이 연구는 중국 자연과학재단(82070450 to C.T.and 82170466 to L.Z.)과 중국 박사후 과학 재단(China Postdoctoral Science Foundation)의 펠로우십(7121102223 to F.L.)의 보조금으로 지원되었습니다.

아래에 설명된 모든 동물 시술은 Soochow University의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.
1. 시약 및 재료 준비
<ol><li>칼슘과 마그네슘이 없는 1x PBS와 2.5U/mL 헤파린 나트륨염을 사용하여 관류 용액을 준비합니다. 4 °C에서 보관하고 사용 시 얼음에서 예식하십시오.</li>
	<li>1250 CDU/mL 콜라겐분해효소 II 및 3000 U/mL DNase I을 HBSS로 희석하여 125 CDU/mL 콜라겐분해효소 II 및 60 U/mL DNase I을 포함하는 해리 시약 A를 준비합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>0.25% EDTA-free 트립신 1mL(페놀 레드 제외) 1mL를 1x PBS 1mL로 희석하여 최종 농도 0.12% 트립신을 포함하는 해리 시약 B를 준비합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>1x PBS에 10% FBS 1.5mL와 5% FBS 10mL를 준비합니다. 1.5% FBS를 사용하여 경동맥을 모으고 사용하기 전에 얼음 위에 보관하십시오. 5% FBS를 사용하여 소화를 중화하고 실온(RT)에서 보관하십시오.</li>
	<li>1mL 주사기, 26G 니들이 있는 20mL 주사기, 6웰 세포 배양 플레이트, 1.5mL 원심분리 튜브, 40μm 멸균 세포 여과기 및 얼음 용기를 포함한 실험 재료를 준비하십시오.</li>
</ol>2. 장비 준비
<ol><li>실체 현미경, 해부 가위, 미세 해부 가위, 미세 끝 집게를 포함한 모든 수술 장비를 소독합니다.</li>
	<li>자동 셀 카운터를 켜고 RT로 유지하십시오.</li>
	<li>미리 수조를 37°C로 켭니다.</li>
	<li>사용하기 전에 마이크로 원심분리기를 4°C로 사전 냉각하십시오.</li>
</ol>3. 마우스 경동맥의 격리
<ol><li>복강내 주사(체중 10g당 0.24mL)로 1.25% 트리브로모에탄올을 사용하여 마우스를 마취하고 3분 후 직립 반사가 있는지 확인하기 위해 마우스를 뒤집습니다. 그런 다음 자궁 경부 탈구로 쥐를 안락사시키고 등을 눕힙니다. 쥐의 피부에 75% 알코올을 뿌립니다.</li>
	<li>멸균 된 해부 가위를 사용하여 피부를 열고 흉강을 노출시킵니다. 다이어프램을 잘라 엽니다.</li>
	<li>아래턱까지 위쪽으로 계속 자르고 과도한 결합 조직과 지방을 조심스럽게 제거하여 경동맥을 노출시킵니다.</li>
	<li>쥐의 하대정맥을 잘라 닫힌 순환계에서 혈류가 나오도록 합니다.</li>
	<li>20mL의 미리 냉각된 관류 용액을 주사기로 좌심실에 천천히 지속적으로 주입합니다. 알림: 관류가 성공하면 간, 비장, 신장과 같은 혈액이 풍부한 기관이 회백색으로 변합니다.</li>
	<li>입체 현미경으로 미세 해부 가위로 경동맥 주변의 모든 지방과 결합 조직을 벗겨냅니다. 알림: 이 단계는 경동맥의 손상을 방지하기 위해 천천히 조심스럽게 수행해야 합니다.</li>
	<li>마우스에서 경동맥을 분리하고 1x PBS로 세척하여 혈액을 다시 씻어낸 다음 얼음 위에 1.5% FBS가 포함된 6웰 플레이트로 옮깁니다.</li>
</ol>4. 경동맥을 단세포 현탁액으로 소화
<ol><li>미세 해부 가위를 사용하여 경동맥을 세로로 절개하고 얼음 위에 1.5% FBS 1mL가 들어 있는 다른 6웰 세포 배양 플레이트에 평평하게 눕힙니다.</li>
	<li>잔류 혈액을 제거하기 위해 1.5% FBS로 조심스럽게 내정을 씻어냅니다. 알림: 내피 세포가 손상되지 않도록 세척은 부드럽고 천천히 이루어져야 합니다.</li>
