Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NO.81860413, 81960455), Yunnan Bilim ve Teknoloji Departmanı Fonu (202001AY070001-080), Yunnan Eyaleti Eğitim Departmanı Bilimsel Araştırma Vakfı (2019J1274) tarafından desteklenmiştir.

Araştırma, Yunnan Kanser Hastanesi / Kunming Tıp Üniversitesi Üçüncü Bağlı Hastanesi tıbbi etik komitesi tarafından onaylandı. Tüm denekler/yasal vasiler bilgilendirilmiş onam imzaladı.
1. Slayt hazırlama
<ol><li>Primer akciğer tümörü veya akciğer kanseri beyin metastazı hücrelerini içeren eşleştirilmiş parafin bloklarının bölümlerini bir mikrotom kullanarak 4 μm kalınlığında kesin. Bölümleri suya çıkarın ve cımbızla ayırın, en iyisini seçin ve polilisin kaplı slayta yapıştırın.</li>
	<li>Doku yapışmasını artırmak için doku slaytlarını 65 °C'de 30 dakika fırına koyun.</li>
	<li>Slaytları, her biri 10 dakika süren üç değişiklikle ksilene daldırın.</li>
	<li>Alkol konsantrasyonunu kademeli olarak azaltın ve slaytları 5 dakika boyunca %100 etanol, 5 dakika boyunca %90 etanol, 5 dakika boyunca %75 etanol ve 3 dakika boyunca deiyonize suda inkübe edin.</li>
</ol>2. Isı kaynaklı epitop alımı (HIER)
<ol><li>100x sodyum sitrat tampon çözeltisini (pH 6.0) deiyonize suda 1x (10 mM) ile seyreltin ve slaytları tamamen daldırmak için yeterli tampon çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Slaytları düdüklü tencereye yerleştirin, 100 dakika boyunca yüksek ısıya (30 °C) ve basınca (~2 psi) maruz bırakın. Isıttıktan sonra, slaytları damıtılmış suda 3 dakika oda sıcaklığına soğumaya bırakın.</li>
	<li>PBS tampon çözeltisi (pH 7.0) hazırlamak için bir paket 52 g fosfat tamponlu salin (PBS; toz) 5 L deiyonize suda çözün. Slaytları 3 değişiklikle 5 dakika boyunca PBS tampon çözeltisine yerleştirin.</li>
</ol>3. Peroksidaz blokajı
<ol><li>Bölümleri% 3 hidrojen peroksit ile kaplayın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Slaytları PBS'de 3x, her biri 5 dakika durulayın.</li>
	<li>Fazla suyu dokunun çevresinden emmek için filtre kağıdı kullanın. Bu arada, dokunun nemli olduğundan emin olun.</li>
</ol>4. İlk tur için primer antikor inkübasyonu
<ol><li>CD8 (Tavşan monoklonal antikoru, klon SP16) ve CD20 (fare monoklonal antikoru, klon L26) için birincil antikorların çalışan bir karışımını hazırlayın, Bond birincil antikor seyrelticisinde 1:50 oranında seyreltin.</li>
	<li>Antikor kompleksini bölümlere ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>% 0.1 Tween / fosfat tamponlu salin çözeltisi hazırlayın: 1 L PBS tampon çözeltisinde 1 mL Tween.</li>
	<li>Bölümleri %0,1 Tween/fosfat tamponlu tuzlu su ile 3 kez 5 dakika yıkayın. Fazla suyu dokunun çevresinden uzaklaştırmak için filtre kağıdı kullanın, bu arada dokunun nemli olduğundan emin olun.</li>
</ol>5. İlk tur için ikincil antikor inkübasyonu
<ol><li>Fosfat tampon salin içinde 1:50 oranında seyreltilmiş, floresan etiketli keçi anti-tavşan antikoru (Uyarma (Ex): 495 nm) ve keçi anti-fare antikoru (Ex: 578 nm) karışımı hazırlayın. Keçi anti-tavşan antikoru, CD8'in primer antikoruna bağlanır ve keçi anti-fare antikoru, CD20'nin primer antikoruna bağlanır.</li>
	<li>İkincil antikor karışımını damla damla ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
</ol>6. Isı kaynaklı epitop alımı ve peroksidaz blokajı
<ol><li>100x sodyum sitrat (pH 6.0) ila 1x (10 mM) deiyonize suda seyreltin ve slaytları tamamen daldırmak için yeterli tampon çözelti hazırlayın.</li>
	<li>Slaytları bir düdüklü tencereye koyun ve 1 dakika boyunca yüksek ısıya (100 °C) ve basınca (~30 psi) maruz bırakın. Isıttıktan sonra, slaytları 3 dakika oda sıcaklığına soğuması için damıtılmış suya koyun.</li>
