Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (NO.81860413, 81960455), dem Yunnan Science and Technology Department Fund (202001AY070001-080), der Scientific Research Foundation of Education Department der Provinz Yunnan (2019J1274).

Die Forschung wurde von der medizinischen Ethikkommission des Yunnan Cancer Hospital/des Third Affiliated Hospital der Kunming Medical University genehmigt. Alle Probanden/Erziehungsberechtigten haben eine Einverständniserklärung unterschrieben.
1. Vorbereitung der Objektträger
<ol><li>Schneiden Sie Abschnitte von gepaarten Paraffinblöcken, die primäre Lungentumor- oder Lungenkrebs-Hirnmetastasen enthalten, mit einer Dicke von 4 μm mit einem Mikrotom. Entfernen Sie die Abschnitte zum Wasser und trennen Sie sie mit einer Pinzette, wählen Sie die beste aus und kleben Sie sie auf den polylysinbeschichteten Objektträger.</li>
	<li>Legen Sie die Gewebeobjektträger 30 Minuten lang bei 65 °C in einen Ofen, um die Gewebehaftung zu verbessern.</li>
	<li>Tauchen Sie die Objektträger durch drei Wechsel, die jeweils 10 Minuten dauern, in Xylol.</li>
	<li>Reduzieren Sie allmählich die Alkoholkonzentration und inkubieren Sie die Objektträger 5 Minuten lang in 100 % Ethanol, 5 Minuten lang 90 % Ethanol, 5 Minuten lang 75 % Ethanol und 3 Minuten lang in entionisiertem Wasser.</li>
</ol>2. Wärmeinduzierte Epitopgewinnung (HIER)
<ol><li>Verdünnen Sie 100x Natriumcitrat-Pufferlösung (pH 6,0) auf 1x (10 mM) in deionisiertem Wasser und bereiten Sie genügend Pufferlösung vor, um die Objektträger vollständig einzutauchen.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger in einen Schnellkochtopf und setzen Sie sie 2 Minuten lang hoher Hitze (100 °C) und Druck (~30 psi) aus. Lassen Sie die Objektträger nach dem Erhitzen 3 Minuten lang in destilliertem Wasser auf Raumtemperatur abkühlen.</li>
	<li>Eine Packung mit 52 g phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; pulverisiert) in 5 l deionisiertem Wasser zur Herstellung einer PBS-Pufferlösung (pH 7,0) auflösen. Legen Sie die Objektträger 5 Minuten lang mit 3 Wechseln in die PBS-Pufferlösung.</li>
</ol>3. Peroxidase-Blockierung
<ol><li>Die Schnitte mit 3% Wasserstoffperoxid bedecken und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Spülen Sie die Objektträger in PBS aus, 3x für jeweils 5 Minuten.</li>
	<li>Verwenden Sie Filterpapier, um überschüssiges Wasser vom Umfang des Gewebes wegzunehmen. Achten Sie in der Zwischenzeit darauf, dass das Gewebe feucht ist.</li>
</ol>4. Primärantikörper-Inkubation für die erste Runde
<ol><li>Bereiten Sie eine Arbeitsmischung der Primärantikörper für CD8 (monoklonaler Kaninchen-Antikörper, Klon SP16) und CD20 (monoklonaler Maus-Antikörper, Klon L26) her, verdünnt 1:50 in Bond-Primärantikörper-Verdünnungsmittel.</li>
	<li>Den Antikörperkomplex auf die Schnitte geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung aus 0,1% Tween/phosphatgepufferter Kochsalzlösung vor: 1 ml Tween in 1 l PBS-Pufferlösung.</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitte mit 0,1% Tween/phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 3x für jeweils 5 min. Verwenden Sie Filterpapier, um überschüssiges Wasser vom Umfang des Gewebes abzuleiten, während Sie sicherstellen, dass das Gewebe feucht ist.</li>
</ol>5. Inkubation von Sekundärantikörpern für die erste Runde
<ol><li>Bereiten Sie eine Mischung aus fluoreszenzmarkiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (Anregung (Ex): 495 nm) und Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (Ex: 578 nm) her, verdünnt 1:50 in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung. Der Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper bindet an den primären Antikörper von CD8 und der Ziegen-Anti-Maus-Antikörper an den primären Antikörper von CD20.</li>
	<li>Die sekundäre Antikörpermischung tropfenweise zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
</ol>6. Wärmeinduzierte Epitopgewinnung und Peroxidase-Blockierung
<ol><li>Verdünnen Sie 100x Natriumcitrat (pH 6,0) auf 1x (10 mM) in deionisiertem Wasser und bereiten Sie genügend Pufferlösung vor, um die Objektträger vollständig einzutauchen.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger in einen Schnellkochtopf und setzen Sie sie 1 Minute lang hoher Hitze (100 °C) und Druck (~30 psi) aus. Legen Sie die Objektträger nach dem Erhitzen 3 Minuten lang in destilliertes Wasser, um sie auf Raumtemperatur abzukühlen.</li>
