Este trabalho foi apoiado por bolsas da Natural Science Foundation of China (82070450 para C.T. e 82170466 para L.Z.) e pela bolsa da China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 para F.L.).

Todos os procedimentos com animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Soochow.
1. Preparação de reagentes e materiais
<ol><li>Utilizar 1x PBS sem cálcio e magnésio e 2,5 U/mL de sal de heparina sódica para preparar a solução de perfusão. Conservar a 4 °C e pré-arrefecer no gelo quando utilizado.</li>
	<li>Preparar o reagente de dissociação A que contém 125 CDU/mL colagenase II e 60 U/mL DNase I diluindo 1250 CDU/mL colagenase II e 3000 U/mL DNase I com HBSS. Conservar a 4 °C até à utilização.</li>
	<li>Preparar o reagente de dissociação B que contém uma concentração final de 0,12% de tripsina diluindo 1 mL de tripsina livre de EDTA a 0,25% (sem vermelho de fenol) em 1 mL de 1x PBS. Conservar a 4 °C até à utilização.</li>
	<li>Preparar 10 mL de FBS a 1,5% e 10 mL de FBS a 5% em 1x PBS. Use 1,5% FBS para agrupar as artérias carótidas e manter no gelo antes de usar. Use 5% FBS para neutralizar a digestão e armazenar à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Obter os materiais experimentais, incluindo seringas de 1 mL, seringas de 20 mL com agulhas de 26 G, placas de cultura de células de seis poços, tubos de centrífuga de 1,5 mL, filtros de células estéreis de 40 μm e recipientes de gelo.</li>
</ol>2. Preparação do equipamento
<ol><li>Esterilizar todo o equipamento cirúrgico, incluindo microscópio estereoscópico, tesoura dissecante, tesoura microdissecante e pinça de ponta fina.</li>
	<li>Ligue o contador de células automatizado e mantenha-o no RT.</li>
	<li>Ligue o banho-maria a 37 °C com antecedência.</li>
	<li>Pré-resfriar a microcentrífuga a 4 °C antes de usar.</li>
</ol>3. Isolamento da artéria carótida de camundongos
<ol><li>Anestesiar o camundongo com tribromoetanol a 1,25% por injeção intraperitoneal (0,24 mL para cada 10 g de peso corporal) e virar o mouse para verificar se há reflexo de endireitamento após 3 min. Em seguida, eutanasiar o camundongo por deslocamento cervical e deitá-lo em suas costas. Borrife a pele do rato com álcool a 75%.</li>
	<li>Use tesoura dissecante esterilizada para abrir a pele e expor a cavidade torácica. Abra o diafragma.</li>
	<li>Continue cortando para cima até a mandíbula inferior e remova cuidadosamente o excesso de tecido conjuntivo e gordura, expondo a artéria carótida.</li>
	<li>Corte a veia cava inferior do rato para fazer o sangue fluir para fora da circulação fechada.</li>
	<li>Injetar 20 mL de solução de perfusão pré-resfriada no ventrículo esquerdo com uma seringa lenta e continuamente. NOTA: Se a perfusão for bem-sucedida, os órgãos ricos em sangue, como o fígado, o baço e os rins, ficarão branco-acinzentados.</li>
	<li>Descasque toda a gordura e os tecidos conjuntivos ao redor da artéria carótida com uma tesoura microdissecante sob um microscópio estereoscópico. NOTA: Esta etapa deve ser feita de forma lenta e cuidadosa para evitar danos à artéria carótida.</li>
	<li>Isole a artéria carótida do rato, lave com 1x PBS para lavar o sangue novamente e transfira para placas de seis poços contendo 1,5% de SFB no gelo.</li>
</ol>4. Digestão da artéria carótida em suspensão unicelular
<ol><li>Use tesoura microdissecante para dissecar a artéria carótida longitudinalmente e deitar plana em outra placa de cultura celular de 6 poços contendo 1 mL de SFB a 1,5% sobre gelo.</li>