	<li>3. adımda açıklandığı gibi peroksidaz blokajı gerçekleştirin.</li>
</ol>7. İkinci tur için primer antikor inkübasyonu
<ol><li>Birincil antikor seyrelticisinde 1:50 oranında seyreltilmiş CD3 (Tavşan monoklonal antikoru, klon SP7) ve CK (fare monoklonal antikoru, MX005) için birincil antikorların çalışma bir karışımını hazırlayın.</li>
	<li>Antikor kompleksini bölümlere ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>%0,1 Tween/fosfat tamponlu tuzlu su ile 3 kez 5 dakika yıkayın. Fazla suyu dokunun çevresinden uzaklaştırmak için filtre kağıdı kullanın, bu arada dokunun nemli olduğundan emin olun.</li>
</ol>8. İkinci tur için ikincil antikor inkübasyonu
<ol><li>Keçi anti-tavşan (Örn: 652 nm) ve keçi anti-fare antikoru (Örn: 590 nm) karışımını hazırlayın, fosfat tampon salin içinde 1:50 seyreltin. Keçi anti-tavşan antikoru, CD3'ün primer antikoruna bağlanır ve keçi anti-fare antikoru, CK'nin primer antikoruna bağlanır.</li>
	<li>İkincil antikor karışımını damla damla ekleyin, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. %0,1 Tween/fosfat tamponlu tuzlu su ile 3 kez 5 dakika yıkayın.</li>
</ol>9. Otofloresan söndürme ve DAPI boyama
<ol><li>Doku bölümüne 1 dakika boyunca reaktif (0.15 M / L KMnO4) ekleyin. 5 dakika akan su ile durulayın. DİKKAT: KMnO4 toksiktir ve cilde zarar verir. Slaytları tutarken eldiven giydiğinizden emin olun. Sıvı cilde damlarsa, temiz peçetelerle hızlıca silin ve akan suyla yıkayın.</li>
	<li>Slaytı artan alkol konsantrasyonlarıyla (%70, %90, %100) her konsantrasyonda 3 dakika kurutun.</li>
	<li>Multispektral görüntüleme için DAPI ve lamel ekleyin. DAPI miktarı doku büyüklüğüne bağlıdır. Lamel eklendikten sonra dokunun tamamen DAPI ile kaplandığından emin olun.</li>
</ol>10. Slayt taraması
<ol><li>Slaytları bir tepsiye yerleştirin ve daha fazla itilemeyecek duruma gelene kadar itin.</li>
	<li>Programı başlatmak için masaüstündeki Program Simgesine çift tıklayın. Başlatma sırasında mod seçim penceresi görüntülenir. Seçim penceresinde iki parlak alan ve floresan modu görüntülenir: otomatik mod ve manuel mod. Floresan tarama modunda, Otomatik Mod'u tıklatın.</li>
	<li>Fare imlecini üzerine getirin ? Ayarlarla ilgili bilgileri görüntülemek için düğmesine basın. Kanal Numarası'nı > Sahte Renk'i seçmek için Filtre Ayarı > Filtre Kanalı'nı tıklatın. Rengi tanımlayın ve kaydedin.</li>
	<li>Tarama Modu > Tam Otomatik > Rutin Çalışma'ya tıklayın. Çıktı için slayt adını tanımlamak için Rutin Çalışma > Slayt Adı'nı tıklatın. Filtreleri seçmek için Kanal Ayarları> Rutin İş'e tıklayın.</li>
	<li>Sanal slaytın elde edilen kalitesini ve depolama konumunu belirlemek için Tarama Seçenekleri'ni > Rutin Çalışma'yı tıklatın.</li>
	<li>Eşik ayarı ve taranacak aralığın seçimi için Önizleme'ye tıklayın.</li>
	<li>Donanım > Filtreleri'ni > Canlı > Otomatik Odaklama > Otomatik Pozlama > Dijital Kazanç > Manuel pozlama süresini kullan seçeneğini işaretleyin > Aralığı sınırlamayı işaretleyin > Akımı Ayarla'yı tıklayın.</li>
	<li>Taramayı Başlat> Rutin İş'e tıklayın. Büyütme seviyesini 20x veya 40x olarak seçin. Uygun dosya boyutları için 20x'i seçin. MRXS uzantısı 3D Pannoramic MIDI tarayıcı tarafından tanımlanır. Resim uzantısı da TIFF resmi olarak değiştirilebilir.</li>
	<li>Confocal için görüntüyü seçmek için Slayt Görüntüleyici > Çoklu Görünüm Araç Kutusu'nu tıklatın, ardından görüntüyü hizalayın ve bütünleştirin.</li>
</ol>11. Hücre yoğunluklarının kantitatif değerlendirilmesi
<ol><li>Halo 10 tarayıcı yazılımı ile tümör ve stroma bölgelerindeki pozitif bağışıklık hücrelerinin (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) yüzdelerini ölçün. Tümör dokusunu tanımlamak için CK boyamayı doğrulayın.</li>
</ol>