	<li>Führen Sie die Peroxidase-Blockierung wie in Schritt 3 beschrieben durch.</li>
</ol>7. Inkubation von Primärantikörpern für die zweite Runde
<ol><li>Bereiten Sie eine Arbeitsmischung der primären Antikörper für CD3 (monoklonaler Kaninchen-Antikörper, Klon SP7) und CK (monoklonaler Maus-Antikörper, MX005) vor, verdünnt 1:50 in primärem Antikörperverdünnungsmittel.</li>
	<li>Den Antikörperkomplex auf die Schnitte geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Mit 0,1% Tween/phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen, 3x für jeweils 5 min. Verwenden Sie Filterpapier, um überschüssiges Wasser vom Umfang des Gewebes abzuleiten, während Sie sicherstellen, dass das Gewebe feucht ist.</li>
</ol>8. Sekundäre Antikörperinkubation für die zweite Runde
<ol><li>Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (z. B. 652 nm) und Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (z. B. 590 nm) herstellen, Verdünnung 1:50 in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung. Der Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper bindet an den primären Antikörper von CD3 und der Ziegen-Anti-Maus-Antikörper an den primären Antikörper von CK.</li>
	<li>Sekundäre Antikörpermischung tropfenweise zugeben, 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Mit 0,1% Tween/phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen, 3x für jeweils 5 min.</li>
</ol>9. Autofluoreszenzlöschung und DAPI-Färbung
<ol><li>Reagenz (0,15 M/L KMnO4) 1 Minute lang in den Gewebeschnitt geben. 5 Min. mit fließendem Wasser abspülen. ACHTUNG: KMnO4 ist giftig und schädigt die Haut. Achten Sie darauf, beim Umgang mit den Objektträgern Handschuhe zu tragen. Wenn die Flüssigkeit auf die Haut tropft, wischen Sie sie schnell mit sauberen Servietten ab und spülen Sie sie mit fließendem Wasser ab.</li>
	<li>Trocknen Sie den Objektträger mit steigenden Alkoholkonzentrationen (70 %, 90 %, 100 %) für 3 Minuten in jeder Konzentration.</li>
	<li>Fügen Sie DAPI und Deckglas für multispektrale Bildgebung hinzu. Die Menge an DAPI hängt von der Gewebegröße ab. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe nach dem Hinzufügen des Deckglases vollständig von DAPI bedeckt ist.</li>
</ol>10. Scannen von Objektträgern
<ol><li>Legen Sie die Objektträger auf ein Tablett und drücken Sie, bis es nicht mehr weiter geschoben werden kann.</li>
	<li>Um das Programm zu starten, doppelklicken Sie auf das Programmsymbol auf dem Desktop. Während des Startvorgangs wird das Modusauswahlfenster angezeigt. Das Auswahlfenster zeigt zwei Hellfeld- und Fluoreszenzmodi an: den automatischen Modus und den manuellen Modus. Klicken Sie im Fluoreszenz-Scan-Modus auf Automatischer Modus.</li>
	<li>Bewegen Sie den Mauszeiger über ? , um die Informationen zu den Einstellungen anzuzeigen. Klicken Sie auf Filtereinstellung > Filterkanal , um die Kanalnummer > Pseudofarbe auszuwählen. Definieren Sie die Farbe und speichern Sie.</li>
	<li>Klicken Sie auf Routinearbeiten > Scanmodus > Vollautomatisch. Klicken Sie auf Routinearbeit > Folienname , um den Foliennamen für die Ausgabe zu definieren. Klicken Sie > Kanaleinstellungen auf Routinearbeit , um Filter auszuwählen.</li>
	<li>Klicken Sie auf Routinearbeit > Scanoptionen , um die resultierende Qualität und den Speicherort des virtuellen Objektträgers zu bestimmen.</li>
	<li>Klicken Sie auf Vorschau , um den Schwellenwert festzulegen und den zu scannenden Bereich auszuwählen.</li>
	<li>Klicken Sie auf Hardware > Filter > Live > Autofokus > Automatische Belichtung > Digitale Verstärkung > Häkchen Manuelle Belichtungszeit verwenden > Häkchen, um den Bereich > Strom einstellen einzuschränken.</li>
	<li>Klicken Sie auf Routinearbeiten > Scan starten. Wählen Sie die Vergrößerungsstufe als 20x oder 40x. Wählen Sie 20x für geeignete Dateigrößen. MRXS wird durch den 3D Pannoramic MIDI Scanner definiert. Die Bilderweiterung kann auch in ein TIFF-Bild geändert werden.</li>
	<li>Klicken Sie auf Dia-Viewer > Multiview-Toolbox , um das Bild für die Konfiguration auszuwählen und dann auszurichten und zu integrieren.</li>
</ol>11. Quantitative Bewertung von Zelldichten
<ol><li>Quantifizieren Sie den Prozentsatz positiver Immunzellen (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) in Tumor- und Stromabereichen mit der Halo 10 Scanner-Software. Validieren Sie die CK-Färbung zur Definition von Tumorgewebe.</li>
</ol>

