tumor stroma.</a> JCI Insight. 3 (18), e99911 (2018).</li><li>Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+isolation+of+multiple+brain+cell+types+for+omics+interrogation.">Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).</li><li>Foster, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+spatial+multiomics+reveals+fibroblast+fate+during+tissue+repair.">Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118 (2021).</li><li>Leiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+isolation+from+adult+mouse+kidney+for+single-nucleus+RNA-sequencing.">Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing.</a> J Vis Exp. (175), (2021).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+isolation+from+fresh+frozen+brain+tumors+for+single-nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq.">Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> J Vis Exp. (162), e61542 (2020).</li></ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

종양 미세환경에 존재하는 이질적인 세포 집단을 푸는 것은 암 생물학에서 활발하게 중점적으로 연구하는 분야입니다. 마찬가지로, 상처 치유 및 섬유증과 같은 양성 병리학에는 복잡한 조직이 존재합니다. 멀티오메 염기서열분석은 동일 세포 쌍을 이룬 scRNA 및 ATAC-seq 데이터를 획득할 수 있는 강력한 도구로 부상했습니다. 이 프로토콜은 신선하고 깨지기 쉬운 작은 종양 검체를 처리하는 환경에...

종양 생물학에 대한 지식이 증가함에 따라 종양 미세환경 전반에 걸쳐 이종 세포를 분석하는 것의 중요성도 증가했습니다 1,2. 단일 세포 RNA를 획득하고 쌍 세포 방식(멀티오메 시퀀싱)으로 동일한 세포에서 염기서열분석(ATAC-sequencing) 데이터를 사용하여 transposase-accessible chromatin에 대한 분석을 획득하는 능력은 이러한 목적을 향한 상당한 발전을 제공합니다 3,4. 그러나 이러한 실험은 비용과 시간이 많이 소요되며 수집된 데이터의 품질과 영향은 실험 조건 및 재료의 품질에 크게 좌우됩니다. 핵 분리를 위한 표준화된 프로토콜이 발표되었습니다 5,6. 신선하고 이질적인 조직은 고형 종양 검체에서 갓 분리한 세포가 세포주에서 분리한 세포보다 더 취약하기 때문에 프로토콜 최적화가 필요합니다.
또 다른 고려 사항은 고형 종양의 경우 수술실에서 늦은 시간까지 수술 표본을 구할 수 없는 경우가 많다는 것입니다. 따라서 일반적으로 냉동 보존 단계 없이 샘플 획득에서 핵 캡처로 직접 진행하는 것은 불가능합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 단세포 현탁액을 동결하면 최고 품질의 핵을 얻을 수 있습니다(급속 냉동 전체 조직 또는 기타 보존 방식이 아닌). 이는 췌장과 같이 RNase 함량이 높은 효소 조직 유형의 경우 특히 그렇습니다.
또한 조직 분해 조건은 품질 저하 없이 세포 수율을 극대화할 수 있도록 설계되어야 한다7. 조밀한 탈형성 기질(desmoplastic matrix)8을 갖는 고형 종양 유형의 맥락에서, 세포외 기질은 세포 방출을 위해 완만하게 분해되어야 한다. 또한 분리된 세포 유형이 이질적이기 때문에 전체 세포 집단을 지원하도록 조건을 조정해야 합니다. 인간 췌장암(췌관 선암) 샘플이 설명된 프로토콜에서 사용됩니다. 췌장암은 탈형성 종양 유형으로, 상대적으로 끈적끈적한 조직과 세포를 예고합니다. 또한 연구에 사용할 수 있는 췌장 종양 검체도 상대적으로 적은 경향이 있기 때문에 포획된 세포의 양을 최대화하기 위한 노력이 필요합니다.
핵을 분리하려면 세포 용해 조건과 타이밍, 시약 유형 및 비율 측면에서 가장 많은 최적화가 필요합니다. 분리 과정에서 핵을 다루는 것도 세심한 주의가 필요합니다. 이 기사에서는 고형 종양 조직에서 10x Genomics 멀티오메 염기서열 분석 플랫폼을 위한 핵 분리를 최적화한 경험을 설명합니다(그림 1). 당사는 조직 분해, 단세포 현탁액의 동결 보존(원하는 경우) 및 핵 분리에 대한 권장 사항을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100, 70, and 40 &#956;m Falcon cell strainers&#160;</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Genomics Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker&#160;</td>
			<td>Wako, Fisher Scientitic</td>
			<td>NC9582225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>499609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Collagenase Type IV)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BN2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS006330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11320082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmi 40 &#956;m&#160; Pipette Tip Cell Strainer&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAH136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi GentleMACSTM digest kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Cryo &#34;Mr. Frosty&#34; Freezing Container</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonident P40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 188</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3335399001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>85113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized nuclei isolation from fresh and frozen solid tumor specimens for multiome sequencing