	<li>각 경동맥을 약 2mm2 개의 티슈 조각으로 자르고 1.5 % FBS의 미세 해부 가위를 사용합니다.</li>
	<li>이 조직 조각을 1mL 너비의 보어 팁이 있는 1.5mL 원심분리 튜브에 옮기고 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 조직을 바닥으로 가라앉힙니다.</li>
	<li>상층액을 버리고 500μL의 해리 시약 A에 조직을 재현탁시킵니다.</li>
	<li>튜브를 37°C 수조에 1시간 동안 넣습니다. 10분마다 1mL 피펫으로 부드럽게 피펫팅합니다.</li>
	<li>500μL의 5% FBS를 튜브에 넣고 1mL 피펫과 잘 섞습니다.</li>
	<li>40μm 멸균 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 새로운 1.5mL 원심분리 튜브로 여과하고 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 조심스럽게 제거하고 200μL의 해리 시약 B에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.</li>
	<li>37°C 수조에 넣고 5분간 더 소화시킵니다. 분해 중 2분마다 부드럽게 피펫팅하여 단세포 현탁액으로 완전히 해리합니다.</li>
	<li>200μL의 5% FBS를 사용하여 분해 반응을 종료하고 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 버리고 셀 펠릿을 얼음 위의 1x PBS 100μL에 재현탁시킵니다.</li>
</ol>5. 세포 현탁액 검사 및 단세포 RNA 염기서열 분석
<ol><li>10μL의 AO/PI 용액을 10μL의 단일 셀 현탁액에 넣고 20μL 피펫과 부드럽게 혼합합니다.</li>
	<li>혼합물 20μL를 챔버에 피펫팅하고 1분 동안 기다립니다.</li>
	<li>슬라이드를 자동 세포 계수기 기기에 로드합니다.</li>
	<li>AO/PI Viability assay를 선택한 다음 품질 보고서를 기다립니다.</li>
	<li>단일 세포 3ʹ 시약 키트를 사용하여 단일 세포 컨트롤러의 에멀젼에서 단일 세포 겔 비드를 생성하고 제조업체의 프로토콜에 따라 열 순환기에서 바코드가 찍힌 cDNA를 증폭합니다. 참고: 여기서는 Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3을 사용하였다.</li>
	<li>paired-end 150 bp (PE150) 판독 전략으로 시퀀서에서 염기서열분석을 수행합니다. 소프트웨어 애플리케이션(Cell Ranger)을 사용하여 mkfastq 파이프라인을 사용하여 원시 기본 호출 파일을 fastq 파일로 변환합니다. 그런 다음, 정렬, 필터링, 바코드 카운팅 및 고유 분자 식별자(UMI) 카운팅을 수행하기 위해 Cell Ranger의 Count Pipeline 을 사용하여 특징-바코드 매트릭스13을 생성한다.</li>
	<li>R 패키지 Seurat14를 사용하여 데이터 차원 축소 및 시각화를 수행합니다.<ol><li>먼저 Seurat의 Read10X() 함수는 Cell Ranger 파이프라인의 출력을 읽은 다음 count 행렬을 사용하여 Seurat 객체를 만듭니다. 그런 다음 <200 또는 >4000 유전자의 발현 또는 Seurat의 subset() 함수에 의해 10% 이상의 미토콘드리아 유전자 비율을 가진 세포를 걸러냅니다.</li>
		<li>NormalizeData() 및 FindVariableFeatures()를 사용하여 데이터를 정규화하고 각각 2000개의 매우 가변적인 특징을 식별합니다.</li>
		<li>스케일링된 데이터에 대해 주성분 분석(PCA)을 수행하고 dims = 30 및 resolution = 0.5를 사용하여 셀을 군집화합니다. 마지막으로 RunUMAP () 함수를 사용하여 단일 셀 데이터 세트를 시각화하고 FindAllMarkers() 를 사용하여 각 클러스터 바이오마커를 찾습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

