המחברים מביעים את תודתם לפרופסור רובינסון רמירז מ-UdeA על העזרה עם בעלי חיים וכמה תמונות ולקרולינה פלאסיוס על התמיכה הטכנית. יוהאן פינדה מקיקה עזר לנו להתקין את מצלמות הצבע והפלורסצנטיות. שיואן נגו, מאוניברסיטת קווינסלנד, הגיה באדיבות את כתב היד. מחקר זה מומן על ידי CODI-UdeA (2020-34909 מה-22 בפברואר 2021, ו-2021-40170 מה-31 במרץ 2022, SIU), ומשרד התכנון UdeA (E01708-K ו-ES03180101), מדיין, קולומביה, ל-JCC. המממנים לא השתתפו באיסוף וניתוח נתונים, בכתיבת כתבי יד או בהגשתם.

בידוד אנזימטי ואפיון סיבי שריר עכבר באורך משתנה

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

כדי להשלים את המודלים הזמינים לחקר ביולוגיה של שרירי שלד בוגרים, כאן אנו מדגימים את הדיסוציאציה האנזימטית המוצלחת של מגוון שרירי עכבר עם סיבים קצרים, בינוניים וארוכים. סיבים אלה מאפשרים הדגמה של הכללה של קינטיקה MT-II של Ca2+ transients בשרירי השלד. יתר על כן, סוגי הסיבים בשרירים שלמים שלמים ס...

