עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של סין (82070450 ל- C.T.and 82170466 ל- L.Z.) ומלגת הקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (7121102223 ל- F.L).

כל נהלי בעלי החיים המתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סוצ'ו.
1. ריאגנטים והכנת חומרים
<ol><li>השתמשו ב-1x PBS ללא סידן ומגנזיום וב-2.5 U/mL הפרין נתרן מלח להכנת תמיסת הזילוח. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C, ולהתקרר מראש על קרח בעת השימוש.</li>
	<li>הכינו מגיב דיסוציאציה A המכיל 125 CDU/mL collagenase II ו-60 U/mL DNase I על ידי דילול 1250 CDU/mL collagenase II ו-3000 U/mL DNase I עם HBSS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.</li>
	<li>הכינו מגיב דיסוציאציה B המכיל ריכוז סופי של 0.12% טריפסין על ידי דילול 1 מ"ל של 0.25% טריפסין ללא EDTA (ללא פנול אדום) לתוך 1 מ"ל של 1x PBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.</li>
	<li>הכינו 10 מ"ל של 1.5% FBS ו-10 מ"ל של 5% FBS ב-1x PBS. יש להשתמש ב-1.5% FBS לבריכות עורקי התרדמה ולשמור על קרח לפני השימוש. השתמש ב-5% FBS כדי לנטרל את העיכול ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>קבל את החומרים הניסיוניים, כולל מזרקים 1 מ"ל, מזרקים 20 מ"ל עם מחטים 26-G, צלחות תרבית תאים שש בארות, צינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל, מסננות תאים סטריליים 40 מיקרומטר ומכלי קרח.</li>
</ol>2. הכנת ציוד
<ol><li>לעקר את כל ציוד הניתוח, כולל מיקרוסקופ סטריאוסקופי, מספריים מנתחים, מספריים לניתוח מיקרו ומלקחיים עדינים.</li>
	<li>הפעל את מונה התאים האוטומטי ותחזק אותו ב- RT.</li>
	<li>הפעל את אמבט המים ל 37 מעלות צלזיוס מראש.</li>
	<li>מצננים מראש את המיקרוצנטריפוגה ל-4°C לפני השימוש.</li>
</ol>3. בידוד עורק התרדמה של העכבר
<ol><li>מרדימים את העכבר באמצעות 1.25% tribromoethanol על ידי הזרקה intraperitoneal (0.24 מ"ל עבור כל 10 גרם של משקל גוף) ולהפוך את העכבר כדי לבדוק אם יש רפלקס ימין לאחר 3 דקות. לאחר מכן, להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם ולהניח אותו על גבו. רססו את עור העכבר ב-75% אלכוהול.</li>
	<li>השתמש מספריים ניתוח מעוקר כדי לפתוח את העור ולחשוף את חלל החזה. פתח את הסרעפת.</li>
	<li>ממשיכים לחתוך כלפי מעלה ללסת התחתונה ומסירים בזהירות עודפי רקמות חיבור ושומן, תוך חשיפת עורק התרדמה.</li>
	<li>חותכים את הווריד הנבוב התחתון של העכבר כדי לגרום לדם לזרום מתוך מחזור הדם הסגור.</li>
	<li>להזריק 20 מ"ל של פתרון זילוח prechilled לתוך החדר השמאלי עם מזרק לאט וברציפות. הערה: אם הזלוף מצליח, איברים עשירים בדם כגון הכבד, הטחול והכליות יהפכו אפורים-לבנים.</li>
	<li>מקלפים את כל השומן ורקמות החיבור סביב עורק התרדמה בעזרת מספריים לניתוח מיקרו תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. הערה: שלב זה צריך להיעשות לאט ובזהירות כדי למנוע נזק לעורק התרדמה.</li>
	<li>בודדו את עורק התרדמה מהעכבר, שטפו עם 1x PBS כדי לשטוף שוב את הדם, והעבירו לצלחות של שש בארות המכילות 1.5% FBS על קרח.</li>
</ol>4. עיכול עורק התרדמה לתרחיף חד תאי
<ol><li>השתמש מספריים micro-dissecting לנתח את עורק התרדמה לאורך, ושכב שטוח על צלחת תרבית תאים אחרת 6 בארות המכילה 1 מ"ל של 1.5% FBS על קרח.</li>