동일 세포/쌍을 이루는 단일 세포 RNA 및 염기서열분석(ATAC-sequencing) 데이터를 통해 transposase 접근 가능한 염색질에 대한 분석을 제공하는 Multiome 염기서열분석은 현재 중개암 연구의 주요 초점인 종양 세포 이질성을 식별하는 능력의 돌파구를 나타냅니다. 그러나 이 고급 양식을 사용하여 수집된 염기서열분석 데이터의 품질은 입력 자료의 품질에 크게 의존합니다. 
품질 저하 없이 세포 수율을 극대화하기 위해 분해 조건을 최적화해야 합니다. 이는 세포 방출을 위해 부드럽게 분해되어야 하는 조밀한 탈형성 매트릭스가 있는 고형 종양의 맥락에서 특히 어렵습니다. 고형 종양 조직에서 갓 분리한 세포는 세포주에서 분리한 세포보다 더 취약합니다. 또한 분리된 세포 유형이 이질적이기 때문에 전체 세포 집단을 지원하기 위한 조건을 선택해야 합니다. 
마지막으로, 핵 격리 조건은 용해 시간 및 시약 유형/비율 측면에서 이러한 특성을 기반으로 최적화되어야 합니다. 이 기사에서는 고형 종양 표본에서 10x Genomics 멀티오메 염기서열 분석 플랫폼에 대한 핵 분리에 대한 경험을 설명합니다. 당사는 조직 분해, 단세포 현탁액 보관(원하는 경우), 핵 분리 및 평가에 대한 권장 사항을 제공합니다.

As our knowledge of tumor biology grows, the importance of analyzing heterogeneous cells across the tumor microenvironment has also increased1,2. The ability to acquire single-cell RNA and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) data from the same cell in a paired-cell fashion (multiome sequencing) provides a significant advance towards this end3,4. These experiments are expensive and time-consuming, however, and the quality and impact of the data acquired are highly dependent on the quality of the experimental conditions and materials. Standardized protocols for nuclei isolation have been published5,6. Fresh and heterogeneous tissues require protocol optimization since freshly isolated cells from solid tumor specimens are more fragile than those isolated from cell lines.
Another consideration is that for solid tumors, surgical specimens are often not available from the operating room until late in the day. As such, it is generally not feasible to proceed directly from sample acquisition to nuclei capture without a cryopreservation step. In our experience, freezing a single-cell suspension yields the highest-quality nuclei (rather than flash-frozen whole tissue or other modalities of preservation). This is particularly true for enzymatic tissue types with high RNase content such as the pancreas.
Tissue digestion conditions also need to be designed to maximize cell yield without sacrificing quality7. In the context of solid tumor types with dense desmoplastic matrices8, the extracellular matrix must be gently broken down for cell release. Additionally, because the cell types isolated are heterogeneous, conditions should be adjusted to support the total cell population. Human pancreatic cancer (pancreatic ductal adenocarcinoma) samples are used in the described protocol. Pancreatic cancer represents a highly desmoplastic tumor type, which portends relatively sticky tissue and cells. Moreover, as pancreatic tumor specimens available for research also tend to be relatively small, efforts are made to maximize the quantity of cells captured.
Isolation of nuclei requires the most optimization in terms of cell lysis conditions and timing, as well as reagent types and ratios. Handling the nuclei over the course of isolation also requires great care. In this article, we describe our experience optimizing nuclear isolation for the 10x Genomics multiome sequencing platform from solid tumor tissue (Figure 1). We provide recommendations for tissue digestion, cryopreservation of single-cell suspensions (if desired), and nuclear isolation.

