Yazarlar, UdeA'dan Profesör Robinson Ramírez'e hayvanlar ve bazı fotoğraflar konusundaki yardımları için ve teknik destek için Carolina Palacios'a şükranlarını sunarlar. Kaika'dan Johan Pineda, renkli ve floresan kameraları kurmamıza yardımcı oldu. Queensland Üniversitesi'nden Shyuan Ngo, el yazmasını nazikçe düzeltti. Bu çalışma CODI-UdeA (22 Şubat 2021'den itibaren 2020-34909 ve 31 Mart 2022'den itibaren 2021-40170, SIU) ve Planlama Ofisi-UdeA (E01708-K ve ES03180101), Medellín, Kolombiya tarafından JCC'ye finanse edilmiştir. Fon sağlayıcılar veri toplama ve analizine, makale yazımına veya gönderimine katılmamıştır.

Değişken Uzunluklu Fare Kas Liflerinin Enzimatik İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Olgun iskelet kası biyolojisini incelemek için mevcut modelleri tamamlamak için, burada kısa, orta ve uzun liflere sahip bir dizi fare kasının başarılı bir şekilde enzimatik ayrışmasını gösteriyoruz. Bu lifler, iskelet kasındakiCa2+ geçici akımlarının MT-II kinetiğinin genelleştirilebilirliğinin gösterilmesine izin verir. Ayrıca, sağlam, bütün kaslardaki lif tipleri sınıflandırıldı. FDB'nin fizyolojik deneyler için en çok kullanılan kas olduğu göz önüne alındığında, ...