마우스 경동맥의 2단계 세포 분해

<ol>
	<li>Lee, D. -. Y., Chiu, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+flow:+roles+of+epigenetic+modulation+in+vascular+endothelium.">Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium.</a> Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).</li><li>Libby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications:+A+brief+overview.">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+maps+endothelial+metabolic+plasticity+in+pathological+angiogenesis.">Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).</li><li>Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+gained+from+single-cell+analysis+of+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment.">Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment.</a> Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).</li><li>Sun, H., Xu, X., Deng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single+epithelial+cells+suspension+from+mouse+mammary+glands.">Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands.</a> Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).</li><li>Korin, B., Chung, J. -. J., Avraham, S., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+of+mouse+glomeruli+for+high-throughput+analysis.">Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis.</a> Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).</li><li>Thomson, B., Quaggin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+single+cell+suspension+from+the+murine+iridocorneal+angle.">Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle.</a> Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).</li><li>Leale, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-stage+digestion+of+whole+murine+knee+joints+for+single-cell+RNA+sequencing.">A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).</li><li>Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+aorta.">Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta.</a> Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+dissociator.">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).</li><li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+UMI-based+single-cell+RNA-seq+preprocessing+workflows.">Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows.</a> Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Depuydt, M. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanatomy+of+the+human+atherosclerotic+plaque+by+single-cell+transcriptomics.">Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics.</a> Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).</li><li>Gao, X. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+of+the+rat+carotid+arteries+uncovers+potential+cellular+targets+of+neointimal+hyperplasia.">Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+the+lumen+of+mouse+carotid+arteries+for+single-cell+multi-omics+experiments.">Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).</li></ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

여기에서는 야생형 마우스의 경동맥에서 콜라겐분해효소/DNase 및 트립신의 소화 과정을 통합하는 2단계 소화 방법을 구축한 고품질 단세포 현탁액을 제조하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 단일 세포 현탁액의 품질 검사 후, 우리는 그것이 85% 이상의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 시퀀싱에 대한 요구 사항을 충족한다는 것을 발견했습니다. 또한 VSMC, 섬유아세포, EC 및 Mφ/DC를 ...