Kanser Dokularında İmmün Hücre Belirteçlerinin Yerinde İmmünohistokimyasal Tespiti

<ol>
	<li>Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastases+to+the+central+nervous+system:+Molecular+basis+and+clinical+considerations.">Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations.</a> J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).</li><li>Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+imaging+in+early+stage+non-small+cell+lung+cancer:+still+a+controversial+topic.">Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic.</a> J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).</li><li>Vilari&#241;o, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+in+NSCLC+patients+with+brain+metastases.+Understanding+brain+tumor+microenvironment+and+dissecting+outcomes+from+immune+checkpoint+blockade+in+the+clinic.">Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic.</a> Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).</li><li>Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tumor+microenvironment:+Potential+strategy+for+cancer+therapeutics.">Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).</li><li>Goldberg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+for+management+of+patients+with+NSCLC+and+brain+metastases:+long-term+results+and+biomarker+analysis+from+a+non-randomised,+open-label,+phase+2+trial.">Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial.</a> Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).</li><li>Sukswai, N., Khoury, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+Innovations+for+Diagnosis+and+Tissue-Based+Biomarker+Detection.">Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection.</a> Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+Investigative+and+Toxicologic+Pathology.">Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology.</a> Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+controls+under+control:+the+time+is+now+for+immunohistochemistry.">Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry.</a> J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).</li><li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Wong, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantitative+analysis+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+immunotherapy+outcome+in+metastatic+melanoma.">Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma.</a> Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).</li><li>Sanchez, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunofluorescence+to+measure+dynamic+changes+in+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+PD-L1+in+early-stage+breast+cancer.">Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer.</a> Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunohistochemistry+indicates+biomarkers+in+colorectal+cancer.">Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer.</a> Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).</li><li>Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+immunohistochemistry+protocol+for+detecting+the+guidance+cue+Netrin-1+in+neural+tissue.">An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue.</a> MethodsX. 5, 1-7 (2018).</li><li>McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+immunohistochemical+identification+and+localization+of+Osterix+in+periosteum-wrapped+constructs+for+tissue+engineering+of+bone.">A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone.</a> J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+black+B+reduces+autofluorescence+in+murine+renal+tissue.">Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue.</a> Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Society+for+Immunotherapy+of+Cancer+statement+on+best+practices+for+multiplex+immunohistochemistry+(IHC)+and+immunofluorescence+(IF)+staining+and+validation.">The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation.</a> J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).</li><li>Clarke, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+automated+technology+for+multiplex+biomarker+imaging+and+application+to+breast+cancer.">A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer.</a> Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Ahrens, M. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+pretreatment+of+growth+plate+cartilage+increases+immunofluorescence+sensitivity.">Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity.</a> J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+characteristics+of+autofluorescence+in+renal+tissue+and+methods+for+reducing+fluorescence+background+in+confocal+laser+scanning+microscopy.">Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy.</a> J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).</li></ol>

Yazarlar, bu yazıda bildirilen çalışmayı etkilemiş gibi görünebilecek bilinen hiçbir rakip mali çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.

Multipleks siklik floresan immünohistokimya boyama sürecini tanımladık. Primer antikor seçimi, floresan immünohistokimya testinin çok önemli bir yönüdür ve daha iyi özgüllük ve tekrarlanabilirlik için monoklonal antikorlar önerilir. Primer antikorun çalışma konsantrasyonunu optimize etmek için, immünohistokimya deneyleri yoluyla bir dizi seyreltme test edilmiştir. Hem pozitif kontroller (hedef antijen ekspresyonunu değerlendirmek için) hem de negatif kontroller (primer antikor inkübasyonu yok) es...