Memelilerin olgun iskelet kası çok işlevli bir dokudur. Metabolizmayı yoğun bir şekilde düzenler, ısı üretiminin ana kaynağıdır ve dinamik özellikleri ona solunumda, vücut bölümlerinin hareketinde veya bir noktadan diğerine yer değiştirmede önemli bir rol verir 1,2,3. İskelet kası, miyopatiler, distrofiler veya sarkopeni gibi kalıtsal ve kronik durumların yanı sıra kardiyometabolik hastalıklar 3,4,5,6,7,8 gibi birçok kas dışı kronik durum da dahil olmak üzere birçok hastalığın patofizyolojisi ile de ilgilidir.
Sağlık ve hastalık bağlamında olgun iskelet kasının yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin ex vivo çalışması, esas olarak iki deneysel model aracılığıyla mümkün olmuştur: tüm kas ve izole lifler. 20. yüzyılda araştırmacılar, motor üniteler, lif tipleri ve kasılma ve gevşeme kuvveti ve kinetiği gibi dinamik özellikler hakkında bilgi edinmek için farklı küçük türlerin bütün, bozulmamış ekstansör digitorum longus (EDL), soleus, tibialis anterior ve gastroknemius kaslarının özelliklerini önemli modeller olarak kullandılar 9,10,11,12,13,14,15,16. Bununla birlikte, daha rafine hücre biyolojisi çalışmalarının ortaya çıkışı, alanı tek kas liflerinin incelenmesine doğru kaydırdı. Öncü çalışma daha sonra sıçanların bozulmamış fleksör digitorum brevis (FDB) liflerinin enzimatik ayrışma yoluyla daha sonraki karakterizasyon için izolasyonunu sağladı 17,18,19. FDB lifleri manuel diseksiyon20 ile de elde edilebilse de, çeşitli deneysel yaklaşımlara uygunluklarına ek olarak, murin kaslarının enzimatik ayrışmasının kolaylığı ve yüksek verimi, ikinci modelin son yirmi yılda yaygın olarak kullanılmasını sağlamıştır.
Kısa FDB lifleri, elektrofizyolojik ve diğer biyofiziksel çalışmalar, biyokimyasal, metabolik ve farmakolojik analizler, elektron ve floresan mikroskobu deneyleri, hücre biyolojisi yaklaşımları için transfeksiyon veya miyogenez çalışmalarında kök hücre kaynağı olarak uygundur 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Bununla birlikte, kas deneylerinde sadece FDB liflerinin kullanılması, lif türleriyle ilgili araştırmaların kapsamını daraltır ve bazı metodolojik teknikler veya bir hayvandan daha fazla bilgi edinmek için mevcut biyolojik materyal miktarını sınırlar. Bu sınırlamalar, hücresel fizyolojik fenomenlerin farklı bütün, sağlam kaslarda (örneğin, EDL, soleus, peronei) gerçekleştirilen önceki biyokimyasal ve dinamik çalışmalarla açık bir korelasyonunu engellemektedir.
Bu sınırlamaların üstesinden gelen bazı gruplar, daha uzun EDL ve soleus kaslarını 24,33,34,35,36,37,38,39,40 ayırmayı başardı ve yöntemi diğer ilgili kaslara daha da genişletmek için kapıyı açtı. Bununla birlikte, EDL ve soleus liflerinin kullanımı, muhtemelen onları bozulmamış lifler olarak elde etmek için metodolojik ayrıntıların bulunmamasından dolayı hala azdır. Burada, farklı uzunluk ve tipteki liflerin altı kastan nasıl izole edileceğini ayrıntılı olarak açıklıyoruz: bunlardan üçü daha önce tanımlanmış (FDB, EDL ve soleus) ve üçü ilk kez başarılı bir şekilde ayrıştı (ekstansör hallusis longus [EHL], peroneus longus [PL] ve peroneus digiti quarti [PDQA]). Bu çalışmanın sonuçları, enzimatik olarak ayrışmış liflerin modelinin çok çeşitli çalışmalar ve daha önce yayınlanmış verilerle gelecekteki korelasyonlar için uygun olduğunu ve böylece olgun iskelet kası çalışmaları için modellerin kullanılabilirliğini artırdığını doğrulamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15512-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141138.1610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti myosin I antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4276</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti myosin II antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8421</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti myosin IIA antibody</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>SC-71</td>
			<td>Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti myosin IIB antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>BF-F3-c&#160;</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10306.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>428658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium dichloride (CaCl2)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>319988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS-2/LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consul-Mount</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9990440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant blue R 250&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>112553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edetic acid (EDTA</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Panreac&#160;</td>
			<td>1423291211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>151340.1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6765015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>861405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>M136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Fluo-4, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M14206</td>
			<td>Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A11080100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Protokimica</td>
			<td>MP10043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Several</td>
			<td>Several</td>
			<td>For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting compound (OCT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6769006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecil sulfate</td>
			<td>Panreac&#160;</td>
			<td>1323631209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS 0.5 M, pH 6.8&#160;</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(Hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>M151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>M143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection chamber</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged slides</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>5951PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental bath chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27NE2</td>
			<td>Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500338, 500230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Vannas Scissors 501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Several</td>
			<td></td>
			<td>Fire-polished tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials with cap</td>
			<td>Several</td>
			<td></td>
			<td>2-3 mL volumen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501223-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SL 8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Erc 5s and Axio 305</td>
			<td>Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1550A Digidata</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>Mini-Protean IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope coupled to fluorescence</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer A1</td>
			<td>Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba</td>
			<td>Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator&#160;</td>
			<td>Grass Instruments&#160;</td>
			<td>S6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath&#160;</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNE-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>808691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free software for electrophoreses analyses</td>
			<td>University of Kentucky</td>
			<td>GelBandFitter v1.7</td>
			<td>http://www.gelbandfitter.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free software for image analysis and morphometry</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ v1.54</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pCLAMP v10.05</td>
			<td>https://www.moleculardevices.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Licensed software for statistical analyses and graphing</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>OriginPro 2019</td>
			<td>https://www.originlab.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intact short, intermediate, and long skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of six hindlimb muscles of mice: beyond flexor digitorum brevis

Fare kaslarının enzimatik ayrışması ile elde edilen iskelet kası lifleri, fizyolojik deneyler için yararlı bir modeldir. Bununla birlikte, çoğu makale, lif türleri ile ilgili sonuçların kapsamını kısıtlayan, mevcut biyolojik materyal miktarını sınırlayan ve hücresel fizyolojik fenomenler ile diğer kaslarda elde edilen önceki biyokimyasal ve dinamik bilgiler arasında açık bir bağlantıyı engelleyen fleksör digitorum brevis'in (FDB) kısa lifleri ile ilgilidir.
Bu makale, farklı lif tipi profillere ve uzunluklara sahip altı kastan sağlam liflerin nasıl elde edileceğini açıklamaktadır. C57BL/6 yetişkin fareleri kullanarak, kas diseksiyonu ve lif izolasyon protokolünü gösteriyoruz ve liflerin Ca2+ geçici çalışmalar için uygunluğunu ve morfometrik karakterizasyonunu gösteriyoruz. Kasların lif tipi bileşimi de sunulmaktadır. Ayrıştığında, tüm kaslar sağlam, 24 saatten fazla hızlı bir şekilde kasılan canlı lifler haline gelir. FDB kısa (<1 mm), peroneus digiti quarti (PDQA) ve peroneus longus (PL) orta (1-3 mm) verirken, ekstansör digitorum longus (EDL), ekstansör hallusis longus (EHL) ve soleus kasları uzun (3-6 mm) lifleri serbest bıraktı.
Hızlı boya Mag-Fluo-4 ile kaydedildiğinde, PDQA, PL ve EHL liflerinin Ca2+ geçişleri, tip IIX ve IIB liflerine karşılık geldiği bilinen tip II (MT-II) morfolojisini anımsatan hızlı, dar kinetik gösterdi. Bu, bu kasların FDB (~% 80) ve soleus (~% 65) ile karşılaştırıldığında% 90'dan fazla tip II liflere sahip olduğu gerçeğiyle tutarlıdır. FDB'nin ötesine geçerek, ilk kez 1 ila 6 mm arasında değişen uzunluklarda lifler oluşturan birkaç kasın ayrışmasını gösteriyoruz. Bu lifler canlıdır ve hızlı Ca2+ geçişleri verir, bu da MT-II'nin kas kaynaklarından bağımsız olarak IIX ve IIB hızlı liflere genelleştirilebileceğini gösterir. Bu sonuçlar, olgun iskelet kası çalışmaları için modellerin kullanılabilirliğini arttırmaktadır.