죽상동맥경화증은 고혈압, 고지혈증, 혈류역학 등의 위험인자와 관련된 만성 염증성 질환이다1. 경동맥 분기는 혈역학적 변화가 일어나기 쉬우며 경동맥 플라크 형성을 유발합니다. 경동맥 죽상동맥경화증의 임상적 양상은 뇌졸중, 일과성 뇌허혈과 같은 급성일 수도 있고, 재발성 일과성 뇌허혈, 혈관성 치매와 같은 만성일 수도 있다2. 기계적으로 경동맥 플라크는 병리학적 조건에서 서로 다른 혈관 벽 세포와 다양한 혈액 세포 간의 상호 작용의 결과입니다. 따라서 생리학적 및 병리학적 조건에서 경동맥의 단세포 아틀라스를 밝히는 것은 경동맥 플라크 발생을 예방하고 치료하는 데 특히 중요합니다.
단일 세포 RNA 염기서열 분석은 초고분해능과 동일한 세포 유형의 유기체에서 세포 이질성을 검출하기 때문에 생물학 연구의 가장 강력한 기술중 하나입니다 3,4. 연구자들은 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 사용하여 심혈관 질환5 및 암6과 같은 많은 분야에서 연구를 수행했습니다. 그러나 조직을 단일 세포로 빠르고 정확하게 분리하는 것은 여전히 주요 과제 중 하나입니다. 효소 해리는 콜라겐분해효소, 파파인, 트립신, DNase 및 히알루로니다아제를 주로 포함하는 일반적으로 사용되는 방법입니다. 특히, 콜라겐분해효소는 단세포 소화를 위한 주요 효소 종으로, 주로 결합 조직의 콜라겐 성분을 가수분해합니다. 다양한 콜라겐분해효소 유형은 유선7, 사구체8, 홍채각9, 무릎관절10, 대동맥11, 폐12와 같은 다양한 조직의 해리에 적용할 수 있다. 서로 다른 조직의 고유한 생리학적 특성으로 인해 동일한 방법을 사용한 해리는 낮은 세포 생존율, 낮은 세포 수 및 큰 세포 파편과 같은 단일 세포를 획득하는 데 많은 문제를 일으킬 수 있습니다. 그러므로, 상이한 조직에 대한 분해 방법의 발명은 고품질 단세포 현탁액을 제조하는 데 필수적이다.
이 프로토콜은 야생형 마우스의 경동맥의 단세포 현탁액을 제조하기 위한 2단계 세포 분해 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다. 경동맥의 특성에 따라 콜라겐분해효소/DNase와 트립신을 결합하여 생쥐 경동맥의 고품질 단세포 현탁액을 얻었는데, 이는 콜라겐분해효소가 경동맥 조직의 콜라겐을 가수분해할 수 있기 때문이며, 이는 트립신에 의해 단세포 현탁액으로 더 소화되었습니다. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) 이중 형광 계수를 사용하여 세포 생존율과 농도를 검출했으며, 단일 세포 현탁액이 85% 이상의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 염기서열 분석 요구 사항을 충족하는 것으로 나타났습니다. 단일 세포 데이터 처리 후 소화 후 정상 마우스 경동맥에서 혈관 평활근 세포(VSMC), 섬유아세포, 내피 세포(EC), 대식세포 및 수지상 세포(Mφ/DC)를 포함한 4가지 세포 유형이 확인되었습니다. 이 프로토콜의 장점은 1) 경동맥의 여러 세포 유형을 식별할 수 있고, 2) 세포 생존율이 잘 보존되며, 3) 특별한 장비 없이 쉽게 반복할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 마우스 경동맥의 단세포 다중체학 연구에 관심이 있는 연구자에게 적합합니다. 이 프로토콜은 적절한 변형을 통해 다른 혈관을 해리하는 데에도 도움이 될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% EDTA-free trypsin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0205</td>
			<td>Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl saline solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST341</td>
			<td>Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>&#160;SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r009</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211W</td>
			<td>To centrifuge the tissue piece and cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r013</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>css010040</td>
			<td>To filter undigested tissue fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI kit</td>
			<td>Hengrui Biological</td>
			<td>RE010212</td>
			<td>To identify whether the cell is alive or dead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>Mira FL</td>
			<td>To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger software</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>3.0.2</td>
			<td>To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39;Reagent Kits v3</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>1000075</td>
			<td>To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td>Termination of the digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Store at the room temperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>H8060</td>
			<td>Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002560</td>
			<td>Applied for spining down the tissues and cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1000</td>
			<td>Used for cardiac perfusion and resuspension of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat package- R</td>
			<td>Satija Lab</td>
			<td>3.1.2</td>
			<td>To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well cell culture plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>703002</td>
			<td>Place the vascular tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S22</td>
			<td>Keep the digestion temperature at 37 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a single-cell suspension from mouse carotid arteries for single-cell sequencing

경동맥은 뇌에 혈액과 산소를 공급하는 목의 주요 혈관이지만, 경동맥 협착증은 플라크로 경동맥이 막힐 때 발생합니다. 단세포 수준에서 경동맥의 세포 구성을 밝히는 것은 경동맥 죽상동맥경화증 치료에 필수적입니다. 그러나 경동맥에서 단세포 현탁액을 제조하기 위해 즉시 사용할 수 있는 프로토콜은 없습니다. 세포 손상을 줄이면서 단세포 수준에서 정상 경동맥을 해리하는 데 적합한 프로토콜을 얻기 위해 콜라겐분해효소/DNase와 트립신의 분해 과정을 통합하여 2단계 소화 방법을 설계했습니다. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) 이중 형광 계수를 사용하여 세포 생존율과 농도를 검출했으며, 단일 세포 현탁액이 85% 이상의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 염기서열 분석 요구 사항을 충족하는 것으로 나타났습니다. 단일 세포 데이터 처리 후 각 경동맥 세포에서 세포당 ~2500개의 전사체 중앙값이 검출되었습니다. 특히, 혈관 평활근 세포(VSMC), 섬유아세포, 내피세포(EC), 대식세포 및 수지상세포(Mφ/DC)를 포함한 정상 경동맥의 다양한 세포 유형이 동시에 검출되었습니다. 이 프로토콜은 적절한 변형을 갖는 다른 조직으로부터의 혈관의 단세포 현탁액을 제조하기 위해 적용될 수 있다.