In situ immunhistochemischer Nachweis von Immunzellmarkern in Krebsgeweben

<ol>
	<li>Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastases+to+the+central+nervous+system:+Molecular+basis+and+clinical+considerations.">Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations.</a> J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).</li><li>Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+imaging+in+early+stage+non-small+cell+lung+cancer:+still+a+controversial+topic.">Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic.</a> J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).</li><li>Vilari&#241;o, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+in+NSCLC+patients+with+brain+metastases.+Understanding+brain+tumor+microenvironment+and+dissecting+outcomes+from+immune+checkpoint+blockade+in+the+clinic.">Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic.</a> Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).</li><li>Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tumor+microenvironment:+Potential+strategy+for+cancer+therapeutics.">Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).</li><li>Goldberg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+for+management+of+patients+with+NSCLC+and+brain+metastases:+long-term+results+and+biomarker+analysis+from+a+non-randomised,+open-label,+phase+2+trial.">Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial.</a> Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).</li><li>Sukswai, N., Khoury, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+Innovations+for+Diagnosis+and+Tissue-Based+Biomarker+Detection.">Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection.</a> Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+Investigative+and+Toxicologic+Pathology.">Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology.</a> Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+controls+under+control:+the+time+is+now+for+immunohistochemistry.">Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry.</a> J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).</li><li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Wong, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantitative+analysis+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+immunotherapy+outcome+in+metastatic+melanoma.">Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma.</a> Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).</li><li>Sanchez, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunofluorescence+to+measure+dynamic+changes+in+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+PD-L1+in+early-stage+breast+cancer.">Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer.</a> Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunohistochemistry+indicates+biomarkers+in+colorectal+cancer.">Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer.</a> Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).</li><li>Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+immunohistochemistry+protocol+for+detecting+the+guidance+cue+Netrin-1+in+neural+tissue.">An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue.</a> MethodsX. 5, 1-7 (2018).</li><li>McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+immunohistochemical+identification+and+localization+of+Osterix+in+periosteum-wrapped+constructs+for+tissue+engineering+of+bone.">A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone.</a> J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+black+B+reduces+autofluorescence+in+murine+renal+tissue.">Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue.</a> Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Society+for+Immunotherapy+of+Cancer+statement+on+best+practices+for+multiplex+immunohistochemistry+(IHC)+and+immunofluorescence+(IF)+staining+and+validation.">The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation.</a> J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).</li><li>Clarke, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+automated+technology+for+multiplex+biomarker+imaging+and+application+to+breast+cancer.">A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer.</a> Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Ahrens, M. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+pretreatment+of+growth+plate+cartilage+increases+immunofluorescence+sensitivity.">Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity.</a> J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+characteristics+of+autofluorescence+in+renal+tissue+and+methods+for+reducing+fluorescence+background+in+confocal+laser+scanning+microscopy.">Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy.</a> J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Wir haben den Prozess für die zyklische Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie-Färbung beschrieben. Die Auswahl der primären Antikörper ist ein entscheidender Aspekt des Fluoreszenz-Immunhistochemie-Assays, und monoklonale Antikörper werden für eine bessere Spezifität und Wiederholbarkeit empfohlen. Um die Arbeitskonzentration des primären Antikörpers zu optimieren, wurde eine Reihe von Verdünnungen durch immunhistochemische Experimente getestet. Sowohl Positivkontrollen (zur Beurteilung der Zielantigenexpressi...

