Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Natural Science Foundation of China (82070450 a C.T. e 82170466 a L.Z.) e dalla borsa di studio della China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 a F.L.).

Tutte le procedure sugli animali descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Soochow.
1. Preparazione di reagenti e materiali
<ol><li>Utilizzare 1x PBS senza calcio e magnesio e 2,5 U/mL di sale sodico di eparina per preparare la soluzione di perfusione. Conservare a 4 °C e preraffreddare su ghiaccio al momento dell'uso.</li>
	<li>Preparare il reagente di dissociazione A che contenga 125 CDU/mL collagenasi II e 60 U/mL DNasi I diluendo 1250 CDU/mL collagenasi II e 3000 U/mL DNasi I con HBSS. Conservare a 4 °C fino al momento dell'utilizzo.</li>
	<li>Preparare il reagente di dissociazione B che contenga una concentrazione finale di tripsina dello 0,12% diluendo 1 mL di tripsina senza EDTA allo 0,25% (senza rosso fenolo) in 1 mL di PBS 1x. Conservare a 4 °C fino al momento dell'utilizzo.</li>
	<li>Preparare 10 mL di FBS all'1,5% e 10 mL di FBS al 5% in 1x PBS. Utilizzare l'1,5% di FBS per raggruppare le arterie carotidi e mantenere il ghiaccio prima dell'uso. Utilizzare FBS al 5% per neutralizzare la digestione e conservare a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Procuratevi i materiali sperimentali, tra cui siringhe da 1 mL, siringhe da 20 mL con aghi da 26 G, piastre per colture cellulari a sei pozzetti, provette da centrifuga da 1,5 mL, filtri per cellule sterili da 40 μm e contenitori per il ghiaccio.</li>
</ol>2. Preparazione dell'attrezzatura
<ol><li>Sterilizzare tutte le attrezzature chirurgiche, tra cui un microscopio stereoscopico, forbici da dissezione, forbici da micro-dissezione e pinze a punta fine.</li>
	<li>Attivare il contatore automatico di cellule e mantenerlo a RT.</li>
	<li>Accendere il bagnomaria a 37 °C in anticipo.</li>
	<li>Preraffreddare la microcentrifuga a 4 °C prima dell'uso.</li>
</ol>3. Isolamento dell'arteria carotide del topo
<ol><li>Anestetizzare il topo utilizzando tribromoetanolo all'1,25% mediante iniezione intraperitoneale (0,24 ml per ogni 10 g di peso corporeo) e capovolgere il topo per verificare se c'è un riflesso di raddrizzamento dopo 3 minuti. Quindi, sopprimere il topo con lussazione cervicale e adagiarlo sulla schiena. Spruzzare la pelle del topo con alcol al 75%.</li>
	<li>Usa forbici da dissezione sterilizzate per aprire la pelle ed esporre la cavità toracica. Aprire il diaframma.</li>
	<li>Continuare a tagliare verso l'alto fino alla mascella inferiore e rimuovere con cura i tessuti connettivi e il grasso in eccesso, esponendo l'arteria carotide.</li>
	<li>Taglia la vena cava inferiore del topo per far defluire il sangue dalla circolazione chiusa.</li>
	<li>Iniettare 20 mL di soluzione di perfusione preraffreddata nel ventricolo sinistro con una siringa lentamente e continuamente. NOTA: Se la perfusione ha successo, gli organi ricchi di sangue come il fegato, la milza e i reni diventeranno grigio-bianchi.</li>
	<li>Staccare tutti i tessuti adiposi e connettivi intorno all'arteria carotide con forbici da micro-dissezione al microscopio stereoscopico. NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito lentamente e con attenzione per evitare danni all'arteria carotide.</li>
	<li>Isolare l'arteria carotide dal topo, lavare con 1x PBS per lavare nuovamente il sangue e trasferire in piastre a sei pozzetti contenenti l'1,5% di FBS su ghiaccio.</li>
</ol>4. Digestione dell'arteria carotide in sospensione unicellulare
<ol><li>Utilizzare forbici da micro-dissezione per sezionare longitudinalmente l'arteria carotide e distenderla in un'altra piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti contenente 1 ml di FBS all'1,5% su ghiaccio.</li>