	<li>שטפו את האינטימה בזהירות עם 1.5% FBS כדי להסיר את שאריות הדם. הערה: השטיפה צריכה להיות עדינה ואיטית כדי למנוע פגיעה בתאי אנדותל.</li>
	<li>חתכו כל עורק התרדמה לכ-2 מ"מ2 חתיכות רקמה באמצעות מספריים מיקרו-דיסקרטיים ב-1.5% FBS.</li>
	<li>מעבירים את חתיכות הרקמה הללו לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם קצוות נשא ברוחב 1 מ"ל, צנטריפוגה ב 400 x גרם למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לשקוע את הרקמות לתחתית.</li>
	<li>להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את הרקמות ב 500 μL של מגיב דיסוציאציה A.</li>
	<li>הניחו את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת. פיפטה בעדינות עם פיפטה 1 מ"ל כל 10 דקות.</li>
	<li>הוסף 500 μL של 5% FBS לתוך הצינור ומערבבים היטב עם פיפטה 1 מ"ל.</li>
	<li>סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים סטרילית בגודל 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל וצנטריפוגה במהירות 400 x גרם למשך 5 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר את supernatant בזהירות להשעות מחדש את גלולת התא ב 200 μL של מגיב דיסוציאציה B.</li>
	<li>הכניסו לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C ועיכלו במשך 5 דקות נוספות. יש למרוח פיפטה בעדינות כל 2 דקות במהלך העיכול כדי לנתק לחלוטין לתרחיף חד-תאי.</li>
	<li>השתמש 200 μL של 5% FBS כדי לסיים את תגובת העיכול, וצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של 1x PBS על קרח.</li>
</ol>5. בדיקת תרחיף תאים וריצוף RNA חד-תאי
<ol><li>הוסף 10 μL של תמיסת AO/PI לתוך 10 μL של תרחיף חד-תאי וערבב בעדינות עם פיפטה של 20 μL.</li>
	<li>פיפטה 20 μL של התערובת לתוך שקופית התא ולחכות 1 דקה.</li>
	<li>טען את השקופית במכשיר מונה התאים האוטומטי.</li>
	<li>בחר את בדיקת הכדאיות של AO/PI ולאחר מכן המתן לדוח האיכות.</li>
	<li>השתמש בערכת מגיב 3ʹ חד-תאי כדי ליצור חרוזי ג'ל חד-תאיים בתחליב על בקר חד-תאי ולהגביר את cDNA המקודד במחזור תרמי בהתאם לפרוטוקול היצרן. הערה: כאן, Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3 שימש.</li>
	<li>בצע רצף על רצף עם אסטרטגיית קריאה של 150 bp (PE150) מקצה זוגי. השתמש ביישום תוכנה (Cell Ranger) כדי להמיר קבצי קריאת בסיס גולמיים לקבצי fastq באמצעות צינור mkfastq . לאחר מכן, השתמש בצינור הספירה של Cell Ranger לביצוע יישור, סינון, ספירת ברקוד וספירת מזהים מולקולריים ייחודיים (UMI) כדי ליצור מטריצות ברקוד13.</li>
	<li>בצע הפחתת ממדיות נתונים והדמיה חזותית עם חבילת R Seurat14.<ol><li>ראשית, הפונקציה Read10X() של Seurat קוראת בפלט של צינור Cell Ranger ולאחר מכן משתמשת במטריצת הספירה כדי ליצור אובייקט Seurat. לאחר מכן, סנן את התאים עם ביטוי של <200 או >4000 גנים או יחס גנים מיטוכונדריאלי שהיה יותר מ -10% על ידי תת-קבוצה () פונקציה של Seurat.</li>
		<li>השתמש ב- NormalizeData () וב- FindVariableFeatures() כדי לנרמל את הנתונים ולזהות 2000 תכונות משתנות מאוד, בהתאמה.</li>
		<li>בצע ניתוח רכיבים ראשי (PCA) על הנתונים שקנה המידה שלהם השתנה, וקבץ את התאים באשכולות עם dims = 30 ורזולוציה = 0.5. לבסוף, השתמש בפונקציה RunUMAP () כדי להציג באופן חזותי את ערכות הנתונים של תא בודד ובפונקציה FindAllMarkers() כדי למצוא כל סמן ביולוגי של אשכול.</li>
	</ol></li>
</ol>