Hirnmetastasen (BM) stellen die häufigsten Tumoren des zentralen Nervensystems (ZNS) dar, die bei fast der Hälfte der Fälle von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) auftreten und eine schlechte Prognosehaben 1. Schätzungsweise 10 % bis 20 % der NSCLC-Patienten haben zum Zeitpunkt der Erstdiagnose bereits eine BM, und etwa 40 % der NSCLC-Fälle entwickeln im Verlauf der Behandlung eine BM2. Die Tumormikroumgebung (TME) ist eng mit dem Auftreten und der BM von NSCLC verbunden, einschließlich verschiedener Komponenten wie Blutgefäße, Fibroblasten, Makrophagen, extrazelluläre Matrix (EZM), lymphoide, aus dem Knochenmark stammende Immunzellen und Signalmoleküle 3,4. Mikroumgebungs-Immunzellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Beeinflussung des Wachstums und der Entwicklung von Krebszellen. Hirnmetastasen stellen zahlreiche potenzielle Behandlungsziele dar, die durch komplexe immunologische Mikroumgebungen und Signalprozesse gekennzeichnet sind. Beispielsweise haben PD-1-Inhibitoren klinische Wirksamkeit bei Patienten mit Lungenkrebs-Hirnmetastasen (LCBM) als Immun-Checkpoint-Inhibitor (ICI) gezeigt. Die Häufigkeit des Ansprechens auf die PD-1-Therapie variiert jedoch zwischen primärem NSCLC und LCBM5, was darauf hindeutet, dass die Tumorimmunmikroumgebung als kritischer ICI-Regulator fungiert.
Die Immunhistochemie (IHC) ist ein unschätzbares Werkzeug in den Bereichen Biologie, Grundlagenmedizin und Pathologie6. Diese Nachweismethode visualisiert die Antigenexpression durch die Interaktion von Antigen-Antikörper auf einem Gewebeobjektträger7. IHC wird zur Diagnose prädiktiver Marker, zur Bewertung prognostischer Marker, zur Steuerung gezielter Therapien und zur Erforschung der biologischen Funktionen von Tumorzellen verwendet8. Die traditionelle IHC-Methode kann jedoch jeweils nur einen Biomarker nachweisen. Um diese Einschränkung zu beheben, hat die Innovation der immunhistochemischen Technologie zur Entwicklung der Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie (mfIHC) geführt, die die gleichzeitige Identifizierung mehrerer Proteinmarker auf demselben Gewebeobjektträger ermöglicht, sowohl im Hellfeld als auch im Fluoreszenzfeld9. Dieser Fortschritt ermöglicht eine genaue Analyse der Zellzusammensetzung und der molekularen Wechselwirkungen zwischen Stromazellen, Immunzellen und Krebszellen innerhalb der TME.
In dieser Studie stellen wir ein Protokoll für zyklische Multiplex-Immunhistochemie vor, um die räumliche Verteilung von Immunzellen zu analysieren. Zwei Primärantikörper verschiedener Spezies, wie Kaninchen und Ratte, werden gleichzeitig für die Inkubation ausgewählt, gefolgt von fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern. Die Antigen-Retrieval wird nach jeder Runde der Antigen-Antikörper-Reaktion durchgeführt. Die Autofluoreszenz wird blockiert und 4', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wird zur Färbung der Zellkerne verwendet. Das Panel umfasst den sequentiellen Nachweis von CD3, CD8, CD20 und CK, die Zellen werden nach den Markern kategorisiert: Tumorzellen (CK+), reife T-Zellen (CD3+), zytotoxische T-Zellen (CD3+CD8+), B-Zellen (CD20+)10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15 mol/L KmnO4</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co. Ltd.</td>
			<td>MST-8005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x sodium citrate&#160;</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>MVS-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>SP KIT-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Pannoramic MIDI</td>
			<td>3D histech Ltd</td>
			<td>Pannoramic MIDI 1.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond primary antibody diluent</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>kit-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;kit-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>RMA-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co. Ltd.</td>
			<td>MAB-0671,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>sig-ma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore Multicut</td>
			<td>lecia</td>
			<td>2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS(powder)</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>PBS-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide viwer&#160;</td>
			<td>3D histech Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry

Die Tumormikroumgebung beinhaltet Wechselwirkungen zwischen Wirtszellen, Tumorzellen, Immunzellen, Stromazellen und Gefäßen. Die Charakterisierung und räumliche Organisation von Immunzelluntergruppen und Zielproteinen ist für prognostische und therapeutische Zwecke von entscheidender Bedeutung. Dies hat zur Entwicklung von Multiplex-Immunhistochemie-Färbemethoden geführt. Die Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Marker und ermöglicht so ein umfassendes Verständnis der Zellfunktion und der interzellulären Interaktionen. In diesem Artikel beschreiben wir einen Arbeitsablauf für den zyklischen Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie-Assay und seine Anwendung in der Quantifizierungsanalyse von Lymphozyten-Untergruppen. Die zyklische Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie-Färbung folgt ähnlichen Schritten und Reagenzien wie die Standard-Immunhistochemie, einschließlich Antigengewinnung, zyklischer Antikörperinkubation und Färbung auf einem formalinfixierten paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeobjektträger. Während der Antigen-Antikörper-Reaktion wird eine Mischung aus Antikörpern verschiedener Spezies hergestellt. Bedingungen, wie z. B. die Antigen-Retrieval-Zeit und die Antikörperkonzentration, werden optimiert und validiert, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Diese Technik ist reproduzierbar und dient als wertvolles Werkzeug für die Immuntherapieforschung und klinische Anwendungen.

Brain metastases (BM) represent the most common central nervous system (CNS) tumors, occurring in nearly half of non-small cell lung cancer cases (NSCLC), with a poor prognosis1. An estimated 10%-20% of NSCLC patients already have BM at the time of initial diagnosis, and approximately 40% of NSCLC cases will develop BM during the course of treatment2. The tumor microenvironment (TME) is closely associated with NSCLC occurrence and BM, including various components, such as blood vessels, fibroblasts, macrophages, extracellular matrix (ECM), lymphoid, bone marrow-derived immune cells, and signaling molecules3,4. Microenvironmental immune cells play a crucial role in influencing cancer cell growth and development. Brain metastases present numerous potential treatment targets characterized by complex immunological microenvironments and signaling processes. For instance, PD-1 inhibitors have shown clinical efficacy for patients with lung cancer brain metastasis (LCBM) as an immune-checkpoint inhibitor (ICI). However, the frequency of responses to PD-1 therapy varies between primary NSCLC and LCBM5, suggesting that the tumor immune microenvironment acts as a critical ICI regulator.
Immunohistochemistry (IHC) is an invaluable tool in the fields of biology, foundation medicine, and pathology6. This detection method visualizes antigen expression through the interaction of antigen-antibody on a tissue slide7. IHC is used for diagnosing predictive markers, evaluating prognostic markers, guiding targeted therapies, and exploring the biological functions of tumor cells8. However, the traditional IHC method can only detect one biomarker at a time. To address this limitation, the innovation of immunohistochemical technology has led to the development of multiplex fluorescence immunohistochemistry (mfIHC), which allows for the simultaneous identification of multiple protein markers on the same tissue slide, both in bright field and fluorescent field9. This advancement provides accurate analysis of cell composition and molecular interactions among stromal cells, immune cells, and cancer cells within the TME.
In this study, we present a protocol for multiplex cyclic immunohistochemistry to analyze the spatial distribution of immune cells. Two primary antibodies of different species, such as rabbit and rat, are chosen for incubation simultaneously, followed by fluorescence-labeled secondary antibodies. Antigen retrieval is performed after each round of antigen-antibody reaction. Autofluorescence is blocked, and 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) is used for staining the nuclei. The panel includes sequential detection of CD3, CD8, CD20, and CK, cells are categorized according to the markers: tumor cells (CK+), mature T cells (CD3+), cytotoxic T cells (CD3+CD8+), B cells (CD20+)10,11.

