כלי עריכת גנום מבוססי קריספר הקלו מאוד על הייצור של מודלים מהונדסים גנטית של חזרות. מערכת הקריספר מורכבת מקומפלקס רנ"א מנחה יחיד לנוקלאז Cas9 וניתן לתכנת אותה לכוון לרצף מעניין בתוך הגנום כדי ליצור שבר DNA דו-גדילי. באמצעות העברה משותפת של תבנית תיקון דנ"א, ניתן לשחזר במדויק את שבר הדנ"א הזה יחד עם הוספה של כל רצף דנ"א מהונדס רצוי באמצעות תהליך שנקרא תיקון מכוון הומולוגיה.
באמצעות התהליך הזה אנו מסוגלים ליצור מודלים של חולדות עם החדרות או החלפות ממוקדות של דנ"א. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מציגים גישה שונה באמצעות וירוס הקשור באדנו כדי לספק תבנית תיקון DNA לעוברי חולדות, יחד עם משלוח עוקב של קומפלקסים CRISPR Cas9 באמצעות אלקטרופורציה של שני עוברי תאים. סרוטיפים AAV 1 או 6 ארוזים עם תבנית תיקון DNA מהונדסת המיועדת להשתלב בגנום החולדה באמצעות תהליך תיקון מכוון הומולוגיה בתיווך CRISPR.
ה-AAV מתווסף לטיפה של 30 מיקרוליטר של מדיה KSOM של חולדה בריכוז סופי של 3 X 10 לעותקי הגנום השביעי למיקרוליטר. לאחר מכן, עוברים טריים שנאספו בשלב התא עם גרעינים גלויים מועברים לאחר מכן למדיה המכילה AAV ומאפשרים התמרה ויראלית להתרחש. באמצעות הפרוטוקול שלנו, אין צורך לדלל את zona pellucida כמו סרוטיפים AAV 1 ו 6 מסוגלים לעבור בקלות עבור משלוח יעיל של תבנית תיקון DNA.
עוברים מתורבתים עם AAV בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ולחות מקסימלית. למחרת מכינים תערובת אלקטרופורציה המכילה מאה ננוגרם למיקרוליטר רנ"א מנחה יחיד ומאה ננוגרם למיקרוליטר חלבון Cas9 המדולל במדיית OptiMIM. התערובת מודגרת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים של CRISPR RNP.
במהלך זמן הדגירה, האלקטרופורטור מופעל ומוליכים מחוברים לאלקטרודות שקופיות הזכוכית. לאחר היווצרות RNP הושלמה, חמישה מיקרוליטרים של תערובת אלקטרופורציה הוא pipeted בין האלקטרודות, נזהר לא להכניס בועות אוויר לתמיסה. עוברים, הנמצאים כעת בשלב שני התאים, מוסרים מהמדיה המכילה AAV ומועברים בזהירות לתערובת האלקטרופורציה בין האלקטרודות.
העוברים מיושרים, מה שמבטיח שאף אחד מהם לא נוגע באף אחת מהאלקטרודות מכיוון שזה יגרום לליזה במהלך ההתחשמלות. הנה תצוגה של הליך זה דרך המיקרוסקופ. חשוב גם לציין כי העכבה תפחת ככל שהנפח בין האלקטרודות יגדל.
מסיבה זו, וכדי לא לדלל את תערובת האלקטרופורציה, יש להעביר מדיה מינימלית יחד עם העוברים. לאחר מכן, העכבה נמדדת על ידי לחיצה על הכפתור עם סמל אוהם על זה. העכבה צריכה להיות בטווח של 0.18 עד 0.3 אוהם.
אם בטווח, אלקטרופורציה מופעלת על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה. תהליך זה לוקח רק כמה שניות, וכך זה נראה דרך המיקרוסקופ. תוכלו להבחין בבועות הנוצרות במהירות על כל אלקטרודה.
מיד לאחר ההתחשמלות, העוברים נאספים משקופית הזכוכית ונשטפים שלוש פעמים במדיה KSOM של חולדה טרייה. לאחר מכן ניתן לגדל את העוברים בתרבית לצורך מחקרי מבחנה או להעביר אותם לנקבות פונדקאיות כדי להעמיד צאצאים חיים. חשוב לציין כי נפיחות בעובר שכיחה לאחר התחשמלות.
נפיחות זו אמורה לשכך לאחר מספר שעות בתרבית. כמו כן, שכיח לראות אירועי איחוי תאי בעד 20% משני עוברי תאים לאחר אלקטרופורציה. איחוי תאי יכול בדרך כלל להימנע על ידי יישור ציר אופקי זהיר של העוברים בין האלקטרודות.
בדיקת הפרוטוקול שלנו בעוברי חולדות וסינון פיצוצים בתרבית לצורך החדרת רצף אינטרון מלאכותי קצר ומהונדס המכיל שני אתרי loxP. שמנו לב שיותר מ-60% מהבלסטוציסטים מכילים את האלל הממוקד נכון בהתבסס על ניתוח רצף הדור הבא. לאחר מכן, לאחר בדיקה נוספת של הפרוטוקול שלנו לייצור חולדות חיות, אנו מתכננים פרויקט להנדס רצף ציפוי Cre recombinase המיועד לאתר ההתחלה ATG של הגן DRD2 של חולדה.
מתוך 11 הצאצאים שנולדו, 10 היו חיוביים על ידי ניתוח PCR על פני חמש זרועות ההומולוגיה הראשונית, שלוש זרועות הומולוגיה ראשוניות, ובדיקת PCR פנימית לזיהוי Cre recombinase. לסיכום על פני שבעה פרויקטים שונים, השגנו שיעור הצלחה ממוצע של 76% בבעלי חיים מייסדים כפי שנקבע על ידי ניתוח PCR בצמתי זרועות הומולוגיה ואימות רצפי DNA. באמצעות מסירת DNA בתיווך AAV וצינור אלקטרופורציה של שני תאים, חווינו יעילות גבוהה משמעותית בהשוואה לגישות מסורתיות להחדרת DNA באורך של עד שלושה קילובייט.
חשוב גם לציין כי בעוד הדגמנו את השימוש בהליך זה בעוברי חולדות, הוא עשוי להיות מיושם ביעילות על מינים אחרים ליצירת החדרות DNA ממוקדות גם כן.
