As ferramentas de edição do genoma baseadas em CRISPR facilitaram muito a produção de modelos de representação geneticamente modificados. O sistema CRISPR é composto por um único complexo de RNA guia para uma nuclease Cas9 e pode ser programado para atingir uma sequência de interesse dentro do genoma para criar uma quebra de DNA de fita dupla. Através da coentrega de um modelo de reparo de DNA, essa quebra de DNA pode ser restaurada com precisão, juntamente com a adição de qualquer sequência de DNA projetada desejada através de um processo chamado Reparo Dirigido por Homologia.
É por esse processo que somos capazes de gerar modelos de ratos knock-in com inserções ou substituições de DNA direcionadas. Usando este protocolo, apresentamos uma abordagem modificada usando vírus adenoassociado para entregar um molde de reparo de DNA a embriões de rato, juntamente com uma entrega subsequente de complexos CRISPR Cas9 através da eletroporação de embriões de duas células. Os sorotipos 1 ou 6 do AAV são empacotados com um modelo de reparo de DNA projetado para ser integrado ao genoma do rato por meio do processo de Reparo Dirigido por Homologia mediado por CRISPR.
O AAV é adicionado a uma gota de 30 microlitros de meio KSOM de rato em uma concentração final de 3 X 10 para a 7ª cópia do genoma por microlitro. Em seguida, embriões recém-coletados em estágio celular com pronúcleos visíveis são então transferidos para o meio contendo AAV, permitindo que ocorra a transdução viral. Usando nosso protocolo, não há necessidade de afinar a zona pelúcida, pois os sorotipos 1 e 6 do AAV são capazes de passar prontamente para a entrega eficiente do molde de reparo de DNA.
Os embriões são cultivados com o AAV durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e umidade máxima. No dia seguinte, é feita uma mistura de eletroporação contendo cem nanogramas por microlitro de RNA guia único e cem nanogramas por microlitro de proteína Cas9 diluída em meio OptiMIM. A mistura é incubada em temperatura ambiente por 10 minutos para permitir a formação de complexos CRISPR RNP.
Durante o tempo de incubação, o eletroporator é ligado e os eletrodos são fixados aos eletrodos de lâmina de vidro. Após a formação da RNP, cinco microlitros da mistura de eletroporação são pipetados entre os eletrodos, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução. Os embriões, agora no estágio de duas células, são removidos do meio contendo AAV e cuidadosamente movidos para a mistura de eletroporação entre os eletrodos.
Os embriões são alinhados, garantindo que nenhum deles esteja tocando nenhum dos eletrodos, pois isso causará lise durante a eletroporação. Aqui está uma visão deste procedimento através do microscópio. Também é importante notar que a impedância diminuirá à medida que o volume entre os eletrodos aumentar.
Por esta razão, e para não diluir a mistura de eletroporação, meios mínimos devem ser transferidos juntamente com os embriões. Em seguida, a impedância é medida pressionando o botão com um símbolo de ohm. A impedância deve estar dentro da faixa de 0,18 a 0,3 ohms.
Se estiver no alcance, a eletroporação é iniciada pressionando o botão de partida. Este processo leva apenas alguns segundos, e é assim que se parece através do microscópio. Você notará bolhas se formando rapidamente em cada eletrodo.
Imediatamente após a eletroporação, os embriões são coletados da lâmina de vidro e lavados três vezes em meio KSOM fresco de rato. Os embriões podem então ser cultivados para estudos in vitro ou transferidos para fêmeas substitutas para produzir descendentes vivos. É importante ressaltar que o inchaço embrionário é comum após a eletroporação.
Esse inchaço deve diminuir após algumas horas de cultura. Também é comum observar eventos de fusão celular em até 20% dos embriões de duas células após a eletroporação. A fusão celular pode tipicamente ser evitada pelo cuidadoso alinhamento do eixo horizontal dos embriões entre os eletrodos.
Testando nosso protocolo em embriões de rato e triagem de blastos cultivados para uma inserção de uma sequência de íntrons artificiais curtos contendo dois sítios loxP. Observamos que mais de 60% dos blastocistos contêm o alelo knock-in corretamente direcionado com base na análise de sequência de próxima geração. Em seguida, testando ainda mais nosso protocolo para produzir ratos knock-in vivos, projetamos um projeto para projetar uma sequência de revestimento de recombinase Cre direcionada para o local de início ATG do gene DRD2 do rato.
Dos 11 filhotes nascidos, 10 foram positivos por análise de PCR nos cinco braços de homologia primo, três braços de homologia primo e um ensaio interno de PCR para detectar Cre recombinase. Como um resumo ao longo de sete projetos diferentes, alcançamos uma taxa média de sucesso de 76% em animais fundadores, conforme determinado pela análise de PCR através de junções de braço de homologia e verificação de sequência de DNA. Usando essa entrega de DNA mediada por AAV e o pipeline de eletroporação de embriões de duas células, experimentamos eficiências de knock-in significativamente mais altas do que as abordagens tradicionais para inserções de DNA de até três KB de comprimento.
Também é importante notar que, embora tenhamos demonstrado o uso desse procedimento em embriões de ratos, ele pode ser efetivamente aplicado a outras espécies para gerar inserções de DNA direcionadas também.