עיכול תאים דו-שלבי של עורק התרדמה של עכבר

<ol>
	<li>Lee, D. -. Y., Chiu, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+flow:+roles+of+epigenetic+modulation+in+vascular+endothelium.">Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium.</a> Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).</li><li>Libby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications:+A+brief+overview.">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+maps+endothelial+metabolic+plasticity+in+pathological+angiogenesis.">Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).</li><li>Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+gained+from+single-cell+analysis+of+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment.">Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment.</a> Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).</li><li>Sun, H., Xu, X., Deng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single+epithelial+cells+suspension+from+mouse+mammary+glands.">Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands.</a> Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).</li><li>Korin, B., Chung, J. -. J., Avraham, S., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+of+mouse+glomeruli+for+high-throughput+analysis.">Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis.</a> Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).</li><li>Thomson, B., Quaggin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+single+cell+suspension+from+the+murine+iridocorneal+angle.">Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle.</a> Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).</li><li>Leale, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-stage+digestion+of+whole+murine+knee+joints+for+single-cell+RNA+sequencing.">A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).</li><li>Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+aorta.">Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta.</a> Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+dissociator.">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).</li><li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+UMI-based+single-cell+RNA-seq+preprocessing+workflows.">Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows.</a> Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Depuydt, M. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanatomy+of+the+human+atherosclerotic+plaque+by+single-cell+transcriptomics.">Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics.</a> Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).</li><li>Gao, X. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+of+the+rat+carotid+arteries+uncovers+potential+cellular+targets+of+neointimal+hyperplasia.">Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+the+lumen+of+mouse+carotid+arteries+for+single-cell+multi-omics+experiments.">Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט להכנת תרחיף חד-תאי איכותי מעורק התרדמה של עכברי בר, שבו נבנתה שיטת עיכול דו-שלבית המשלבת את תהליך העיכול של collagenase/DNase וטריפסין. לאחר בדיקת האיכות של ההשעיה של תא בודד, מצאנו כי הוא עונה על הדרישות לריצוף תא בודד, עם כדאיות של תאים מעל 85% וריכוז תאים גבוה. יתר על כ?...