שריר השלד הבוגר של יונקים הוא רקמה רב תכליתית. הוא מווסת בכבדות את חילוף החומרים, הוא המקור העיקרי לייצור חום, ותכונותיו הדינמיות מעניקות לו תפקיד מפתח בנשימה, תנועה של מקטעי גוף, או תזוזה מנקודה אחת לאחרת 1,2,3. שרירי השלד רלוונטיים גם לפתופיזיולוגיה של מחלות רבות, כולל מצבים תורשתיים וכרוניים, כגון מיופתיות, ניוון או סרקופניה, כמו גם מצבים כרוניים רבים שאינם שרירים, כגון מחלות לב מטבוליות 3,4,5,6,7,8.
מחקר ex vivo של התכונות המבניות והתפקודיות של שרירי שלד בוגרים בהקשר של בריאות ומחלות התאפשר בעיקר באמצעות שני מודלים ניסיוניים: שריר שלם וסיבים מבודדים. במאהה-20, חוקרים ניצלו את התכונות של השרירים השלמים, השלמים extensor digitorum longus (EDL), soleus, tibialis anterior ו-gastrocnemius של מינים קטנים שונים כמודלים מרכזיים כדי ללמוד על יחידות מוטוריות, סוגי סיבים ותכונות דינמיות כגון כוח וקינטיקה של כיווץ והרפיה 9,10,11,12,13,14,15,16. עם זאת, הופעתם של מחקרים מעודנים יותר בביולוגיה של התא העבירה את האזור לחקר סיבי שריר בודדים. עבודה חלוצית אפשרה אז בידוד של סיבי flexor digitorum brevis (FDB) שלמים של חולדות על ידי דיסוציאציה אנזימטית לצורך אפיון עוקב 17,18,19. למרות סיבי FDB ניתן להשיג גם על ידי דיסקציה ידנית20, הקלות והתפוקה הגבוהה של דיסוציאציה אנזימטית של שרירי מורין, בנוסף להתאמתם למגוון גישות ניסיוניות, הפכו את המודל האחרון בשימוש נרחב במהלך שני העשורים האחרונים.
סיבי ה-FDB הקצרים מתאימים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים וביופיזיקליים אחרים, ניתוחים ביוכימיים, מטבוליים ופרמקולוגיים, ניסויים במיקרוסקופ אלקטרונים ופלואורסצנטיים, טרנספקציה לגישות ביולוגיה של התא, או כמקור לתאי גזע במחקרי מיוגנזה 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. עם זאת, שימוש רק בסיבי FDB בניסויי שרירים מצמצם את היקף המחקר העוסק בסוגי סיבים ומגביל את כמות החומר הביולוגי הזמין לטכניקות מתודולוגיות מסוימות או להשגת מידע נוסף מחיה אחת. מגבלות אלה מעכבות התאמה ברורה של תופעות פיזיולוגיות תאיות עם מחקרים ביוכימיים ודינמיים קודמים שבוצעו בשרירים שלמים ושלמים שונים (למשל, EDL, soleus, peronei).
התגברות על מגבלות אלה, קבוצות מסוימות הצליחו לנתק את שרירי EDL וסוליאוס הארוכים יותר 24,33,34,35,36,37,38,39,40, ובכך פתחו את הדלת להרחיב עוד יותר את השיטה לשרירים רלוונטיים אחרים. עם זאת, השימוש בסיבי EDL ו-soleus עדיין נדיר, ככל הנראה בשל היעדר פרטים מתודולוגיים לקבלת סיבים שלמים. כאן, אנו מתארים בפירוט כיצד לבודד סיבים באורכים וסוגים שונים משישה שרירים: שלושה מהם כבר תוארו (FDB, EDL, ו soleus) ושלושה מהם בהצלחה מנותקים בפעם הראשונה (extensor hallucis longus [EHL], peroneus longus [PL], ו peroneus digiti quarti [PDQA]). תוצאות העבודה הנוכחית מאשרות כי המודל של סיבים מנותקים אנזימטית מתאים למגוון רחב של מחקרים ומתאמים עתידיים עם נתונים שפורסמו בעבר, ובכך מגדיל את זמינותם של מודלים למחקרי שרירי שלד בוגרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15512-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141138.1610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti myosin I antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4276</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti myosin II antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8421</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti myosin IIA antibody</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>SC-71</td>
			<td>Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti myosin IIB antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>BF-F3-c&#160;</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10306.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>428658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride (CaCl2)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>319988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS-2/LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consul-Mount</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9990440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>112553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edetic acid (EDTA</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Panreac&#160;</td>
			<td>1423291211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>151340.1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6765015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>861405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>M136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Fluo-4, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M14206</td>
			<td>Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A11080100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Protokimica</td>
			<td>MP10043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Several</td>
			<td>Several</td>
			<td>For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting compound (OCT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecil sulfate</td>
			<td>Panreac&#160;</td>
			<td>1323631209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS 0.5 M, pH 6.8&#160;</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(Hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>M151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>M143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection chamber</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged slides</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>5951PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental bath chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27NE2</td>
			<td>Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500338, 500230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Vannas Scissors 501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Several</td>
			<td></td>
			<td>Fire-polished tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials with cap</td>
			<td>Several</td>
			<td></td>
			<td>2-3 mL volumen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501223-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SL 8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Erc 5s and Axio 305</td>
			<td>Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1550A Digidata</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>Mini-Protean IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope coupled to fluorescence</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer A1</td>
			<td>Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba</td>
			<td>Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator&#160;</td>
			<td>Grass Instruments&#160;</td>
			<td>S6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath&#160;</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNE-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>808691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free software for electrophoreses analyses</td>
			<td>University of Kentucky</td>
			<td>GelBandFitter v1.7</td>
			<td>http://www.gelbandfitter.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free software for image analysis and morphometry</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ v1.54</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pCLAMP v10.05</td>
			<td>https://www.moleculardevices.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Licensed software for statistical analyses and graphing</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>OriginPro 2019</td>
			<td>https://www.originlab.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intact short, intermediate, and long skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of six hindlimb muscles of mice: beyond flexor digitorum brevis