	<li>Sciacquare accuratamente l'intima con FBS all'1,5% per rimuovere il sangue residuo. NOTA: Il lavaggio deve essere delicato e lento per evitare di danneggiare le cellule endoteliali.</li>
	<li>Tagliare ciascuna arteria carotide in circa 2 mm2 pezzi di tessuto utilizzando forbici da microdissezione in FBS all'1,5%.</li>
	<li>Trasferire questi pezzi di tessuto in una provetta da centrifuga da 1,5 mL con punte larghe da 1 mL, centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C per affondare i tessuti sul fondo.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere i tessuti in 500 μL di reagente di dissociazione A.</li>
	<li>Mettere il tubo a bagnomaria a 37 °C per 1 h. Pipettare delicatamente con una pipetta da 1 mL ogni 10 min.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di FBS al 5% nella provetta e mescolare bene con una pipetta da 1 mL.</li>
	<li>Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare sterile da 40 μm in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 μL di reagente di dissociazione B.</li>
	<li>Mettere a bagnomaria a 37 °C e digerire per altri 5 minuti. Pipettare delicatamente ogni 2 minuti durante la digestione per dissociarsi completamente in una sospensione unicellulare.</li>
	<li>Utilizzare 200 μL di FBS al 5% per terminare la reazione di digestione e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 μL di 1x PBS su ghiaccio.</li>
</ol>5. Esame della sospensione cellulare e sequenziamento dell'RNA a singola cellula
<ol><li>Aggiungere 10 μL di soluzione AO/PI in 10 μL di sospensione unicellulare e miscelare delicatamente con una pipetta da 20 μL.</li>
	<li>Pipettare 20 μL di miscela nel vetrino della camera e attendere 1 minuto.</li>
	<li>Caricare il vetrino nello strumento contatore automatico di cellule.</li>
	<li>Selezionare il test di vitalità AO/PI , quindi attendere il rapporto di qualità.</li>
	<li>Utilizzare un kit di reagenti 3ʹ a cellula singola per generare perle di gel unicellulare nell'emulsione su un controller a cellula singola e amplificare il cDNA con codice a barre in un termociclatore seguendo il protocollo del produttore. NOTA: In questo caso è stato utilizzato il kit di reagenti 3 a cella singola di cromo v3.</li>
	<li>Eseguire il sequenziamento su un sequencer con una strategia di lettura a 150 bp (PE150) a due estremità. Utilizzare un'applicazione software (Cell Ranger) per convertire i file di chiamata di base non elaborati in file fastq utilizzando la pipeline mkfastq . Quindi, utilizzare la pipeline di conteggio di Cell Ranger per eseguire l'allineamento, il filtraggio, il conteggio dei codici a barre e il conteggio degli identificatori molecolari univoci (UMI) per generare matrici di codici a barre feature13.</li>
	<li>Esegui la riduzione e la visualizzazione della dimensionalità dei dati con il pacchetto R Seurat14.<ol><li>Innanzitutto, la funzione Read10X() di Seurat legge l'output della pipeline Cell Ranger e quindi utilizza la matrice di conteggio per creare un oggetto Seurat. Quindi, filtrare le cellule con l'espressione di <200 o >4000 geni o un rapporto genico mitocondriale superiore al 10% dalla funzione subset() di Seurat.</li>
		<li>Utilizzare NormalizeData () e FindVariableFeatures() per normalizzare i dati e identificare rispettivamente 2000 feature altamente variabili.</li>
		<li>Eseguire l'analisi delle componenti principali (PCA) sui dati scalati e raggruppare le celle con dims = 30 e risoluzione = 0,5. Infine, utilizzare la funzione RunUMAP () per visualizzare i set di dati a cella singola e FindAllMarkers() per trovare ogni biomarcatore del cluster.</li>
	</ol></li>
</ol>