이 프로토콜은 마우스 경동맥의 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 2단계 세포 분해 방법을 설명합니다(그림 1). 이 2단계 세포 분해 방법은 콜라겐분해효소/DNase와 트립신을 결합하여 쥐 경동맥 혈관벽을 효과적으로 해리하여 단일 세포 염기서열 분석을 위한 고품질 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 해리 후, 세포 농도 및 세포 생존율은 자동화된 세포 카운터에 의해 계산되었?...

Watch this Scientific Journal Video about Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy at JoVE.com

저자 스포트라이트: Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy 

여기서는 마우스 경동맥의 단세포 현탁액을 준비하기 위한 2단계 세포 분해 프로토콜을 설명합니다.

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...

낮은 용해도와 더 큰 세포 디브리핑은 혈관 조직 해리의 주요 어려움입니다. 당사의 2단계 또는 분해 방법은 경동맥 조직 해리에 매우 적합하며 경미한 변형이 있는 다른 혈관에 대한 단세포 의심을 준비하는 데 사용할 수 있어 심혈관 연구에 매우 도움이 됩니다. 이 프로토콜은 경동맥에서 여러 세포 유형을 얻는 데 적합하며 특별한 장비 없이 쉽게 반복할 수 있습니다.앞으로는 단세포 이온 염기서열 분석으로 발견한 세포 서브클래스를 심혈관 질환의 표적 치료에 사용하는 것을 목표로 하고 있습니다.

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Research

JoVE Journal

Biology

2.7K 조회수.  Soochow University. 낮은 용해도와 더 큰 세포 디브리핑은 혈관 조직 해리의 주요 어려움입니다. 당사의 2단계 또는 분해 방법은 경동맥 조직 해리에 매우 적합하며 경미한 변형이 있는 다른 혈관에 대한 단세포 의심을 준비하는 데 사용할 수 있어 심혈관 연구에 매우 도움이 됩니다. 이 프로토콜은 경동맥에서 여러 세포 유형을 얻는 데 적합하며 특별한 장비 없이 쉽게 반복할 수 있습니다....

비디오: 저자 스포트라이트: Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy 

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

gentleMACS Dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 Suspensions의 준비

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

연구

생물학

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

마우스 신경 조직에서 단일 셀 Suspensions의 생성

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

마우스 콘 Photoreceptors에서 단일 셀 석션 레코딩

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in the endothelium at the transcriptomic and epigenomic levels, resulting in proatherogenic responses. Recently, single-cell RNA sequencing (scRNAseq) and single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing (scATACseq) studies were performed to determine the transcriptomic and chromatin accessibility changes at a single-cell resolution using the mouse partial carotid ligation (PCL) model. As endothelial cells (ECs) represent a minor fraction of the total cell populations in the artery wall, a luminal digestion method was used to obtain EC-enriched single-cell preparations. For this study, mice were subjected to PCL surgery to induce d-flow in the left carotid artery (LCA) while using the right carotid artery (RCA) as a control. The carotid arteries were dissected out two days or two weeks post PCL surgery. The lumen of each carotid was subjected to collagenase digestion, and endothelial-enriched single cells or single nuclei were obtained. These single-cell and single-nuclei preparations were subsequently barcoded using a 10x Genomics microfluidic setup. The barcoded single-cells and single-nuclei were then utilized for RNA preparation, library generation, and sequencing on a high-throughput DNA sequencer. Post bioinformatics processing, the scRNAseq and scATACseq datasets identified various cell types from the luminal digestion, primarily consisting of ECs. Smooth muscle cells, fibroblasts, and immune cells were also present. This EC-enrichment method aided in understanding the effect of blood flow on the endothelium, which could have been difficult with the total artery digestion method. The EC-enriched single-cell preparation method can be used to perform single-cell omics studies in EC-knockouts and transgenic mice where the effect of blood flow on these genes has not been studied. Importantly, this technique can be adapted to isolate EC-enriched single cells from human artery explants to perform similar mechanistic studies.