סיבי שרירי השלד המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שרירי העכבר הם מודל שימושי לניסויים פיזיולוגיים. עם זאת, רוב המאמרים עוסקים בסיבים הקצרים של ה-FDB (flexor digitorum brevis), המגבילים את טווח התוצאות העוסקות בסוגי סיבים, מגבילים את כמות החומר הביולוגי הזמין ומונעים קשר ברור בין תופעות פיזיולוגיות תאיות לבין ידע ביוכימי ודינמי קודם שהושג בשרירים אחרים.
מאמר זה מתאר כיצד להשיג סיבים שלמים משישה שרירים בעלי פרופילים ואורכים שונים של סוגי סיבים. באמצעות C57BL/6 עכברים בוגרים, אנו מראים את פרוטוקול דיסקציית השרירים ובידוד הסיבים ומדגימים את התאמת הסיבים למחקרים חולפים Ca2+ ואפיונם המורפומטרי. הרכב סוג סיבים של השרירים מוצג גם. כאשר מנותקים, כל השרירים נותרו שלמים, סיבים חיים המתכווצים במהירות במשך יותר מ -24 שעות. FDB נתן קצר (<1 מ"מ), peroneus digiti quarti (PDQA) ו peroneus longus (PL) נתן ביניים (1-3 מ"מ), בעוד extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL), ושרירי סולאוס שחררו סיבים ארוכים (3-6 מ"מ).
כאשר תועדו עם הצבע המהיר Mag-Fluo-4, Ca2+ transients של סיבי PDQA, PL ו-EHL הראו קינטיקה מהירה וצרה המזכירה את סוג המורפולוגיה II (MT-II), הידוע כמתאים לסיבים מסוג IIX ו-IIB. זה עולה בקנה אחד עם העובדה כי שרירים אלה יש מעל 90% של סיבים מסוג II לעומת FDB (~ 80%) ו soleus (~ 65%). מעבר ל-FDB, אנו מדגימים לראשונה דיסוציאציה של מספר שרירים, היוצרים סיבים המשתרעים על פני טווח אורכים שבין 1 ל-6 מ"מ. סיבים אלה הם קיימא ונותנים Ca2+ מהיר transients, המציין כי MT-II ניתן להכליל סיבים מהירים IIX ו- IIB, ללא קשר למקור השריר שלהם. תוצאות אלה מגדילות את הזמינות של מודלים למחקרי שרירי שלד בוגרים.

The mature skeletal muscle of mammals is a multifunctional tissue. It heavily regulates metabolism, is the main source of heat production, and its dynamical properties confer upon it a key role in respiration, movement of body segments, or displacement from one point to another1,2,3. Skeletal muscle is also relevant for the pathophysiology of many illnesses, including inherited and chronic conditions, such as myopathies, dystrophies, or sarcopenia, as well as many non-muscle chronic conditions, such as cardiometabolic diseases3,4,5,6,7,8.
The ex vivo study of the structural and functional properties of mature skeletal muscle in the context of health and disease has been possible mainly through two experimental models: whole muscle and isolated fibers. In the 20th century, researchers exploited the properties of the whole, intact extensor digitorum longus (EDL), soleus, tibialis anterior, and gastrocnemius muscles of different small species as pivotal models to learn about motor units, fiber types, and dynamic properties such as force and kinetics of contraction and relaxation9,10,11,12,13,14,15,16. However, the advent of more refined cell biology studies moved the area toward the study of single muscle fibers. Pioneering work then enabled the isolation of intact flexor digitorum brevis (FDB) fibers of rats by enzymatic dissociation for subsequent characterization17,18,19. Although FDB fibers can also be obtained by manual dissection20, the ease and high throughput of enzymatic dissociation of murine muscles, in addition to their suitability for a variety of experimental approaches, have made the latter model widely used during the last two decades.
The short FDB fibers are suitable for electrophysiological and other biophysical studies, biochemical, metabolic, and pharmacological analyses, electron and fluorescence microscopy experiments, transfection for cell biology approaches, or as a source of stem cells in myogenesis studies5,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. However, using only FDB fibers in muscle experiments narrows the scope of research dealing with fiber types and limits the amount of biological material available for some methodological techniques or for gaining more information from one animal. These limitations hinder a clear correlation of cellular physiological phenomena with previous biochemical and dynamical studies performed in different whole, intact, muscles (e.g., EDL, soleus, peronei).
Overcoming these limitations, some groups succeeded in dissociating the longer EDL and soleus muscles24,33,34,35,36,37,38,39,40, opening the door to further extend the method to other relevant muscles. However, the use of EDL and soleus fibers is still scarce, likely due to the lack of methodological details for getting them as intact fibers. Here, we describe in detail how to isolate fibers of different lengths and types from six muscles: three of them already described (FDB, EDL, and soleus) and three of them successfully dissociated for the first time (extensor hallucis longus [EHL], peroneus longus [PL], and peroneus digiti quarti [PDQA]). The results of the present work confirm that the model of enzymatically dissociated fibers is apt for a wide range of studies and future correlations with previously published data, thus increasing the availability of models for mature skeletal muscle studies.