טרשת עורקים היא מחלה דלקתית כרונית הקשורה לגורמי סיכון כגון לחץ דם גבוה, היפרליפידמיה, והמודינמיקה1. התפצלויות בעורק התרדמה מועדות לשינויים המודינמיים ומובילות להיווצרות רובד התרדמה. ההצגה הקלינית של טרשת עורקים קרוטיד יכולה להיות חריפה כגון שבץ מוחי ואיסכמיה מוחית חולפת, או כרונית כגון איסכמיה מוחית חולפת חוזרת ודמנציה וסקולרית2. מבחינה מכנית, רובד התרדמה הוא תוצאה של אינטראקציה בין תאי דופן כלי דם שונים ותאי דם שונים בתנאים פתולוגיים. לכן, חשיפת האטלס החד-תאי של כלי התרדמה בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים חשובה במיוחד למניעה וטיפול בהתפתחות פלאק התרדמה.
ריצוף RNA חד-תאי הוא אחת הטכנולוגיות החזקות ביותר של המחקר הביולוגי בגלל הרזולוציה הגבוהה במיוחד שלו וזיהוי הטרוגניות התא מאותו סוג תא של אורגניזמים 3,4. חוקרים השתמשו בריצוף RNA חד-תאי כדי לערוך מחקרים בתחומים רבים, כגון מחלות לב וכלי דם5 וסרטן6. עם זאת, הפרדה מהירה ומדויקת של רקמות לתאים בודדים היא עדיין אחד האתגרים העיקריים. דיסוציאציה אנזימטית היא שיטה נפוצה הכוללת בעיקר קולגנאז, פפאין, טריפסין, DNase והיאלורונידאז. בפרט, collagenases הם מיני האנזימים העיקריים לעיכול של תא יחיד, בעיקר הידרוליזה של רכיבי קולגן ברקמות חיבור. סוגים שונים של collagenase ישימים לדיסוציאציה של רקמות שונות, כגון בלוטת החלב7, גלומרולוס8, זווית אירידוקרנית9, מפרק הברך 10, אבי העורקים11 וריאה12. בשל התכונות הפיזיולוגיות הייחודיות של רקמות שונות, דיסוציאציה באותה שיטה עלולה לגרום לבעיות רבות ברכישת תאים בודדים, כגון כדאיות נמוכה של תאים, מספר תאים נמוך ופסולת תאים גדולים. לכן, המצאת שיטות העיכול לרקמות שונות חיונית להכנת תרחיפים חד-תאיים באיכות גבוהה.
פרוטוקול זה נועד לפתח שיטת עיכול תאים דו-שלבית להכנת תרחיף חד-תאי של עורק התרדמה של עכברי בר. בהתאם למאפיינים של עורק התרדמה, שילבנו collagenase/DNase עם טריפסין כדי לקבל תרחיף חד-תאי באיכות גבוהה של עורק התרדמה של עכבר, מכיוון ש-collagenase יכול לבצע הידרוליזה של קולגן ברקמות התרדמה, אשר התעכל עוד יותר על-ידי טריפסין לתרחיף חד-תאי. ספירת פלואורסצנטיות כפולה של Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) שימשה לזיהוי כדאיות התא וריכוזו, ונמצא כי התרחיף החד-תאי עונה על הדרישות לריצוף תא יחיד, עם כדאיות של תאים מעל 85% וריכוז תאים גבוה. לאחר עיבוד נתונים של תא בודד, ארבעה סוגי תאים, כולל תאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs), פיברובלסטים, תאי אנדותל (ECs), מקרופאגים ותאים דנדריטיים (Mφ/DCs), זוהו בעורקי התרדמה הרגילים של עכברים לאחר העיכול. היתרונות של פרוטוקול זה הם: 1) ניתן לזהות סוגי תאים מרובים בעורק התרדמה, 2) כדאיות התא נשמרת היטב, 3) ניתן לחזור עליו בקלות ללא ציוד מיוחד. פרוטוקול זה מתאים לחוקרים המעוניינים לחקור מולטיומיקה חד-תאית של עורקי התרדמה בעכבר. פרוטוקול זה עשוי גם להיות מועיל בדיסוציאציה של כלי דם אחרים עם שינויים מתאימים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% EDTA-free trypsin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0205</td>
			<td>Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl saline solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST341</td>
			<td>Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>&#160;SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r009</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211W</td>
			<td>To centrifuge the tissue piece and cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r013</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>css010040</td>
			<td>To filter undigested tissue fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI kit</td>
			<td>Hengrui Biological</td>
			<td>RE010212</td>
			<td>To identify whether the cell is alive or dead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>Mira FL</td>
			<td>To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger software</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>3.0.2</td>
			<td>To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39;Reagent Kits v3</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>1000075</td>
			<td>To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td>Termination of the digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Store at the room temperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>H8060</td>
			<td>Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002560</td>
			<td>Applied for spining down the tissues and cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1000</td>
			<td>Used for cardiac perfusion and resuspension of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat package- R</td>
			<td>Satija Lab</td>
			<td>3.1.2</td>
			<td>To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well cell culture plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>703002</td>
			<td>Place the vascular tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S22</td>
			<td>Keep the digestion temperature at 37 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a single-cell suspension from mouse carotid arteries for single-cell sequencing