Digestione cellulare in due fasi dell'arteria carotide di topo

<ol>
	<li>Lee, D. -. Y., Chiu, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+flow:+roles+of+epigenetic+modulation+in+vascular+endothelium.">Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium.</a> Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).</li><li>Libby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications:+A+brief+overview.">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+maps+endothelial+metabolic+plasticity+in+pathological+angiogenesis.">Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).</li><li>Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+gained+from+single-cell+analysis+of+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment.">Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment.</a> Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).</li><li>Sun, H., Xu, X., Deng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single+epithelial+cells+suspension+from+mouse+mammary+glands.">Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands.</a> Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).</li><li>Korin, B., Chung, J. -. J., Avraham, S., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+of+mouse+glomeruli+for+high-throughput+analysis.">Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis.</a> Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).</li><li>Thomson, B., Quaggin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+single+cell+suspension+from+the+murine+iridocorneal+angle.">Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle.</a> Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).</li><li>Leale, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-stage+digestion+of+whole+murine+knee+joints+for+single-cell+RNA+sequencing.">A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).</li><li>Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+aorta.">Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta.</a> Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+dissociator.">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).</li><li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+UMI-based+single-cell+RNA-seq+preprocessing+workflows.">Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows.</a> Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Depuydt, M. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanatomy+of+the+human+atherosclerotic+plaque+by+single-cell+transcriptomics.">Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics.</a> Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).</li><li>Gao, X. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+of+the+rat+carotid+arteries+uncovers+potential+cellular+targets+of+neointimal+hyperplasia.">Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+the+lumen+of+mouse+carotid+arteries+for+single-cell+multi-omics+experiments.">Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Qui forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dall'arteria carotide di topi wild-type, in cui è stato costruito un metodo di digestione in due fasi che integra il processo di digestione della collagenasi/DNasi e della tripsina. Dopo il controllo di qualità della sospensione a singola cellula, abbiamo scoperto che soddisfaceva i requisiti per il sequenziamento a singola cellula, con una vitalità delle cellule superiore all'85% e un'elevata concentrazione cel...

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica associata a fattori di rischio come l'ipertensione, l'iperlipidemia e l'emodinamica1. Le biforcazioni dell'arteria carotide sono soggette a cambiamenti emodinamici e portano alla formazione di placche carotidi. La presentazione clinica dell'aterosclerosi carotidea può essere acuta, come ictus e ischemia cerebrale transitoria, o cronica, come ischemia cerebrale transitoria ricorrente e demenza vascolare2. Meccanicamente, la placca carotidea è il risultato dell'interazione tra diverse cellule della parete dei vasi e varie cellule del sangue in condizioni patologiche. Pertanto, rivelare l'atlante unicellulare dei vasi carotidei in condizioni fisiologiche e patologiche è particolarmente importante per prevenire e trattare lo sviluppo della placca carotidea.
Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula è una delle tecnologie più potenti della ricerca biologica grazie alla sua altissima risoluzione e al rilevamento dell'eterogeneità cellulare dallo stesso tipo di cellule di organismi 3,4. I ricercatori hanno utilizzato il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per condurre ricerche in molti campi, come le malattie cardiovascolari5 e il cancro6. Tuttavia, separare in modo rapido e accurato i tessuti in singole cellule è ancora una delle sfide principali. La dissociazione enzimatica è un metodo comunemente usato che include prevalentemente collagenasi, papaina, tripsina, DNasi e ialuronidasi. In particolare, le collagenasi sono le principali specie enzimatiche per la digestione unicellulare, principalmente idrolizzando i componenti del collagene nei tessuti connettivi. Diversi tipi di collagenasi sono applicabili per la dissociazione di diversi tessuti, come la ghiandola mammaria7, il glomerulo8, l'angolo iridocorneale9, l'articolazione del ginocchio10, l'aorta 11 e il polmone12. A causa delle proprietà fisiologiche uniche dei diversi tessuti, la dissociazione con lo stesso metodo può causare molti problemi nell'acquisizione di singole cellule, come bassa vitalità cellulare, basso numero di cellule e detriti cellulari di grandi dimensioni. Pertanto, l'invenzione di metodi di digestione per diversi tessuti è essenziale per preparare sospensioni unicellulari di alta qualità.
Questo protocollo mira a sviluppare un metodo di digestione cellulare in due fasi per preparare una sospensione unicellulare dell'arteria carotide di topi wild-type. In base alle caratteristiche dell'arteria carotide, abbiamo combinato la collagenasi/DNasi con la tripsina per ottenere una sospensione unicellulare di alta qualità dell'arteria carotide del topo perché la collagenasi può idrolizzare il collagene dei tessuti carotidi, che è stato ulteriormente digerito dalla tripsina in una sospensione unicellulare. Per rilevare la vitalità e la concentrazione delle cellule è stato utilizzato il conteggio a doppia fluorescenza di arancia acridina/ioduro di propidio (AO/PI) ed è stato riscontrato che la sospensione a singola cellula soddisfaceva i requisiti per il sequenziamento a singola cellula, con una vitalità delle cellule superiore all'85% e un'elevata concentrazione cellulare. Dopo l'elaborazione dei dati a singola cellula, quattro tipi di cellule, tra cui cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), fibroblasti, cellule endoteliali (EC) e macrofagi e cellule dendritiche (Mφ/DC), sono stati identificati nelle arterie carotidi di topo normali dopo la digestione. I vantaggi di questo protocollo sono che: 1) è possibile identificare più tipi di cellule nell'arteria carotide, 2) la vitalità cellulare è ben preservata e 3) può essere facilmente ripetuto senza apparecchiature speciali. Questo protocollo è adatto ai ricercatori interessati a studiare la multiomica a singola cellula delle arterie carotidi di topo. Questo protocollo può anche essere utile nella dissociazione di altri vasi sanguigni con opportune modifiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% EDTA-free trypsin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0205</td>
			<td>Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl saline solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST341</td>
			<td>Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>&#160;SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r009</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211W</td>
			<td>To centrifuge the tissue piece and cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r013</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>css010040</td>
			<td>To filter undigested tissue fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI kit</td>
			<td>Hengrui Biological</td>
			<td>RE010212</td>
			<td>To identify whether the cell is alive or dead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>Mira FL</td>
			<td>To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger software</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>3.0.2</td>
			<td>To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39;Reagent Kits v3</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>1000075</td>
			<td>To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td>Termination of the digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Store at the room temperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>H8060</td>
			<td>Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002560</td>
			<td>Applied for spining down the tissues and cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1000</td>
			<td>Used for cardiac perfusion and resuspension of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat package- R</td>
			<td>Satija Lab</td>
			<td>3.1.2</td>
			<td>To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well cell culture plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>703002</td>
			<td>Place the vascular tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S22</td>
			<td>Keep the digestion temperature at 37 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a single-cell suspension from mouse carotid arteries for single-cell sequencing