מחבר זרקור: בידוד סיבי שריר ארוכים משרירי הגפיים האחוריות של עכבר לחקר צימוד עירור-כיווץ בין סוגי סיבים

סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis

In this study, we describe a method to isolate fibers of different lengths and types from six hindlimb muscles from mice. Also, we tested the suitability of the fibers for physiological experiments dealing with the study of the excitation-contraction coupling mechanism. For years, obtaining long muscle fibers was challenge, limiting the scope of many studies in the field.Now we show that it is possible to obtain lean fibers with mouse flexors, extensors, and evertors with lengths of up to six millimeters. As an example, obtaining fibers from six different muscles has allowed us to show that the calcium transient kinetics known as morphology type II, can be generalized to type IIB and IIX regardless of the location or function of their muscle source. We believe that the model of enzymatically isolated fibers is suitable for a variety of experimental approaches with different types of technologies that allow us to answer mechanistic questions within the range of biochemistry, physiology, biophysics, cell biology, and molecular biology.

ריכוז סרקופלזמי Ca2+ במהלך עווית כדי להדגים את ההיתכנות של ניסויים פיזיולוגיים בקבוצת סיבים מנותקים ולהרחיב את הממצאים הקודמים שלנו על צימוד עירור-כיווץ (ECC) וסוגי סיבים, Ca2+ transients נרכשו בסיבים מכל השרירים. ראשית, FDB (n = 5) ו- EDL (n = 7) הראו קינטיקה Ca2+ המכונה מורפולוגיה ...

Watch this Scientific Journal Video about Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

אנו מתארים פרוטוקול לקבלת סיבים מנותקים אנזימטית באורכים וסוגים שונים משישה שרירים של עכברים בוגרים: שלושה מהם כבר תוארו (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) ושלושה מהם נותקו בהצלחה בפעם הראשונה (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal ...

במחקר זה אנו מתארים שיטה לבידוד סיבים באורכים וסוגים שונים משישה שרירי גפיים אחוריות מעכברים. כמו כן, בדקנו את התאמת הסיבים לניסויים פיזיולוגיים העוסקים בחקר מנגנון צימוד עירור-כיווץ. במשך שנים, השגת סיבי שריר ארוכים הייתה מאתגרת, והגבילה את היקף המחקרים הרבים בתחום.כעת אנו מראים כי ניתן להשיג סיבים רזים עם כופפי עכבר, מרחיבים ואוורטורים באורכים של עד שישה מילימטרים. לדוגמה, קבלת סיבים משישה שרירים שונים אפשרה לנו להראות כי קינטיקה חולפת סידן המכונה מורפולוגיה סוג II, ניתן להכליל לסוג IIB ו- IIX ללא קשר למיקום או תפקוד של מקור השריר שלהם. אנו מאמינים כי המודל של סיבים מבודדים אנזימטית מתאים למגוון גישות ניסיוניות עם סוגים שונים של טכנולוגיות המאפשרות לנו לענות על שאלות מכניסטיות בטווח של ביוכימיה, פיזיולוגיה, ביופיזיקה, ביולוגיה של התא וביולוגיה מולקולרית.