עורקי התרדמה הם כלי דם מרכזיים בצוואר המספקים דם וחמצן למוח, אך היצרות התרדמה מתרחשת כאשר עורקי התרדמה נסתמים על ידי פלאק. חשיפת ההרכב התאי של עורק התרדמה ברמת התא הבודד חיונית לטיפול בטרשת עורקים של התרדמה. עם זאת, אין פרוטוקול מוכן לשימוש להכנת מתלים חד-תאיים מעורקי התרדמה. כדי לקבל פרוטוקול מתאים לדיסוציאציה של עורקי התרדמה הרגילים ברמת התא הבודד עם פחות נזק לתאים, תכננו שיטת עיכול דו-שלבית על ידי שילוב תהליך העיכול של collagenase/DNase וטריפסין. ספירת פלואורסצנטיות כפולה של Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) שימשה לזיהוי כדאיות התא וריכוזו, ונמצא כי התרחיף החד-תאי עונה על הדרישות לריצוף תא יחיד, עם כדאיות של תאים מעל 85% וריכוז תאים גבוה. לאחר עיבוד נתונים של תא בודד, חציון של ~2500 תעתיקים לכל תא זוהו בכל תא עורק התרדמה. יש לציין כי מגוון סוגי תאים של עורק התרדמה התקין, כולל תאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs), פיברובלסטים, תאי אנדותל (ECs), מקרופאגים ותאים דנדריטיים (Mφ/DCs), היו ניתנים לגילוי בו זמנית. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם להכנת תרחיף חד תאי של כלי דם מרקמות אחרות עם שינויים מתאימים.

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease associated with risk factors such as high blood pressure, hyperlipidemia, and hemodynamics1. Carotid artery bifurcations are prone to hemodynamic changes and lead to carotid plaque formation. The clinical presentation of carotid atherosclerosis can be acute such as stroke and transient cerebral ischemia, or chronic such as recurrent transient cerebral ischemia and vascular dementia2. Mechanically, carotid plaque is the outcome of the interaction between different vessel wall cells and various blood cells under pathological conditions. Therefore, revealing the single-cell atlas of carotid vessels under physiological and pathological conditions is particularly important for preventing and treating carotid plaque development.
Single-cell RNA sequencing is one of the most powerful technologies of biological research because of its ultrahigh resolution and detection of cell heterogeneity from the same cell type of organisms3,4. Researchers have used single-cell RNA sequencing to conduct research in many fields, such as cardiovascular disease5 and cancer6. However, quickly and accurately separating tissues into single cells is still one of the main challenges. Enzymatic dissociation is a commonly used method that dominantly includes collagenase, papain, trypsin, DNase, and hyaluronidase. Specifically, collagenases are the major enzyme species for single-cell digestion, mainly hydrolyzing collagen components in connective tissues. Different collagenase types are applicable for the dissociation of different tissues, such as the mammary gland7, glomerulus8, iridocorneal angle9, knee joint10, aorta11, and lung12. Due to the unique physiological properties of different tissues, dissociation using the same method may cause many troubles in acquiring single cells, such as low cell viability, low cell number, and large cell debris. Therefore, the invention of digestion methods for different tissues is essential for preparing high-quality single-cell suspensions.
This protocol aims to develop a two-step cell digestion method to prepare a single-cell suspension of the carotid artery of wild-type mice. According to the characteristics of the carotid artery, we combined collagenase/DNase with trypsin to obtain a high-quality single-cell suspension of the mouse carotid artery because collagenase can hydrolyze collagen of the carotid tissues, which was further digested by trypsin into a single-cell suspension. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) dual-fluorescence counting was used to detect cell viability and concentration, and it was found that the single-cell suspension satisfied the requirements for single-cell sequencing, with the viability of cells over 85% and a high cell concentration. After single-cell data processing, four cell types, including vascular smooth muscle cells (VSMCs), fibroblasts, endothelial cells (ECs), and macrophages and dendritic cells (M&#966;/DCs), were identified in normal mouse carotid arteries after digestion. The advantages of this protocol are that: 1) multiple cell types in the carotid artery can be identified, 2) cell viability is well preserved, and 3) it can be easily repeated without special equipment. This protocol is suitable for researchers who are interested in studying single-cell multiomics of the mouse carotid arteries. This protocol may also be helpful in the dissociation of other blood vessels with appropriate modifications.

