CRISPR tabanlı genom düzenleme araçları, genetiği değiştirilmiş rep modellerinin üretimini büyük ölçüde kolaylaştırdı. CRISPR sistemi, bir Cas9 nükleazına tek bir kılavuz RNA kompleksinden oluşur ve çift sarmallı bir DNA kırılması oluşturmak için genom içindeki bir ilgi dizisini hedeflemek üzere programlanabilir. Bir DNA onarım şablonunun birlikte sunulması yoluyla, bu DNA kırılması, Homoloji Yönlendirilmiş Onarım adı verilen bir işlemle istenen herhangi bir tasarlanmış DNA dizisinin eklenmesiyle birlikte hassas bir şekilde geri yüklenebilir.
Bu süreçle, hedeflenen DNA eklemeleri veya ikameleri ile knock-in sıçan modelleri üretebiliyoruz. Bu protokolü kullanarak, sıçan embriyolarına bir DNA onarım şablonu vermek için adeno-ilişkili virüs kullanan değiştirilmiş bir yaklaşım ve ardından iki hücreli embriyo elektroporasyonu yoluyla CRISPR Cas9 komplekslerinin verilmesi ile birlikte sunuyoruz. AAV serotipleri 1 veya 6, CRISPR aracılı Homoloji Yönlendirilmiş Onarım işlemi yoluyla sıçan genomuna entegre edilmek üzere tasarlanmış tasarlanmış bir DNA onarım şablonu ile paketlenir.
AAV, mikrolitre başına 3 X 10 ila 7. genom kopyalarının nihai konsantrasyonunda 30 mikrolitrelik bir sıçan KSOM ortamı damlasına eklenir. Daha sonra, görünür pronükleuslara sahip taze toplanmış tek hücre evresi embriyoları daha sonra viral transdüksiyonun gerçekleşmesine izin veren AAV içeren ortama aktarılır. Protokolümüzü kullanarak, AAV serotip 1 ve 6, verimli DNA onarım şablonu iletimi için kolayca geçebildiğinden, zona pellucida'yı inceltmeye gerek yoktur.
Embriyolar, gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ve maksimum nem ile AAV ile kültürlenir. Ertesi gün, mikrolitre başına yüz nanogram tek kılavuz RNA ve mikrolitre başına yüz nanogram OptiMIM ortamında seyreltilmiş Cas9 proteini içeren bir elektroporasyon karışımı yapılır. Karışım, CRISPR RNP komplekslerinin oluşumuna izin vermek için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
İnkübasyon süresi boyunca, elektroporatör açılır ve uçlar cam slayt elektrotlarına tutturulur. RNP oluşumu tamamlandıktan sonra, çözeltiye hava kabarcıkları girmemesine dikkat ederek elektrotlar arasına beş mikrolitre elektroporasyon karışımı pipetlenir. Şimdi iki hücre aşamasında olan embriyolar, AAV içeren ortamdan çıkarılır ve elektrotlar arasındaki elektroporasyon karışımına dikkatlice taşınır.
Embriyolar hizalanır ve hiçbirinin elektrot kılığına dokunmamasını sağlar, çünkü bu elektroporasyon sırasında parçalanmaya neden olur. İşte bu prosedürün mikroskopla bir görünümü. Elektrotlar arasındaki hacim arttıkça empedansın azalacağına dikkat etmek de önemlidir.
Bu nedenle ve elektroporasyon karışımını seyreltmemek için, embriyolarla birlikte minimal besiyeri transfer edilmelidir. Daha sonra, üzerinde ohm sembolü bulunan düğmeye basılarak empedans ölçülür. Empedans 0,18 ila 0,3 ohm aralığında olmalıdır.
Menzil içindeyse, başlat düğmesine basılarak elektroporasyon başlatılır. Bu işlem sadece birkaç saniye sürer ve mikroskoptan böyle görünür. Her elektrotta hızla kabarcıklar oluştuğunu fark edeceksiniz.
Elektroporasyondan hemen sonra, embriyolar cam slayttan toplanır ve taze sıçan KSOM ortamında üç kez yıkanır. Embriyolar daha sonra in vitro çalışmalar için kültürlenebilir veya canlı yavrular üretmek için vekil dişilere aktarılabilir. Elektroporasyondan sonra embriyo şişmesinin yaygın olduğuna dikkat etmek önemlidir.
Bu şişlik kültürde birkaç saat sonra inmelidir. Elektroporasyondan sonra iki hücreli embriyonun %20'sine kadar hücresel füzyon olaylarının görülmesi de yaygındır. Hücresel füzyon tipik olarak embriyoların elektrotlar arasında dikkatli bir yatay eksen hizalaması ile önlenebilir.
Protokolümüzün sıçan embriyolarında test edilmesi ve iki loxP bölgesi içeren tasarlanmış kısa bir yapay intron dizisinin eklenmesi için kültürlenmiş patlamaların taranması. Blastosistlerin %60'ından fazlasının yeni nesil dizi analizine dayalı olarak doğru hedeflenmiş knock-in alel içerdiğini belirttik. Daha sonra, canlı knock-in sıçanlar üretmek için protokolümüzü daha fazla test ederek, sıçan DRD2 geninin ATG başlangıç bölgesini hedefleyen bir Cre rekombinaz kaplama dizisi tasarlamak için bir proje tasarlıyoruz.
Doğan 11 yavrudan 10'u, beş asal homoloji kolu, üç asal homoloji kolu ve Cre rekombinazı tespit etmek için dahili bir PCR testi boyunca PCR analizi ile pozitifti. Yedi farklı projenin bir özeti olarak, homoloji kol bağlantılarında PCR analizi ve DNA dizisi doğrulaması ile belirlenen kurucu hayvanlarda ortalama %76'lık bir nakavt başarı oranı elde ettik. Bu AAV aracılı DNA iletimini ve iki hücreli embriyo elektroporasyon boru hattını kullanarak, üç KB uzunluğa kadar DNA eklemeleri için geleneksel yaklaşımlardan önemli ölçüde daha yüksek zincirleme verimlilikler yaşadık.
Bu prosedürün sıçan embriyolarında kullanımını göstermiş olsak da, hedeflenen DNA eklemelerini oluşturmak için diğer türlere de etkili bir şekilde uygulanabileceğini belirtmek önemlidir.