Le arterie carotidi sono i principali vasi sanguigni del collo che forniscono sangue e ossigeno al cervello, ma la stenosi carotidea si verifica quando le arterie carotidi sono ostruite dalla placca. Rivelare la composizione cellulare dell'arteria carotide a livello di singola cellula è essenziale per il trattamento dell'aterosclerosi carotidea. Tuttavia, non esiste un protocollo pronto all'uso per la preparazione di sospensioni unicellulari da arterie carotidi. Per ottenere un protocollo adatto per la dissociazione delle arterie carotidi normali a livello di singola cellula con meno danni alle cellule, abbiamo progettato un metodo di digestione in due fasi integrando il processo di digestione della collagenasi/DNasi e della tripsina. Per rilevare la vitalità e la concentrazione delle cellule è stato utilizzato il conteggio a doppia fluorescenza di arancia acridina/ioduro di propidio (AO/PI) ed è stato riscontrato che la sospensione a singola cellula soddisfaceva i requisiti per il sequenziamento a singola cellula, con una vitalità delle cellule superiore all'85% e un'elevata concentrazione cellulare. Dopo l'elaborazione dei dati di una singola cellula, è stata rilevata una mediana di ~2500 trascritti per cellula in ciascuna cellula dell'arteria carotide. In particolare, una varietà di tipi di cellule della normale arteria carotide, tra cui le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), i fibroblasti, le cellule endoteliali (EC) e i macrofagi e le cellule dendritiche (Mφ/DC), erano rilevabili contemporaneamente. Questo protocollo può essere applicato per preparare una sospensione unicellulare di vasi sanguigni di altri tessuti con opportune modifiche.