Author Spotlight: Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy 

הכנת תרחיף חד-תאי מעורקי התרדמה של העכבר לריצוף חד-תאי

Low solubility and the larger cell debrief are the main difficulties of vascular tissue dissociation. Our two steps or digestion method is very suitable for carotid tissue dissociation and may be used to prepare single cell suspicions for other vessels with minor modifications, making it very helpful in cardiovascular research. This protocol is suitable for obtaining multiple cell types in the carotid artery, and it can be easily repeated without special equipment.In the future, we aim to use cell subclasses discovered by single cell ion sequencing for targeted therapy of cardiovascular disease.

פרוטוקול זה מתאר שיטת עיכול תאים דו-שלבית להכנת תרחיף חד-תאי של עורקי התרדמה של עכברים (איור 1). שיטת עיכול תאים דו-שלבית זו משלבת collagenase/DNase עם טריפסין כדי לנתק ביעילות את דופן כלי התרדמה של העכבר כדי להשיג מתלים חד-תאיים באיכות גבוהה לריצוף תא יחיד. לאחר הדיסוציאציה, ריכוז הת...

Watch this Scientific Journal Video about Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy at JoVE.com

כאן אנו מתארים פרוטוקול עיכול תאים דו-שלבי להכנת תרחיף חד-תאי של עורקי התרדמה של עכברים.

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...

מסיסות נמוכה ותחקיר תאים גדול יותר הם הקשיים העיקריים של דיסוציאציה של רקמת כלי הדם. שיטת שני השלבים או העיכול שלנו מתאימה מאוד לדיסוציאציה של רקמת התרדמה וניתן להשתמש בה להכנת חשדות לתאים בודדים עבור כלי דם אחרים עם שינויים קלים, מה שהופך אותה למועילה מאוד במחקר לב וכלי דם. פרוטוקול זה מתאים להשגת סוגי תאים מרובים בעורק התרדמה, וניתן לחזור עליו בקלות ללא ציוד מיוחד.בעתיד, אנו שואפים להשתמש בתת-קבוצות תאים שהתגלו על ידי ריצוף יונים של תא בודד לטיפול ממוקד במחלות לב וכלי דם.

preparation-single-cell-suspension-from-mouse-carotid-arteries-for

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

2.0K Views.  Soochow University. מסיסות נמוכה ותחקיר תאים גדול יותר הם הקשיים העיקריים של דיסוציאציה של רקמת כלי הדם. שיטת שני השלבים או העיכול שלנו מתאימה מאוד לדיסוציאציה של רקמת התרדמה וניתן להשתמש בה להכנת חשדות לתאים בודדים עבור כלי דם אחרים עם שינויים קלים, מה שהופך אותה למועילה מאוד במחקר לב וכלי דם...

Video: Author Spotlight: Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy 

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are clogged by plaque. Revealing the cellular composition of the carotid artery at the single-cell level is essential for treating carotid atherosclerosis. However, there is no ready-to-use protocol for the preparation of single-cell suspensions from carotid arteries. To obtain a suitable protocol for the dissociation of normal carotid arteries at the single-cell level with less damage to cells, we designed a two-step digestion method by integrating the digestion process of collagenase/DNase and trypsin. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) dual-fluorescence counting was used to detect cell viability and concentration, and it was found that the single-cell suspension satisfied the requirements for single-cell sequencing, with the viability of cells over 85% and a high cell concentration. After single-cell data processing, a median of ~2500 transcripts per cell were detected in each carotid artery cell. Notably, a variety of cell types of the normal carotid artery, including vascular smooth muscle cells (VSMCs), fibroblasts, endothelial cells (ECs), and macrophages and dendritic cells (M&#966;/DCs), were concurrently detectable. This protocol may be applied to prepare a single-cell suspension of blood vessels from other tissues with appropriate modifications.

Here we describe a two-step cell digestion protocol for preparing a single-cell suspension of mouse carotid arteries.