	<li>Lave a íntima cuidadosamente com FBS a 1,5% para remover o sangue residual. NOTA: O rubor deve ser suave e lento para evitar lesões nas células endoteliais.</li>
	<li>Cortar cada artéria carótida em aproximadamente 2 mm2 pedaços de tecido usando tesoura microdissecante em SFB a 1,5%.</li>
	<li>Transfira esses pedaços de tecido para um tubo de centrífuga de 1,5 mL com pontas de 1 mL de diâmetro largo, centrifugando a 400 x g por 5 min a 4 °C para afundar os tecidos até o fundo.</li>
	<li>Eliminar o sobrenadante e ressuspender os tecidos em 500 μL do reagente de dissociação A.</li>
	<li>Colocar o tubo em banho-maria a 37 °C durante 1 h. Pipetar suavemente com uma pipeta de 1 mL a cada 10 min.</li>
	<li>Adicione 500 μL de FBS a 5% no tubo e misture bem com uma pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células estéreis de 40 μm para um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml e centrifugar a 400 x g durante 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 200 μL de reagente de dissociação B.</li>
	<li>Coloque em banho-maria a 37 °C e digerir por mais 5 min. Pipetar suavemente a cada 2 minutos durante a digestão para dissociar totalmente em uma suspensão de célula única.</li>
	<li>Use 200 μL de FBS a 5% para encerrar a reação de digestão e centrifugar a 400 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante e ressuspenda a pastilha celular em 100 μL de 1x PBS sobre gelo.</li>
</ol>5. Exame de suspensão celular e sequenciamento de RNA de célula única
<ol><li>Adicionar 10 μL de solução AO/PI em 10 μL de suspensão de célula única e misturar suavemente com uma pipeta de 20 μL.</li>
	<li>Pipetar 20 μL da mistura para a câmara deslizar e esperar por 1 min.</li>
	<li>Carregue o slide no instrumento de contador de células automatizado.</li>
	<li>Selecione o ensaio de viabilidade AO/PI e aguarde o relatório de qualidade.</li>
	<li>Use um kit de reagente de célula única de 3' para gerar esferas de gel de célula única na emulsão em um controlador de célula única e amplificar o cDNA com código de barras em um termociclador seguindo o protocolo do fabricante. NOTA: Aqui, Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3 foi usado.</li>
	<li>Execute o sequenciamento em um sequenciador com uma estratégia de leitura de 150 pb (PE150) emparelhada. Use um aplicativo de software (Cell Ranger) para converter arquivos de chamada base brutos em arquivos fastq usando o pipeline mkfastq . Em seguida, use o Pipeline de Contagem do Cell Ranger para executar alinhamento, filtragem, contagem de código de barras e contagem de identificador molecular exclusivo (UMI) para gerar matrizes de código de barras de recurso13.</li>
	<li>Realize a redução e visualização da dimensionalidade dos dados com o pacote R Seurat14.<ol><li>Primeiro, a função Read10X() do Seurat lê na saída do pipeline do Cell Ranger e, em seguida, usa a matriz de contagem para criar um objeto Seurat. Em seguida, filtre as células com expressão de <200 ou >4000 genes ou uma razão gênica mitocondrial que foi superior a 10% pela função subset() de Seurat.</li>
		<li>Use NormalizeData () e FindVariableFeatures() para normalizar os dados e identificar 2000 recursos altamente variáveis, respectivamente.</li>
		<li>Execute a análise de componente principal (PCA) nos dados dimensionados e agrupe as células com dims = 30 e resolução = 0,5. Finalmente, use a função RunUMAP () para visualizar os conjuntos de dados de célula única e FindAllMarkers() para localizar cada biomarcador de cluster.</li>
	</ol></li>
</ol>

