이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NO.81860413, 81960455), 윈난 과학 기술부 기금 (202001AY070001-080), 윈난성 교육부 과학 연구 재단 (2019J1274)의 지원을 받았습니다.

이 연구는 쿤밍 의과대학 윈난암병원/제3부속병원 의료윤리위원회의 승인을 받았다. 모든 피험자/법적 보호자는 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다.
1. 슬라이드 준비
<ol><li>원발성 폐종양 또는 폐암 뇌전이가 포함된 쌍의 파라핀 블록 절편을 마이크로톰을 사용하여 4μm 두께로 세포를 절단합니다. 물을 묻힌 부분을 제거하고 핀셋으로 분리한 후 가장 좋은 부분을 선택하여 폴리리신 코팅 슬라이드에 부착합니다.</li>
	<li>조직 밀착력을 높이기 위해 65°C의 오븐에 조직 슬라이드를 30분 동안 넣습니다.</li>
	<li>슬라이드를 크실렌에 담그고 각각 10분 동안 지속되는 세 번의 변화를 거칩니다.</li>
	<li>점차적으로 알코올 농도를 낮추고 슬라이드를 100% 에탄올에서 5분, 90% 에탄올에서 5분, 75% 에탄올에서 5분, 탈이온수에서 3분 동안 배양합니다.</li>
</ol>2. 열 유도 에피토프 회수(HIER)
<ol><li>100x 구연산나트륨 완충 용액(pH 6.0)을 탈이온수에 1x(10mM)로 희석하여 슬라이드가 완전히 잠길 수 있을 만큼 충분한 완충 용액을 준비합니다.</li>
	<li>슬라이드를 압력솥에 넣고 100분 동안 고열(30°C)과 압력(~2psi)에 노출시킵니다. 가열 후 슬라이드를 증류수에서 3분 동안 실온으로 식힙니다.</li>
	<li>PBS 완충 용액(pH 7.0)을 제조하기 위해 5L의 탈이온수에 인산염 완충 식염수(PBS, 분말) 52g 한 패킷을 녹입니다. 슬라이드를 PBS 버퍼 용액에 5분 동안 넣고 3번 변경합니다.</li>
</ol>3. 과산화효소 차단
<ol><li>절편을 3% 과산화수소로 덮고 실온에서 10분 동안 배양합니다. PBS에서 슬라이드를 각각 3분 동안 5번 헹굽니다.</li>
	<li>여과지를 사용하여 조직 주변에서 과도한 물을 흡수합니다. 한편, 티슈가 촉촉한지 확인하십시오.</li>
</ol>4. 1차 항체 배양
<ol><li>CD8 (토끼 단클론 항체, 클론 SP16) 및 CD20 (마우스 단클론 항체, 클론 L26)에 대한 1 차 항체의 작동 혼합물을 Bond 1 차 항체 희석제에서 1:50으로 희석하여 준비합니다.</li>
	<li>항체 복합체를 절편에 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS 완충 용액 1L에 Tween 1mL를 함유한 0.1% 트윈/인산염 완충 식염수 용액을 준비합니다.</li>
	<li>0.1% 트윈/인산염 완충 식염수로 절편을 각각 5분 동안 3번 세척합니다. 여과지를 사용하여 조직 주변에서 과도한 물을 빼내고 조직이 촉촉한지 확인하십시오.</li>
</ol>5. 1차 항체 배양
<ol><li>형광 표지된 염소 항-토끼 항체(Excitation (Ex): 495 nm) 및 염소 항-마우스 항체(Ex: 578 nm)의 혼합물을 인산염 완충 식염수에 1:50으로 희석하여 제조한다. 염소 항 토끼 항체는 CD8의 1차 항체에 부착되고, 염소 항 마우스 항체는 CD20의 1차 항체에 부착됩니다.</li>
	<li>2차 항체 혼합물을 적가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
</ol>6. 열 유도 에피토프 회수 및 과산화효소 차단
<ol><li>100x 구연산나트륨(pH 6.0)을 탈이온수에 1x(10mM)로 희석하여 슬라이드가 완전히 잠길 수 있는 충분한 완충 용액을 준비합니다.</li>
	<li>슬라이드를 압력솥에 넣고 1분 동안 고열(100°C)과 압력(~30psi)에 노출시킵니다. 가열 후 슬라이드를 증류수에 넣어 실온으로 3분 동안 식힙니다.</li>
	<li>3단계에서 설명한 대로 과산화효소 차단을 수행합니다.</li>
</ol>7. 2차 항체 배양
<ol><li>CD3 (토끼 단클론 항체, 클론 SP7) 및 CK (마우스 단클론 항체, MX005)에 대한 1 차 항체의 작동 혼합물을 1 차 항체 희석액에 1:50으로 희석하여 준비합니다.</li>
	<li>항체 복합체를 절편에 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>0.1% 트윈/인산염 완충 식염수로 각각 5분씩 3번 세척합니다. 여과지를 사용하여 조직 주변에서 과도한 물을 빼내고 조직이 촉촉한지 확인하십시오.</li>