Beyin metastazları (BM), küçük hücreli dışı akciğer kanseri vakalarının (KHDAK) yaklaşık yarısında meydana gelen ve kötü prognozlu en yaygın merkezi sinir sistemi (MSS) tümörlerini temsil eder1. KHDAK hastalarının tahminen %10-20'si ilk tanı sırasında zaten BM'ye sahiptir ve KHDAK vakalarının yaklaşık %40'ında tedavi sırasında KHDAK gelişecektir2. Tümör mikroçevresi (TME), kan damarları, fibroblastlar, makrofajlar, hücre dışı matriks (ECM), lenfoid, kemik iliği kaynaklı bağışıklık hücreleri ve sinyal molekülleri gibi çeşitli bileşenler dahil olmak üzere NSCLC oluşumu ve BM ile yakından ilişkilidir 3,4. Mikroçevresel bağışıklık hücreleri, kanser hücresi büyümesini ve gelişimini etkilemede çok önemli bir rol oynar. Beyin metastazları, karmaşık immünolojik mikroortamlar ve sinyalizasyon süreçleri ile karakterize çok sayıda potansiyel tedavi hedefi sunar. Örneğin, PD-1 inhibitörleri, bir bağışıklık kontrol noktası inhibitörü (ICI) olarak akciğer kanseri beyin metastazı (LCBM) olan hastalar için klinik etkinlik göstermiştir. Bununla birlikte, PD-1 tedavisine yanıtların sıklığı primer KHDAK ve LCBM5 arasında değişir, bu da tümör immün mikroçevresinin kritik bir ICI düzenleyici görevi gördüğünü düşündürür.
İmmünohistokimya (IHC) biyoloji, temel tıp ve patoloji alanlarında paha biçilmez bir araçtır6. Bu tespit yöntemi, bir doku lamı7 üzerindeki antijen-antikorun etkileşimi yoluyla antijen ekspresyonunu görselleştirir. IHC, prediktif belirteçleri teşhis etmek, prognostik belirteçleri değerlendirmek, hedefe yönelik tedavileri yönlendirmek ve tümör hücrelerinin biyolojik işlevlerini araştırmak için kullanılır8. Bununla birlikte, geleneksel IHC yöntemi bir seferde yalnızca bir biyobelirteç tespit edebilir. Bu sınırlamayı ele almak için, immünohistokimyasal teknolojinin yeniliği, hem parlak alanda hem de floresan alanda aynı doku lamı üzerinde birden fazla protein belirtecinin aynı anda tanımlanmasına izin veren multipleks floresan immünohistokimyasının (mfIHC) geliştirilmesine yol açmıştır9. Bu ilerleme, TME içindeki stromal hücreler, bağışıklık hücreleri ve kanser hücreleri arasındaki hücre bileşiminin ve moleküler etkileşimlerin doğru analizini sağlar.
Bu çalışmada, immün hücrelerin mekansal dağılımını analiz etmek için multipleks siklik immünohistokimya için bir protokol sunuyoruz. Tavşan ve sıçan gibi farklı türlerin iki birincil antikoru aynı anda inkübasyon için seçilir, ardından floresan etiketli ikincil antikorlar gelir. Antijen alımı, her antijen-antikor reaksiyonu turundan sonra gerçekleştirilir. Otofloresan bloke edilir ve çekirdekleri boyamak için 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kullanılır. Panel, CD3, CD8, CD20 ve CK'nin sıralı tespitini içerir, hücreler belirteçlere göre kategorize edilir: tümör hücreleri (CK +), olgun T hücreleri (CD3 +), sitotoksik T hücreleri (CD3 + CD8 +), B hücreleri (CD20 +) 10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15 mol/L KmnO4</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co. Ltd.</td>
			<td>MST-8005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x sodium citrate&#160;</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>MVS-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>SP KIT-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Pannoramic MIDI</td>
			<td>3D histech Ltd</td>
			<td>Pannoramic MIDI 1.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond primary antibody diluent</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>kit-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;kit-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>RMA-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co. Ltd.</td>
			<td>MAB-0671,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>sig-ma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore Multicut</td>
			<td>lecia</td>
			<td>2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS(powder)</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>PBS-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide viwer&#160;</td>
			<td>3D histech Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry

Tümör mikroçevresi, konakçı hücreler, tümör hücreleri, bağışıklık hücreleri, stromal hücreler ve vaskülatür arasındaki etkileşimleri içerir. İmmün hücre alt kümelerinin ve hedef proteinlerin karakterize edilmesi ve uzamsal olarak düzenlenmesi prognostik ve terapötik amaçlar için çok önemlidir. Bu durum çoğullanmış immünohistokimya boyama yöntemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Multipleks floresan immünohistokimyası, hücre fonksiyonunun ve hücreler arası etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırarak çoklu belirteçlerin aynı anda saptanmasına izin verir. Bu yazıda, multipleks siklik floresan immünohistokimya testi için bir iş akışı ve lenfosit alt kümelerinin kantitifikasyon analizinde uygulanması açıklanmaktadır. Multipleks siklik floresan immünohistokimya boyama, antijen alımı, siklik antikor inkübasyonu ve formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) bir doku lamı üzerinde boyamayı içeren standart immünohistokimya ile benzer adımları ve reaktifleri takip eder. Antijen-antikor reaksiyonu sırasında, farklı türlerden bir antikor karışımı hazırlanır. Antijen alma süresi ve antikor konsantrasyonu gibi koşullar, sinyal-gürültü oranını artırmak için optimize edilir ve doğrulanır. Bu teknik tekrarlanabilir ve immünoterapi araştırmaları ve klinik uygulamalar için değerli bir araç olarak hizmet eder.

Brain metastases (BM) represent the most common central nervous system (CNS) tumors, occurring in nearly half of non-small cell lung cancer cases (NSCLC), with a poor prognosis1. An estimated 10%-20% of NSCLC patients already have BM at the time of initial diagnosis, and approximately 40% of NSCLC cases will develop BM during the course of treatment2. The tumor microenvironment (TME) is closely associated with NSCLC occurrence and BM, including various components, such as blood vessels, fibroblasts, macrophages, extracellular matrix (ECM), lymphoid, bone marrow-derived immune cells, and signaling molecules3,4. Microenvironmental immune cells play a crucial role in influencing cancer cell growth and development. Brain metastases present numerous potential treatment targets characterized by complex immunological microenvironments and signaling processes. For instance, PD-1 inhibitors have shown clinical efficacy for patients with lung cancer brain metastasis (LCBM) as an immune-checkpoint inhibitor (ICI). However, the frequency of responses to PD-1 therapy varies between primary NSCLC and LCBM5, suggesting that the tumor immune microenvironment acts as a critical ICI regulator.
Immunohistochemistry (IHC) is an invaluable tool in the fields of biology, foundation medicine, and pathology6. This detection method visualizes antigen expression through the interaction of antigen-antibody on a tissue slide7. IHC is used for diagnosing predictive markers, evaluating prognostic markers, guiding targeted therapies, and exploring the biological functions of tumor cells8. However, the traditional IHC method can only detect one biomarker at a time. To address this limitation, the innovation of immunohistochemical technology has led to the development of multiplex fluorescence immunohistochemistry (mfIHC), which allows for the simultaneous identification of multiple protein markers on the same tissue slide, both in bright field and fluorescent field9. This advancement provides accurate analysis of cell composition and molecular interactions among stromal cells, immune cells, and cancer cells within the TME.
In this study, we present a protocol for multiplex cyclic immunohistochemistry to analyze the spatial distribution of immune cells. Two primary antibodies of different species, such as rabbit and rat, are chosen for incubation simultaneously, followed by fluorescence-labeled secondary antibodies. Antigen retrieval is performed after each round of antigen-antibody reaction. Autofluorescence is blocked, and 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) is used for staining the nuclei. The panel includes sequential detection of CD3, CD8, CD20, and CK, cells are categorized according to the markers: tumor cells (CK+), mature T cells (CD3+), cytotoxic T cells (CD3+CD8+), B cells (CD20+)10,11.