저자 스포트라이트: Enhancing Nuclei Isolation for Multiome Sequencing in Challenging Tumor Microenvironments

Multiome Sequencing을 위한 신선 및 냉동 고형 종양 검체에서 최적화된 핵 분리

As our knowledge of tumor biology grows and interest to understand the intricacies of how cells interact within the tumor and influence patient outcomes, the importance of analyzing heterogeneous cells across the tumor microenvironment has also increased. Multiome sequencing, which permits the acquisition of single cell RNA and attack sequencing from the same cell in a paired cell fashion provides a significant advance towards this end. However, the quality of the data obtained from these experiments is highly dependent on the quality of the experimental conditions and inputted biological material.This protocol provides a reliable and optimized approach to the isolation of nuclei from solid tumor specimens for multiome sequencing using the 10x Genomics platform. This protocol is reliable using either fresh or frozen single cell suspensions. We provide recommendations for tissue dissociation conditions, cryopreservation of single cell suspensions, and assessment of isolated nuclei.In this protocol, we used human pancreatic ductal adenocarcinoma specimens, which are a primary tissue type of focus in our laboratory. Pancreas cancer represents a highly desmoplastic tumor type, which portends relatively sticky tissue as well as cells. Moreover, as pancreatic tumor specimens available for research also tend to be relatively small, efforts are made to maximize the quantity of the cells captured.

멀티오메 염기서열분석(그림 1)을 위해 환자 고형 종양 표본에서 고품질 핵을 분리하기 위해 종양 조직을 해리하고 단세포 현탁액을 동결 보존했습니다(그림 2A-D). 그런 다음 세포 현탁액은 계획된 멀티오메 포획 시 해동되었습니다. 핵 포획은 품질과 수율을 모두 극대화하기 위해 최적화된 용해 완충 시약과 타이밍으로 수행?...

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이 프로토콜은 조직 해리 조건, 단일 세포 현탁액의 동결 보존 및 분리된 핵 평가에 대한 권장 사항을 포함하여 10x Genomics 플랫폼을 사용하여 다중 종양 시퀀싱을 위해 고형 종양 검체에서 핵을 분리하는 데 신뢰할 수 있고 최적화된 접근 방식을 제공합니다.

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) ...

종양 생물학에 대한 지식이 증가하고 세포가 종양 내에서 상호 작용하고 환자 결과에 영향을 미치는 방식의 복잡성을 이해하려는 관심이 높아짐에 따라 종양 미세환경 전반에서 이종 세포 분석의 중요성도 높아졌습니다. 단일 세포 RNA의 획득과 쌍을 이루는 세포 방식으로 동일한 세포에서 공격 염기서열 분석을 가능하게 하는 다중 염기서열 분석은 이러한 목적을 향한 상당한 발전을 제공합니다. 그러나 이러한 실험에서 얻은 데이터의 품질은 실험 조건과 투입된 생물학적 물질의 품질에 크게 의존합니다.이 프로토콜은 10x Genomics 플랫폼을 사용하여 멀티오메 염기서열 분석을 위해 고형 종양 검체에서 핵을 분리하는 데 안정적이고 최적화된 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 신선 또는 냉동 단세포 현탁액을 사용하여 신뢰할 수 있습니다. 당사는 조직 해리 조건, 단일 세포 현탁액의 동결 보존 및 분리된 핵 평가에 대한 권장 사항을 제공합니다.이 프로토콜에서는 인간 췌관 선암종 검체를 사용했는데, 이는 우리 실험실의 주요 조직 유형입니다. 췌장암은 탈형성 종양 유형으로, 세포뿐만 아니라 조직도 상대적으로 끈적끈적합니다. 또한, 연구에 사용할 수 있는 췌장 종양 검체도 상대적으로 적은 경향이 있기 때문에 포획된 세포의 양을 최대화하기 위한 노력이 필요합니다.