intact-short-intermediate-long-skeletal-muscle-fibers-obtained

Research

JoVE Journal

Biology

Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

913 Views.  University of Antioquia. במחקר זה אנו מתארים שיטה לבידוד סיבים באורכים וסוגים שונים משישה שרירי גפיים אחוריות מעכברים. כמו כן, בדקנו את התאמת הסיבים לניסויים פיזיולוגיים העוסקים בחקר מנגנון צימוד עירור-כיווץ. במשך שנים, השגת סיבי שריר ארוכים הייתה מאתגרת, והגבילה את היקף המחקרים הרבים בתחום.כע...

Video: מחבר זרקור: בידוד סיבי שריר ארוכים משרירי הגפיים האחוריות של עכבר לחקר צימוד עירור-כיווץ בין סוגי סיבים

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal with the short fibers of the flexor digitorum brevis (FDB), which restrains the scope of results dealing with fiber types, limits the amount of biological material available, and impedes a clear connection between cellular physiological phenomena and previous biochemical and dynamical knowledge obtained in other muscles.
This paper describes how to obtain intact fibers from six muscles with different fiber type profiles and lengths. Using C57BL/6 adult mice, we show the muscle dissection and fiber isolation protocol and demonstrate the suitability of the fibers for Ca2+ transient studies and their morphometric characterization. The fiber type composition of the muscles is also presented. When dissociated, all muscles rendered intact, living fibers that contract briskly for more than 24 h. FDB gave short (&#60;1 mm), peroneus digiti quarti (PDQA) and peroneus longus (PL) gave intermediate (1-3 mm), while extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL), and soleus muscles released long (3-6 mm) fibers.
When recorded with the fast dye Mag-Fluo-4, Ca2+ transients of PDQA, PL, and EHL fibers showed the fast, narrow kinetics reminiscent of the morphology type II (MT-II), known to correspond to type IIX and IIB fibers. This is consistent with the fact that these muscles have over 90% of type II fibers compared with FDB (~80%) and soleus (~65%). Moving beyond FDB, we demonstrate for the first time the dissociation of several muscles, which render fibers spanning a range of lengths between 1 and 6 mm. These fibers are viable and give fast Ca2+ transients, indicating that the MT-II can be generalized to IIX and IIB fast fibers, regardless of their muscle source. These results increase the availability of models for mature skeletal muscle studies.

We describe a protocol to obtain enzymatically dissociated fibers of different lengths and types from six muscles of adult mice: three of them already described (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) and three of them successfully dissociated for the first time (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Mouse Hindlimb Muscle Dissection and Subsequent Muscle Fiber Isolation Using Collagenase Digestion for Calcium Transient Studies