The mature skeletal muscle of mammals is a multifunctional tissue. It heavily regulates metabolism, is the main source of heat production, and its dynamical properties confer upon it a key role in respiration, movement of body segments, or displacement from one point to another1,2,3. Skeletal muscle is also relevant for the pathophysiology of many illnesses, including inherited and chronic conditions, such as myopathies, dystrophies, or sarcopenia, as well as many non-muscle chronic conditions, such as cardiometabolic diseases3,4,5,6,7,8.
The ex vivo study of the structural and functional properties of mature skeletal muscle in the context of health and disease has been possible mainly through two experimental models: whole muscle and isolated fibers. In the 20th century, researchers exploited the properties of the whole, intact extensor digitorum longus (EDL), soleus, tibialis anterior, and gastrocnemius muscles of different small species as pivotal models to learn about motor units, fiber types, and dynamic properties such as force and kinetics of contraction and relaxation9,10,11,12,13,14,15,16. However, the advent of more refined cell biology studies moved the area toward the study of single muscle fibers. Pioneering work then enabled the isolation of intact flexor digitorum brevis (FDB) fibers of rats by enzymatic dissociation for subsequent characterization17,18,19. Although FDB fibers can also be obtained by manual dissection20, the ease and high throughput of enzymatic dissociation of murine muscles, in addition to their suitability for a variety of experimental approaches, have made the latter model widely used during the last two decades.
The short FDB fibers are suitable for electrophysiological and other biophysical studies, biochemical, metabolic, and pharmacological analyses, electron and fluorescence microscopy experiments, transfection for cell biology approaches, or as a source of stem cells in myogenesis studies5,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. However, using only FDB fibers in muscle experiments narrows the scope of research dealing with fiber types and limits the amount of biological material available for some methodological techniques or for gaining more information from one animal. These limitations hinder a clear correlation of cellular physiological phenomena with previous biochemical and dynamical studies performed in different whole, intact, muscles (e.g., EDL, soleus, peronei).
Overcoming these limitations, some groups succeeded in dissociating the longer EDL and soleus muscles24,33,34,35,36,37,38,39,40, opening the door to further extend the method to other relevant muscles. However, the use of EDL and soleus fibers is still scarce, likely due to the lack of methodological details for getting them as intact fibers. Here, we describe in detail how to isolate fibers of different lengths and types from six muscles: three of them already described (FDB, EDL, and soleus) and three of them successfully dissociated for the first time (extensor hallucis longus [EHL], peroneus longus [PL], and peroneus digiti quarti [PDQA]). The results of the present work confirm that the model of enzymatically dissociated fibers is apt for a wide range of studies and future correlations with previously published data, thus increasing the availability of models for mature skeletal muscle studies.

Yazar Spot Işığı: Lif Tipleri Arasında Uyarma-Kasılma Kuplajını İncelemek için Fare Arka Bacak Kaslarından Uzun Kas Liflerinin İzolasyonu

Farelerin Altı Arka Bacak Kasının Enzimatik Ayrışmasıyla Elde Edilen Sağlam Kısa, Orta ve Uzun İskelet Kası Lifleri: Fleksör Digitorum Brevis'in Ötesinde

Sarkoplazmik Ca2+ seğirme sırasında konsantrasyon Ayrışmış lifler kümesinde fizyolojik deneylerin uygulanabilirliğini göstermek ve uyarma-kasılma eşleşmesi (ECC) ve lif tipleri hakkındaki önceki bulgularımızı genişletmek için, tüm kaslardan liflerde Ca2+ geçişleri elde edildi. İlk olarak, FDB (n = 5) ve EDL (n = 7), morfoloji tip II (MT-II) olarak bilinen Ca2+ kinetik gösterdi. Bunlar, RT'si ~1 ms süren hızlı, dikenli sinyallerdir; bozunma f...

