基于CRISPR的基因组编辑工具极大地促进了基因工程代表模型的生产。CRISPR 系统由单个 Cas9 核酸酶的引导 RNA 复合物组成，可以编程为靶向基因组内的目标序列以产生双链 DNA 断裂。通过DNA修复模板的共同递送，这种DNA断裂可以精确地恢复，同时通过称为同源定向修复的过程添加任何所需的工程DNA序列。
正是通过这个过程，我们能够生成具有靶向DNA插入或替换的敲入大鼠模型。使用该协议，我们提出了一种使用腺相关病毒将DNA修复模板递送至大鼠胚胎的改良方法，以及随后通过双细胞胚胎电穿孔递送CRISPR Cas9复合物。AAV 血清型 1 或 6 与工程 DNA 修复模板一起包装，该模板旨在通过 CRISPR 介导的同源定向修复过程整合到大鼠基因组中。
将AAV加入30微升大鼠KSOM培养基中，终浓度为3×10至每微升第7个基因组拷贝。接下来，将新鲜收集的具有可见原核的单细胞期胚胎转移到含有AAV的培养基中，从而发生病毒转导。使用我们的方案，无需稀释透明带，因为 AAV 血清型 1 和 6 能够轻松通过以实现有效的 DNA 修复模板递送。
胚胎在37摄氏度、5%二氧化碳和最大湿度下用AAV培养过夜。第二天，制备含有100纳克/微升单向导RNA和100纳克/微升Cas9蛋白的电穿孔混合物，在OptiMIM培养基中稀释。将混合物在室温下孵育10分钟，以形成CRISPR RNP复合物。
在孵育期间，电穿孔器打开，导线连接到载玻片电极上。RNP形成完成后，在电极之间移取5微升电穿孔混合物，注意不要将气泡引入溶液中。现在处于两个细胞阶段的胚胎从含有AAV的培养基中取出，并小心地移动到电极之间的电穿孔混合物中。
胚胎是对齐的，确保没有接触任何一个电极，因为这会导致电穿孔过程中的裂解。这是通过显微镜观察这一过程的视图。同样重要的是要注意，阻抗会随着电极之间体积的增加而降低。
出于这个原因，并且为了不稀释电穿孔混合物，应与胚胎一起转移最少的培养基。接下来，通过按下带有欧姆符号的按钮来测量阻抗。阻抗应在 0.18 至 0.3 欧姆的范围内。
如果在范围内，则按下启动按钮开始电穿孔。这个过程只需要几秒钟，这就是通过显微镜看到的样子。您会注意到每个电极上迅速形成气泡。
电穿孔后立即从载玻片中收集胚胎，并在新鲜的大鼠KSOM培养基中洗涤三次。然后可以培养胚胎进行体外研究或转移到代孕雌性以产生活体后代。需要注意的是，胚胎肿胀在电穿孔后很常见。
这种肿胀应该在培养几个小时后消退。电穿孔后，在两个细胞胚胎中，多达20%的细胞融合事件也很常见。细胞融合通常可以通过在电极之间仔细地对胚胎的水平轴对齐来避免。
在大鼠胚胎中测试我们的方案并筛选培养的原始细胞，以插入包含两个 loxP 位点的工程化短人工内含子序列。我们注意到，根据下一代序列分析，超过 60% 的囊胚含有正确靶向的敲入等位基因。接下来，进一步测试我们生产活敲入大鼠的方案，我们设计了一个项目来设计针对大鼠 DRD2 基因的 ATG 起始位点的 Cre 重组酶包被序列。
在出生的 11 个后代中，10 个通过 5 个主要同源组、3 个主要同源组的 PCR 分析以及检测 Cre 重组酶的内部 PCR 测定呈阳性。作为对七个不同项目的总结，我们通过对同源臂连接的PCR分析和DNA序列验证，在创始人动物中实现了76%的平均敲入成功率。使用这种AAV介导的DNA递送和双细胞胚胎电穿孔管道，我们体验到的敲入效率明显高于传统方法，用于长达3KB的DNA插入。
同样重要的是要注意，虽然我们证明了该程序在大鼠胚胎中的使用，但它也可以有效地应用于其他物种以产生靶向DNA插入。