After sacrificing the mouse, place it on a foam surface and secure the forelimbs with tape or pins. Use operating scissors to cut both hind limbs over the knees. Transfer each hind limb to a separate dissection chamber, and add cold Tyrode's solution to cover the tissue.Pin the first hind limb to the dissection chamber, ensuring the posterior face of the legs is visible. Under magnification, remove the skin, then expose and excise the flexor digitorum brevis or FDB muscle. Store the FDB muscle in a labeled glass vial containing one milliliter of Tyrode's solution.Using fine scissors, separate the gastrocnemius muscle, then excise the soleus muscle. Remove the skin from the anterior face of the leg. Then, identify the distal tendons of the tibialis anterior and the extensor digitorum longus or EDL muscles in the ankle region.Remove and discard the tibialis. Then, cut the distal tendons of the EDL and continue the dissection to completely remove the EDL muscle. After identifying the extensor hallucis longus or EHL muscle, begin the dissection following the tendon to the first digit.Next, identify and follow the most external tendon of the peronei to sever it and remove the peroneus longus or PL muscle. Identify and trace the tendon to the fourth digit. Then, cut and remove the peroneus digiti quarti or PDQA muscle.After dissecting the second hind limb, collect muscles of the same type in a labeled glass vial containing Tyrode's solution. Replace the Tyrode's solution in the dissection chamber to remove debris and mouse fur. Pour the PL muscles into the dissection chamber and verify their integrity and contraction.Perform longitudinal or diagonal cuts on the soleus muscle following the central tendon, cutting approximately 80%of its length. For the EDL muscle, follow one or two tendons and cut about the same length as the soleus. Transfer each pair of muscles to a new glass vial containing three milligrams of collagenase type 2 in dissociation solution, and incubate them in a 37 degree Celsius water bath for 65 to 90 minutes with gentle shaking.After 65 minutes of incubation, check the vial under stereoscope every five minutes. Once the muscle appears rippled and loose, and fibers begin to detach, rinse the muscles with Tyrode's at room temperature to deactivate and remove the collagenase. Using a set of fire-polished Pasteur pipettes, agitate the solution around the muscle with a five millimeter tip pipette.Then, gently pull the muscles in and out of the tip three to four times. As the muscles starts to release fibers and becomes thinner, using a four millimeter tip, repeat the procedure to separate more fibers.

דיסקציה של שריר הגפיים האחוריות של העכבר ובידוד סיבי שריר לאחר מכן באמצעות עיכול Collagenase למחקרים חולפים בסידן

Measuring Sarcoplasmic Calcium Concentration in Isolated Mouse Muscle Fibers

To begin, mount a clean glass slide on the experimental bath chamber. Coat the slide with two to three microliters of laminin and let it dry for 30 seconds. Then, pour approximately 400 microliters of the muscle fiber suspension onto the slide and allow the fibers to adhere to the laminin for 10 to 15 minutes.Place the experimental chamber onto the stage of an inverted microscope equipped for epifluorescence. To verify the viability of the fibers, place two platinum electrodes on either side of the experimental chamber. After applying rectangular current pulses for 0.8 to 1.2 milliseconds, observe the muscle fiber contractions at the extremes.Load the fibers with 3.5 to 4.5 micromolars of the fast calcium dye Mag-Fluo-4 AM for four to five minutes in Tyrode solution. After washing the slide with Tyrode solution, let the intracellular dye de-esterify for 15 to 20 minutes in the dark. During the acquisition of calcium transients under dimmed illumination, collect and save the light signals with an oil immersion 40X objective and a photomultiplier tube connected to a digitizer.In the acquisition software, ensure a scale of zero to 200 arbitrary units. Then, adjust the size of the excitation spot and the gain of the photomultiplier tube to set the resting fluorescence, or F-rest, to 10 arbitrary units. For analyzing the recordings, set a low-pass filter to the whole trace at one kilohertz.Then, adjust the peak to calculate the F-rest in one second of the trace. Adjust the F-rest to zero and measure the peak sarcoplasmic calcium transient's amplitude. Measure the rise time from 10%to 90%of the amplitude, the duration at half-maximum, and the decay time from 90%to 10%of the amplitude.Then, estimate the decay kinetics according to a fit with the bi-exponential function. Calculate the peak calcium concentration in micromolar. Finally, save the values of the time constants of decay tau 1 and tau 2, and amplitudes A1 and A2.The FDB and EDL muscles showed calcium kinetics known as morphology type II Soleus muscles displayed morphology type I calcium transients.Fibers from PDQA, PL, and EHL muscles shared the type II morphology. The calcium transient's kinetic signals of PDQA, PL, and EHL were similar to the signals of FDB EDL muscles, but differed from soleus muscle signals.