We present a method for isolating endothelial cells and nuclei from the lumen of mouse carotid arteries exposed to stable or disturbed flow conditions to perform single-cell omics experiments.

단일 세포 다중 오믹스 실험을 위한 마우스 경동맥 내강에서 내피 세포 분리

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The preparation of high-quality single-cell suspensions is essential for single-cell level studies such as single-cell RNA or genome sequencing. However, there is no ready-to-use protocol for aquaculture fish species, particularly for the intestine of tilapia. The effective dissociation enzymes vary depending on the tissue type. Therefore, optimizing the tissue dissociation protocol by selecting the appropriate enzyme or enzyme combination to obtain enough viable cells with minimum damage is essential. This study illustrates an optimized protocol to prepare a high-quality single-cell suspension from Nile tilapia intestine with an enzyme combination of collagenase/dispase. This combination is highly effective for dissociation with the utilization of bovine serum albumin and DNase to reduce cell aggregation after digestion. The cell output satisfies the requirements for single-cell sequencing, with 90% cell viability and a high cell concentration. This protocol can also be modified to prepare a single-cell suspension from the intestines of other fish species. This research provides an efficient reference protocol and reduces the need for additional trials in the preparation of single-cell suspensions for aquaculture fish species.

Here, we demonstrate the preparation of a high-quality single-cell suspension of tilapia intestine for single-cell sequencing.

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, which is known as cellular heterogeneity. In recent years, single-cell and cell-type isolation combined with next-generation sequencing (NGS) techniques have become important tools for studying biological processes at single-cell resolution. However, isolating plant cells is relatively more difficult due to the presence of plant cell walls, which limits the application of single-cell approaches in plants. This protocol describes a robust procedure for fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based single-cell and cell-type isolation with plant cells, which is suitable for downstream multi-omics analysis and other studies. Using Arabidopsis root fluorescent marker lines, we demonstrate how particular cell types, such as xylem-pole pericycle cells, lateral root initial cells, lateral root cap cells, cortex cells, and endodermal cells, are isolated. Furthermore, an effective downstream transcriptome analysis method using Smart-seq2 is also provided. The cell isolation method and transcriptome analysis techniques can be adapted to other cell types and plant species and have broad application potential in plant science.

The feasibility and effectiveness of high-throughput scRNA-seq methods herald a single-cell era in plant research. Presented here is a robust and complete procedure for isolating specific Arabidopsis thaliana root cell types and subsequent transcriptome library construction and analysis.

식물 세포 유형의 분리 및 전사체 분석

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

고처리량 약물 스크리닝을 위한 전사체 프로파일링

Cost-Efficient Transcriptomic-Based Drug Screening

Transcriptomics allows&#160;to obtain comprehensive insights into cellular programs and their responses to perturbations. Despite a significant decrease in the costs of library production and sequencing in the last decade, applying these technologies at the scale necessary for drug screening remains prohibitively expensive, obstructing the immense potential of these methods. Our study presents a cost-effective system for transcriptome-based drug screening, combining miniaturized perturbation cultures with mini-bulk transcriptomics. The optimized mini-bulk protocol provides informative biological signals at cost-effective sequencing depth, enabling extensive screening of known drugs and new molecules. Depending on the chosen treatment and incubation time, this protocol will result in sequencing libraries within approximately 2 days. Due to several stopping points within this protocol, the library preparation, as well as the sequencing, can be performed time-independently. Processing simultaneously a high number of samples is possible; measurement of up to 384 samples was tested without loss of data quality. There are also no known limitations to the number of conditions and/or drugs, despite considering variability in optimal drug incubation times.

저자 스포트라이트: 비용 효율적인 전사체 약물 스크리닝 - 새로운 표적 발견 

This protocol describes a workflow from ex vivo or in vitro cell cultures to transcriptomic data pre-processing for cost-effective transcriptome-based drug screening.

비용 효율적인 전사체 기반 약물 스크리닝

Transcriptomics allows&#160;to obtain comprehensive insights into cellular programs and their responses to perturbations. Despite a significant decrease ...