Autor im Rampenlicht: Effizienter Nachweis von Immunzellinfiltration in Krebsgeweben mittels fluoreszierender Immunhistochemie

Zyklische Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie

The challenge for immunohistochemistry is to choose the species of primary and secondary monoclonal antibodies to avoid cross-reactivity and obtain better specificity and repeatability. Gender decision is necessary to optimize the antibody dilution ratio. Meanwhile, another challenge is to align the localization of and the sub structures.The use of this protocol meet the technical evolution of the distribution of three lymphocytic subpopulations, such as CT three, positive CT three, and CT eight positive and CT 20 positive based on in cell counts and the protein expression in conserv tissues, the level of infiltration can be observed too. In our protocol, the parameter Antibodies and the Fluor secondary antibodies derive from different species at the iso mixture making us a efficient. This measure also shows a specific measure between antibody and antigen.

Wir präsentieren ein Protokoll für den zyklischen Antigennachweis mit 5-Farben-Multiplex-Fluoreszenz auf einem einzigen Objektträger. Durch unsere Optimierung des Assays ermöglichen wir die Inkubation von zwei Antikörpern aus verschiedenen Spezies (Abbildung 1). Zu den notwendigen Geräten für den Versuchsablauf gehören ein Schnellkochtopf und eine Immunfärbebox (Abbildung 2A).
Nach Abschluss des Assays definieren wir die Pseu...

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Die zyklische Multiplex-Immunhistochemie ermöglicht den gleichzeitigen In-situ-Nachweis mehrerer Marker durch wiederholte Antigen-Antikörper-Inkubation, Bildscannen sowie Bildausrichtung und -integration. Hier stellen wir das Operationsprotokoll zur Identifizierung von Immunzellsubstraten mit dieser Technologie in Lungenkrebs- und gepaarten Hirnmetastasenproben vor.

The tumor microenvironment involves interactions between host cells, tumor cells, immune cells, stromal cells, and vasculature. Characterizing and ...

Die Herausforderung für die Immunhistochemie besteht darin, die Spezies der primären und sekundären monoklonalen Antikörper auszuwählen, um Kreuzreaktivität zu vermeiden und eine bessere Spezifität und Wiederholbarkeit zu erreichen. Die Entscheidung über das Geschlecht ist notwendig, um das Antikörperverdünnungsverhältnis zu optimieren. Eine weitere Herausforderung besteht darin, die Lokalisierung und die Unterstrukturen aufeinander abzustimmen.Die Verwendung dieses Protokolls entspricht der technischen Entwicklung der Verteilung von drei lymphozytären Subpopulationen, wie CT drei, positiv CT drei und CT acht positiv und CT 20 positiv Basierend auf der Zellzahl und der Proteinexpression in konservierten Geweben, kann auch der Grad der Infiltration beobachtet werden. In unserem Protokoll stammen der Parameter Antikörper und die Fluor-Sekundärantikörper von verschiedenen Spezies in der Iso-Mischung, was uns zu einem effizienten Partner macht. Dieses Maß zeigt auch ein spezifisches Maß zwischen Antikörper und Antigen.

multiplex-cyclic-fluorescent-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry

438 Aufrufe.  The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital. Die Herausforderung für die Immunhistochemie besteht darin, die Spezies der primären und sekundären monoklonalen Antikörper auszuwählen, um Kreuzreaktivität zu vermeiden und eine bessere Spezifität und Wiederholbarkeit zu erreichen. Die Entscheidung über das Geschlecht ist notwendig, um das Antikörperverdünnungsverhältnis zu optimieren. Eine weitere Herausforderung besteht darin, die Lokalisierung und die Unterstrukturen aufeinander abzustimmen.Die Verwendung dieses Protokol...