Digestão celular em duas etapas da artéria carótida de camundongo

<ol>
	<li>Lee, D. -. Y., Chiu, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+flow:+roles+of+epigenetic+modulation+in+vascular+endothelium.">Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium.</a> Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).</li><li>Libby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications:+A+brief+overview.">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+maps+endothelial+metabolic+plasticity+in+pathological+angiogenesis.">Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).</li><li>Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+gained+from+single-cell+analysis+of+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment.">Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment.</a> Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).</li><li>Sun, H., Xu, X., Deng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single+epithelial+cells+suspension+from+mouse+mammary+glands.">Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands.</a> Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).</li><li>Korin, B., Chung, J. -. J., Avraham, S., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+of+mouse+glomeruli+for+high-throughput+analysis.">Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis.</a> Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).</li><li>Thomson, B., Quaggin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+single+cell+suspension+from+the+murine+iridocorneal+angle.">Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle.</a> Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).</li><li>Leale, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-stage+digestion+of+whole+murine+knee+joints+for+single-cell+RNA+sequencing.">A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).</li><li>Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+aorta.">Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta.</a> Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+dissociator.">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).</li><li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+UMI-based+single-cell+RNA-seq+preprocessing+workflows.">Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows.</a> Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Depuydt, M. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanatomy+of+the+human+atherosclerotic+plaque+by+single-cell+transcriptomics.">Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics.</a> Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).</li><li>Gao, X. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+of+the+rat+carotid+arteries+uncovers+potential+cellular+targets+of+neointimal+hyperplasia.">Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+the+lumen+of+mouse+carotid+arteries+for+single-cell+multi-omics+experiments.">Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade da artéria carótida de camundongos selvagens, no qual um método de digestão em duas etapas integrando o processo de digestão de colagenase/DNase e tripsina foi construído. Após a verificação de qualidade da suspensão de célula única, verificamos que ela satisfazia os requisitos para sequenciamento de célula única, com viabilidade de células acima de 85% e alta concentração celular. Além disso, ...

A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica associada a fatores de risco como hipertensão arterial, hiperlipidemia ehemodinâmica1. As bifurcações da artéria carótida são propensas a alterações hemodinâmicas e levam à formação de placas carotídeas. A apresentação clínica da aterosclerose carotídea pode ser aguda, como acidente vascular cerebral e isquemia cerebral transitória, ou crônica, como isquemia cerebral transitória recorrente e demênciavascular2. Mecanicamente, a placa carotídea é o resultado da interação entre diferentes células da parede do vaso e várias células sanguíneas em condições patológicas. Portanto, revelar o atlas unicelular dos vasos carotídeos em condições fisiológicas e patológicas é particularmente importante para prevenir e tratar o desenvolvimento da placa carotídea.
O sequenciamento de RNA unicelular é uma das mais poderosas tecnologias de pesquisa biológica devido à sua resolução ultra-alta e detecção de heterogeneidade celular a partir de um mesmo tipo celular de organismos 3,4. Pesquisadores têm usado o sequenciamento de RNA de célula única para conduzir pesquisas em muitos campos, como doenças cardiovasculares5 e câncer6. No entanto, separar os tecidos em células isoladas de forma rápida e precisa ainda é um dos principais desafios. A dissociação enzimática é um método comumente usado que inclui predominantemente colagenase, papaína, tripsina, DNase e hialuronidase. Especificamente, as colagenases são as principais espécies enzimáticas para digestão unicelular, principalmente hidrolisando componentes do colágeno em tecidos conjuntivos. Diferentes tipos de colagenases são aplicáveis para a dissociação de diferentes tecidos, como glândulamamária7, glomérulo8, ângulo iridocorneano9, articulação do joelho 10, aorta11 e pulmão 12. Devido às propriedades fisiológicas únicas de diferentes tecidos, a dissociação usando o mesmo método pode causar muitos problemas na aquisição de células únicas, como baixa viabilidade celular, baixo número de células e grandes debris celulares. Portanto, a invenção de métodos de digestão para diferentes tecidos é essencial para a preparação de suspensões unicelulares de alta qualidade.
Este protocolo visa desenvolver um método de digestão celular em duas etapas para preparar uma suspensão unicelular da artéria carótida de camundongos selvagens. De acordo com as características da artéria carótida, combinamos colagenase/DNase com tripsina para obter uma suspensão unicelular de alta qualidade da artéria carótida de camundongo, pois a colagenase pode hidrolisar o colágeno dos tecidos carotídeos, que foi posteriormente digerido pela tripsina em uma suspensão unicelular. A contagem de dupla fluorescência de laranja de acridina/iodeto de propídio (AO/PI) foi usada para detectar a viabilidade e concentração celular, e verificou-se que a suspensão unicelular satisfez os requisitos para sequenciamento unicelular, com viabilidade de células acima de 85% e alta concentração celular. Após processamento de dados de célula única, quatro tipos celulares, incluindo células musculares lisas vasculares (CMLVs), fibroblastos, células endoteliais (CEs) e macrófagos e células dendríticas (Mφ/DCs), foram identificados em artérias carótidas normais de camundongos após a digestão. As vantagens desse protocolo são que: 1) múltiplos tipos celulares na artéria carótida podem ser identificados, 2) a viabilidade celular está bem preservada e 3) pode ser facilmente repetida sem equipamento especial. Este protocolo é adequado para pesquisadores interessados em estudar a multiômica unicelular das artérias carótidas de camundongos. Este protocolo também pode ser útil na dissociação de outros vasos sanguíneos com modificações apropriadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% EDTA-free trypsin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0205</td>
			<td>Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl saline solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST341</td>
			<td>Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>&#160;SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r009</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211W</td>
			<td>To centrifuge the tissue piece and cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r013</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>css010040</td>
			<td>To filter undigested tissue fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI kit</td>
			<td>Hengrui Biological</td>
			<td>RE010212</td>
			<td>To identify whether the cell is alive or dead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>Mira FL</td>
			<td>To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger software</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>3.0.2</td>
			<td>To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39;Reagent Kits v3</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>1000075</td>
			<td>To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td>Termination of the digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Store at the room temperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>H8060</td>
			<td>Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002560</td>
			<td>Applied for spining down the tissues and cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1000</td>
			<td>Used for cardiac perfusion and resuspension of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat package- R</td>
			<td>Satija Lab</td>
			<td>3.1.2</td>
			<td>To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well cell culture plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>703002</td>
			<td>Place the vascular tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S22</td>
			<td>Keep the digestion temperature at 37 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a single-cell suspension from mouse carotid arteries for single-cell sequencing