Yazar Spotlight: Floresan İmmünohistokimya Kullanarak Kanser Dokularında İmmün Hücre İnfiltrasyonunun Etkili Tespiti

Multipleks Siklik Floresan İmmünohistokimya

Tek bir slayt üzerinde 5 renkli multipleks floresan kullanarak döngüsel antijen tespiti için bir protokol sunuyoruz. Tahlili optimize ederek, farklı türlerden iki antikorun inkübasyonunu sağlıyoruz (Şekil 1). Deney prosedürü için gerekli cihazlar arasında bir düdüklü tencere ve immün boyama kutusu bulunur (Şekil 2A).
Testi tamamladıktan sonra, slaytları taramadan önce dört işaretleyicinin sahte rengini tanımla...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient Detection of Immune Cell-Infiltration in Cancer Tissues Using Fluorescent Immunohistochemistry at JoVE.com

Multipleks siklik immünohistokimya, tekrarlanan antijen-antikor inkübasyonu, görüntü taraması ve görüntü hizalama ve entegrasyonu kullanılarak aynı anda birden fazla belirtecin in situ tespitine izin verir. Burada, akciğer kanseri ve eşleştirilmiş beyin metastazı örneklerinde bu teknoloji ile immün hücre substratlarının tanımlanması için çalışma protokolünü sunuyoruz.

The tumor microenvironment involves interactions between host cells, tumor cells, immune cells, stromal cells, and vasculature. Characterizing and ...

İmmünohistokimya için zorluk, çapraz reaktiviteyi önlemek ve daha iyi özgüllük ve tekrarlanabilirlik elde etmek için birincil ve ikincil monoklonal antikor türlerini seçmektir. Antikor seyreltme oranını optimize etmek için cinsiyet kararı gereklidir. Bu arada, bir başka zorluk da yerelleştirmeyi ve alt yapıları hizalamaktır.Bu protokolün kullanımı, hücre sayımlarına ve koruyucu dokulardaki protein ekspresyonuna bağlı olarak BT üç, pozitif BT üç ve BT sekiz pozitif ve BT 20 pozitif gibi üç lenfositik alt popülasyonun dağılımının teknik gelişimini karşılar, infiltrasyon seviyesi de gözlemlenebilir. Protokolümüzde, Antikorlar parametresi ve Fluor sekonder antikorları, iso karışımındaki farklı türlerden türetilir ve bu da bizi verimli kılar. Bu ölçü aynı zamanda antikor ve antijen arasında spesifik bir ölçüyü de gösterir.

multiplex-cyclic-fluorescent-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry

502 Görüntüleme.  The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital. İmmünohistokimya için zorluk, çapraz reaktiviteyi önlemek ve daha iyi özgüllük ve tekrarlanabilirlik elde etmek için birincil ve ikincil monoklonal antikor türlerini seçmektir. Antikor seyreltme oranını optimize etmek için cinsiyet kararı gereklidir. Bu arada, bir başka zorluk da yerelleştirmeyi ve alt yapıları hizalamaktır.Bu protokolün kullanımı, hücre sayımlarına ve koruyucu dokulardaki protein ekspresyonuna bağlı olarak BT üç, pozitif BT üç ve BT sek...

Video: Yazar Spotlight: Floresan İmmünohistokimya Kullanarak Kanser Dokularında İmmün Hücre İnfiltrasyonunun Etkili Tespiti

The tumor microenvironment involves interactions between host cells, tumor cells, immune cells, stromal cells, and vasculature. Characterizing and spatially organizing immune cell subsets and target proteins are crucial for prognostic and therapeutic purposes. This has led to the development of multiplexed immunohistochemistry staining methods. Multiplex fluorescence immunohistochemistry allows the simultaneous detection of multiple markers, facilitating a comprehensive understanding of cell function and intercellular interactions. In this paper, we describe a workflow for the multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry assay and its application in the quantification analysis of lymphocyte subsets. The multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry staining follows similar steps and reagents as standard immunohistochemistry, involving antigen retrieval, cyclic antibody incubation, and staining on a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue slide. During the antigen-antibody reaction, a mixture of antibodies from different species is prepared. Conditions, such as antigen retrieval time and antibody concentration, are optimized and validated to increase the signal-to-noise ratio. This technique is reproducible and serves as a valuable tool for immunotherapy research and clinical applications.

Multiplex cyclic immunohistochemistry allows in situ detection of multiple markers simultaneously using repeated antigen-antibody incubation, image scanning, and image alignment and integration. Here, we present the operating protocol for identifying immune cell substrates with this technology in lung cancer and paired brain metastasis samples.