optimized-nuclei-isolation-from-fresh-frozen-solid-tumor-specimens

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Optimized Nuclei Isolation from Fresh and Frozen Solid Tumor Specimens for Multiome Sequencing

797 조회수.  Stanford University. 종양 생물학에 대한 지식이 증가하고 세포가 종양 내에서 상호 작용하고 환자 결과에 영향을 미치는 방식의 복잡성을 이해하려는 관심이 높아짐에 따라 종양 미세환경 전반에서 이종 세포 분석의 중요성도 높아졌습니다. 단일 세포 RNA의 획득과 쌍을 이루는 세포 방식으로 동일한 세포에서 공격 염기서열 분석을 가능하게 하는 다중 염기서열 분석은 이러한 목적을 향한 상당...

비디오: 저자 스포트라이트: Enhancing Nuclei Isolation for Multiome Sequencing in Challenging Tumor Microenvironments

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) data, represents a breakthrough in our ability to discern tumor cell heterogeneity-a primary focus of translational cancer research at this time. However, the quality of sequencing data acquired using this advanced modality is highly dependent on the quality of the input material. 
Digestion conditions need to be optimized to maximize cell yield without sacrificing quality. This is particularly challenging in the context of solid tumors with dense desmoplastic matrices that must be gently broken down for cell release. Freshly isolated cells from solid tumor tissue are more fragile than those isolated from cell lines. Additionally, as the cell types isolated are heterogeneous, conditions should be selected to support the total cell population. 
Finally, nuclear isolation conditions must be optimized based on these qualities in terms of lysis times and reagent types/ratios. In this article, we describe our experience with nuclear isolation for the 10x Genomics multiome sequencing platform from solid tumor specimens. We provide recommendations for tissue digestion, storage of single-cell suspensions (if desired), and nuclear isolation and assessment.

The protocol provides a reliable and optimized approach to the isolation of nuclei from solid tumor specimens for multiome sequencing using the 10x Genomics platform, including recommendations for tissue dissociation conditions, cryopreservation of single-cell suspensions, and assessment of isolated nuclei.

연구

암 연구학

Nuclei Isolation from Human Pancreatic Tumor Cells for Multiome Sequencing

Begin by transferring previously thawed pancreatic tumor cell suspension to a two-milliliter microcentrifuge tube and add PBS to reach a final volume of two milliliters. Then, use a hemocytometer to evaluate the quantity and quality of the cells. Once the cell pellet is obtained through centrifugation, using progressively smaller pipette tips, carefully decant the supernatant to minimize pellet distribution while maximizing the fluid decanted.Prepare 1X cell lysis buffer, then add 100 microliters of it to 900 microliters of previously prepared cell lysis dilution buffer to obtain 0.1X cell lysis buffer. Transfer 100 microliters of chilled 0.1X cell lysis buffer to the cell pellet and gently pipette five times to ensure complete resuspension. After incubation on ice for three minutes, add one milliliter of chilled wash buffer to the resuspended pellet and gently pipette it five times.Following centrifugation, discard the supernatant as demonstrated, and repeat this washing process two more times. Load trypan blue-stained suspension into a hemocytometer to count the number of nuclei. Resuspend the nuclei pellet in 1X nuclei buffer based on goal-targeted nuclei recovery.Carefully pass the resuspended nuclei through a 40-micrometer pipette tip cell strainer, and then maintain it on ice. Now recount the nuclei. The nuclei obtained using this method exhibited appropriate size and shape.Occasional mild stippling of the nuclear envelope can be observed and should be monitored at the final nuclear evaluation via hemocytometer.