As artérias carótidas são os principais vasos sanguíneos do pescoço que fornecem sangue e oxigênio ao cérebro, mas a estenose carotídea ocorre quando as artérias carótidas são obstruídas por placas. Revelar a composição celular da artéria carótida em nível unicelular é essencial para o tratamento da aterosclerose carotídea. No entanto, não há um protocolo pronto para o uso para a preparação de suspensões unicelulares das artérias carótidas. Para obter um protocolo adequado para a dissociação das artérias carótidas normais em nível unicelular com menor dano às células, projetamos um método de digestão em duas etapas, integrando o processo de digestão da colagenase/DNase e tripsina. A contagem de dupla fluorescência de laranja de acridina/iodeto de propídio (AO/PI) foi usada para detectar a viabilidade e concentração celular, e verificou-se que a suspensão unicelular satisfez os requisitos para sequenciamento unicelular, com viabilidade de células acima de 85% e alta concentração celular. Após o processamento de dados de célula única, uma mediana de ~2500 transcritos por célula foi detectada em cada célula da artéria carótida. Notavelmente, uma variedade de tipos celulares da artéria carótida normal, incluindo células musculares lisas vasculares (CMLVs), fibroblastos, células endoteliais (CEs) e macrófagos e células dendríticas (Mφ/DCs), foram detectadas simultaneamente. Este protocolo pode ser aplicado para preparar uma suspensão unicelular de vasos sanguíneos de outros tecidos com modificações apropriadas.