Watch this Scientific Journal Video about Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Yetişkin farelerin altı kasından farklı uzunluk ve tiplerde enzimatik olarak ayrışmış lifler elde etmek için bir protokol tarif ediyoruz: bunlardan üçü daha önce tarif edildi (fleksör digitorum brevis, ekstansör digitorum longus, soleus) ve üçü ilk kez başarılı bir şekilde ayrıştı (ekstansör hallusis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal ...

Bu çalışmada, farelerden altı arka bacak kasından farklı uzunluk ve tipteki lifleri izole etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Ayrıca, uyarma-kasılma bağlantı mekanizmasının incelenmesi ile ilgili fizyolojik deneyler için liflerin uygunluğunu test ettik. Yıllar boyunca, uzun kas lifleri elde etmek zordu, bu da alandaki birçok çalışmanın kapsamını sınırladı.Şimdi, altı milimetreye kadar uzunluklara sahip fare fleksörleri, ekstansörleri ve evertorları ile yağsız lifler elde etmenin mümkün olduğunu gösteriyoruz. Örnek olarak, altı farklı kastan lif elde etmek, morfoloji tip II olarak bilinen kalsiyum geçici kinetiğinin, kas kaynaklarının yeri veya işlevine bakılmaksızın tip IIB ve IIX'e genelleştirilebileceğini göstermemizi sağlamıştır. Enzimatik olarak izole edilmiş liflerin modelinin, biyokimya, fizyoloji, biyofizik, hücre biyolojisi ve moleküler biyoloji aralığındaki mekanik soruları yanıtlamamıza izin veren farklı teknoloji türlerine sahip çeşitli deneysel yaklaşımlar için uygun olduğuna inanıyoruz.

intact-short-intermediate-long-skeletal-muscle-fibers-obtained

Research

JoVE Journal

Biology

Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

970 Görüntüleme.  University of Antioquia. Bu çalışmada, farelerden altı arka bacak kasından farklı uzunluk ve tipteki lifleri izole etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Ayrıca, uyarma-kasılma bağlantı mekanizmasının incelenmesi ile ilgili fizyolojik deneyler için liflerin uygunluğunu test ettik. Yıllar boyunca, uzun kas lifleri elde etmek zordu, bu da alandaki birçok çalışmanın kapsamını sınırladı.Şimdi, altı milimetreye kadar uzunluklara sahip fare fleksörleri, ekstansörleri ve evertorları ile...

Video: Yazar Spot Işığı: Lif Tipleri Arasında Uyarma-Kasılma Kuplajını İncelemek için Fare Arka Bacak Kaslarından Uzun Kas Liflerinin İzolasyonu

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal with the short fibers of the flexor digitorum brevis (FDB), which restrains the scope of results dealing with fiber types, limits the amount of biological material available, and impedes a clear connection between cellular physiological phenomena and previous biochemical and dynamical knowledge obtained in other muscles.
This paper describes how to obtain intact fibers from six muscles with different fiber type profiles and lengths. Using C57BL/6 adult mice, we show the muscle dissection and fiber isolation protocol and demonstrate the suitability of the fibers for Ca2+ transient studies and their morphometric characterization. The fiber type composition of the muscles is also presented. When dissociated, all muscles rendered intact, living fibers that contract briskly for more than 24 h. FDB gave short (&#60;1 mm), peroneus digiti quarti (PDQA) and peroneus longus (PL) gave intermediate (1-3 mm), while extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL), and soleus muscles released long (3-6 mm) fibers.
When recorded with the fast dye Mag-Fluo-4, Ca2+ transients of PDQA, PL, and EHL fibers showed the fast, narrow kinetics reminiscent of the morphology type II (MT-II), known to correspond to type IIX and IIB fibers. This is consistent with the fact that these muscles have over 90% of type II fibers compared with FDB (~80%) and soleus (~65%). Moving beyond FDB, we demonstrate for the first time the dissociation of several muscles, which render fibers spanning a range of lengths between 1 and 6 mm. These fibers are viable and give fast Ca2+ transients, indicating that the MT-II can be generalized to IIX and IIB fast fibers, regardless of their muscle source. These results increase the availability of models for mature skeletal muscle studies.

We describe a protocol to obtain enzymatically dissociated fibers of different lengths and types from six muscles of adult mice: three of them already described (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) and three of them successfully dissociated for the first time (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).