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease associated with risk factors such as high blood pressure, hyperlipidemia, and hemodynamics1. Carotid artery bifurcations are prone to hemodynamic changes and lead to carotid plaque formation. The clinical presentation of carotid atherosclerosis can be acute such as stroke and transient cerebral ischemia, or chronic such as recurrent transient cerebral ischemia and vascular dementia2. Mechanically, carotid plaque is the outcome of the interaction between different vessel wall cells and various blood cells under pathological conditions. Therefore, revealing the single-cell atlas of carotid vessels under physiological and pathological conditions is particularly important for preventing and treating carotid plaque development.
Single-cell RNA sequencing is one of the most powerful technologies of biological research because of its ultrahigh resolution and detection of cell heterogeneity from the same cell type of organisms3,4. Researchers have used single-cell RNA sequencing to conduct research in many fields, such as cardiovascular disease5 and cancer6. However, quickly and accurately separating tissues into single cells is still one of the main challenges. Enzymatic dissociation is a commonly used method that dominantly includes collagenase, papain, trypsin, DNase, and hyaluronidase. Specifically, collagenases are the major enzyme species for single-cell digestion, mainly hydrolyzing collagen components in connective tissues. Different collagenase types are applicable for the dissociation of different tissues, such as the mammary gland7, glomerulus8, iridocorneal angle9, knee joint10, aorta11, and lung12. Due to the unique physiological properties of different tissues, dissociation using the same method may cause many troubles in acquiring single cells, such as low cell viability, low cell number, and large cell debris. Therefore, the invention of digestion methods for different tissues is essential for preparing high-quality single-cell suspensions.
This protocol aims to develop a two-step cell digestion method to prepare a single-cell suspension of the carotid artery of wild-type mice. According to the characteristics of the carotid artery, we combined collagenase/DNase with trypsin to obtain a high-quality single-cell suspension of the mouse carotid artery because collagenase can hydrolyze collagen of the carotid tissues, which was further digested by trypsin into a single-cell suspension. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) dual-fluorescence counting was used to detect cell viability and concentration, and it was found that the single-cell suspension satisfied the requirements for single-cell sequencing, with the viability of cells over 85% and a high cell concentration. After single-cell data processing, four cell types, including vascular smooth muscle cells (VSMCs), fibroblasts, endothelial cells (ECs), and macrophages and dendritic cells (M&#966;/DCs), were identified in normal mouse carotid arteries after digestion. The advantages of this protocol are that: 1) multiple cell types in the carotid artery can be identified, 2) cell viability is well preserved, and 3) it can be easily repeated without special equipment. This protocol is suitable for researchers who are interested in studying single-cell multiomics of the mouse carotid arteries. This protocol may also be helpful in the dissociation of other blood vessels with appropriate modifications.

Autore in primo piano: Dissociazione del tessuto vascolare ed esplorazione di sottocluster di singole cellule per la terapia mirata 

Preparazione di una sospensione unicellulare da arterie carotidi di topo per il sequenziamento di singole cellule

Low solubility and the larger cell debrief are the main difficulties of vascular tissue dissociation. Our two steps or digestion method is very suitable for carotid tissue dissociation and may be used to prepare single cell suspicions for other vessels with minor modifications, making it very helpful in cardiovascular research. This protocol is suitable for obtaining multiple cell types in the carotid artery, and it can be easily repeated without special equipment.In the future, we aim to use cell subclasses discovered by single cell ion sequencing for targeted therapy of cardiovascular disease.

Questo protocollo descrive un metodo di digestione cellulare in due fasi per la preparazione di una sospensione unicellulare di arterie carotidi di topo (Figura 1). Questo metodo di digestione cellulare in due fasi combina la collagenasi/DNasi con la tripsina per dissociare efficacemente la parete vascolare carotide del topo per ottenere sospensioni unicellulari di alta qualità per il sequenziamento di singole cellule. Dopo la dissociazione, la concentrazione cellulare e la vitalità cellul...

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Qui descriviamo un protocollo di digestione cellulare in due fasi per la preparazione di una sospensione unicellulare delle arterie carotidi di topo.

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...

La bassa solubilità e il debriefing cellulare più grande sono le principali difficoltà della dissociazione del tessuto vascolare. Il nostro metodo di digestione in due fasi è molto adatto per la dissociazione del tessuto carotideo e può essere utilizzato per preparare sospetti di singole cellule per altri vasi con piccole modifiche, rendendolo molto utile nella ricerca cardiovascolare. Questo protocollo è adatto per ottenere più tipi di cellule nell'arteria carotide e può essere facilmente ripetuto senza apparecchiature speciali.In futuro, miriamo a utilizzare le sottoclassi cellulari scoperte dal sequenziamento di ioni a singola cellula per la terapia mirata delle malattie cardiovascolari.

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Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

2.0K Views.  Soochow University. La bassa solubilità e il debriefing cellulare più grande sono le principali difficoltà della dissociazione del tessuto vascolare. Il nostro metodo di digestione in due fasi è molto adatto per la dissociazione del tessuto carotideo e può essere utilizzato per preparare sospetti di singole cellule per altri vasi con piccole modifiche, rendendolo molto utile nella ricerca cardiovascolare. Questo protocollo è adatto per ottenere più tipi di cellule nell'arteria carotide e può essere facil...