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease associated with risk factors such as high blood pressure, hyperlipidemia, and hemodynamics1. Carotid artery bifurcations are prone to hemodynamic changes and lead to carotid plaque formation. The clinical presentation of carotid atherosclerosis can be acute such as stroke and transient cerebral ischemia, or chronic such as recurrent transient cerebral ischemia and vascular dementia2. Mechanically, carotid plaque is the outcome of the interaction between different vessel wall cells and various blood cells under pathological conditions. Therefore, revealing the single-cell atlas of carotid vessels under physiological and pathological conditions is particularly important for preventing and treating carotid plaque development.
Single-cell RNA sequencing is one of the most powerful technologies of biological research because of its ultrahigh resolution and detection of cell heterogeneity from the same cell type of organisms3,4. Researchers have used single-cell RNA sequencing to conduct research in many fields, such as cardiovascular disease5 and cancer6. However, quickly and accurately separating tissues into single cells is still one of the main challenges. Enzymatic dissociation is a commonly used method that dominantly includes collagenase, papain, trypsin, DNase, and hyaluronidase. Specifically, collagenases are the major enzyme species for single-cell digestion, mainly hydrolyzing collagen components in connective tissues. Different collagenase types are applicable for the dissociation of different tissues, such as the mammary gland7, glomerulus8, iridocorneal angle9, knee joint10, aorta11, and lung12. Due to the unique physiological properties of different tissues, dissociation using the same method may cause many troubles in acquiring single cells, such as low cell viability, low cell number, and large cell debris. Therefore, the invention of digestion methods for different tissues is essential for preparing high-quality single-cell suspensions.
This protocol aims to develop a two-step cell digestion method to prepare a single-cell suspension of the carotid artery of wild-type mice. According to the characteristics of the carotid artery, we combined collagenase/DNase with trypsin to obtain a high-quality single-cell suspension of the mouse carotid artery because collagenase can hydrolyze collagen of the carotid tissues, which was further digested by trypsin into a single-cell suspension. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) dual-fluorescence counting was used to detect cell viability and concentration, and it was found that the single-cell suspension satisfied the requirements for single-cell sequencing, with the viability of cells over 85% and a high cell concentration. After single-cell data processing, four cell types, including vascular smooth muscle cells (VSMCs), fibroblasts, endothelial cells (ECs), and macrophages and dendritic cells (M&#966;/DCs), were identified in normal mouse carotid arteries after digestion. The advantages of this protocol are that: 1) multiple cell types in the carotid artery can be identified, 2) cell viability is well preserved, and 3) it can be easily repeated without special equipment. This protocol is suitable for researchers who are interested in studying single-cell multiomics of the mouse carotid arteries. This protocol may also be helpful in the dissociation of other blood vessels with appropriate modifications.

Autor em destaque: Dissociação do tecido vascular e exploração de subclusters de células únicas para terapia direcionada 

Preparação de uma Suspensão Unicelular de Artérias Carótidas de Camundongos para Sequenciamento Unicelular

Low solubility and the larger cell debrief are the main difficulties of vascular tissue dissociation. Our two steps or digestion method is very suitable for carotid tissue dissociation and may be used to prepare single cell suspicions for other vessels with minor modifications, making it very helpful in cardiovascular research. This protocol is suitable for obtaining multiple cell types in the carotid artery, and it can be easily repeated without special equipment.In the future, we aim to use cell subclasses discovered by single cell ion sequencing for targeted therapy of cardiovascular disease.

Este protocolo descreve um método de digestão celular em duas etapas para o preparo de uma suspensão unicelular das artérias carótidas de camundongos (Figura 1). Este método de digestão celular em duas etapas combina colagenase/DNase com tripsina para dissociar efetivamente a parede vascular carotídea de camundongos para obter suspensões unicelulares de alta qualidade para sequenciamento de célula única. Após a dissociação, a concentração e a viabilidade celular foram calcula...

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Aqui descrevemos um protocolo de digestão celular em duas etapas para o preparo de uma suspensão unicelular de artérias carótidas de camundongos.

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...

A baixa solubilidade e o maior debriefing celular são as principais dificuldades de dissociação do tecido vascular. Nosso método de digestão em duas etapas é muito adequado para dissociação do tecido carotídeo e pode ser usado para preparar suspeitas de célula única para outros vasos com pequenas modificações, tornando-o muito útil na pesquisa cardiovascular. Este protocolo é adequado para a obtenção de múltiplos tipos celulares na artéria carótida, podendo ser facilmente repetido sem equipamentos especiais.No futuro, pretendemos usar subclasses celulares descobertas por sequenciamento iônico de célula única para terapia-alvo de doença cardiovascular.

preparation-single-cell-suspension-from-mouse-carotid-arteries-for

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

2.0K visualizações.  Soochow University. A baixa solubilidade e o maior debriefing celular são as principais dificuldades de dissociação do tecido vascular. Nosso método de digestão em duas etapas é muito adequado para dissociação do tecido carotídeo e pode ser usado para preparar suspeitas de célula única para outros vasos com pequenas modificações, tornando-o muito útil na pesquisa cardiovascular. Este protocolo é adequado para a obtenção de múltiplos tipos celulares na artéria carótida, podendo ser facilmente ...