</ol>8. 2차 항체 배양
<ol><li>염소 항-토끼(Ex: 652 nm)와 염소 항-마우스 항체(Ex: 590 nm)를 혼합하여 인산염 완충 식염수로 1:50 희석하여 제조한다. 염소 항 토끼 항체는 CD3의 1차 항체에 부착되고, 염소 항 마우스 항체는 CK의 1차 항체에 부착됩니다.</li>
	<li>2차 항체 혼합물을 적가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 0.1% 트윈/인산염 완충 식염수로 각각 5분씩 3번 세척합니다.</li>
</ol>9. 자가형광 담금질 및 DAPI 염색
<ol><li>시약(0.15 M/L KMnO4)을 조직 섹션에 1분 동안 추가합니다. 흐르는 물로 5분 동안 헹굽니다. 주의 : KMnO4 는 독성이 있으며 피부를 손상시킵니다. 슬라이드를 다룰 때는 반드시 장갑을 착용하십시오. 액체가 피부에 떨어지면 깨끗한 냅킨으로 빠르게 닦아내고 흐르는 물로 씻어내십시오.</li>
	<li>알코올 농도를 높인 상태(70%, 90%, 100%)로 슬라이드를 각 농도에서 3분 동안 건조시킵니다.</li>
	<li>다중 스펙트럼 이미징을 위해 DAPI 및 커버슬립을 추가합니다. DAPI의 양은 조직 크기에 따라 다릅니다. 커버슬립을 추가한 후 조직이 DAPI로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.</li>
</ol>10. 슬라이드 스캔
<ol><li>슬라이드를 트레이에 놓고 더 이상 밀 수 없을 때까지 밉니다.</li>
	<li>프로그램을 시작하려면 바탕 화면에서 프로그램 아이콘을 두 번 클릭합니다. 시작하는 동안 모드 선택 창이 표시됩니다. 선택 창에는 두 가지 명시야 및 형광 모드(자동 모드와 수동 모드)가 표시됩니다. 형광 스캔 모드에서 자동 모드(Automatic Mode)를 클릭합니다.</li>
	<li>마우스 커서를 ? 버튼을 눌러 설정에 대한 정보를 표시합니다. 필터 설정(Filter Setting) > 필터 채널(Filter Channel )을 클릭하여 채널 번호(Channel Number) > 의사 색상(Pseudo Color)을 선택합니다. 색상을 정의하고 저장합니다.</li>
	<li>Routine Work(일상 작업) > Scanning Mode(스캔 모드)> 완전 자동(Full Automatic)을 클릭합니다. 루틴 작업(Routine Work) > 슬라이드 이름(Slide Name)을 클릭하여 출력할 슬라이드 이름을 정의합니다. [루틴 작업] > [채널 설정]을 클릭하여 필터를 선택합니다.</li>
	<li>Routine Work > Scan Options(일상적인 작업) Scan Options(스캔 옵션)를 클릭하여 가상 슬라이드의 결과 품질과 저장 위치를 결정합니다.</li>
	<li>임계값 설정 및 스캔할 범위 선택을 위해 미리 보기(Preview )를 클릭합니다.</li>
	<li>하드웨어 > 필터(Hardware Filters) > 라이브 > 자동 초점(Auto Focus) > 자동 노출(Auto Exposure) > 디지털 게인(Digital Gain) > 틱(Tick)을 클릭하고 수동 노출 시간 사용(Use manual exposure time) > 틱(Tick)을 클릭하여 현재 설정(Set Current)> 범위를 제한합니다.</li>
	<li>일상적인 작업(Routine Work)> 스캔 시작(Start Scan)을 클릭합니다. 배율 수준을 20x 또는 40x로 선택합니다. 적절한 파일 크기로 20x를 선택합니다. MRXS 확장은 3D Pannoramic MIDI 스캐너에 의해 정의됩니다. 이미지 확장자를 TIFF 이미지로 변경할 수도 있습니다.</li>
	<li>슬라이드 뷰어 > Multiview Toolbox를 클릭하여 공초점에 사용할 이미지를 선택한 다음 이미지를 정렬하고 통합합니다.</li>
</ol>11. 세포 밀도의 정량적 평가
<ol><li>Halo 10 스캐너 소프트웨어를 사용하여 종양 및 기질 영역에서 양성 면역 세포(CD3+, CD3+CD8+, CD20+)의 백분율을 정량화합니다. 종양 조직을 정의하기 위해 CK 염색을 검증합니다.</li>
</ol>

암 조직에서 면역 세포 마커의 현장 면역조직화학적 검출

<ol>
	<li>Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastases+to+the+central+nervous+system:+Molecular+basis+and+clinical+considerations.">Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations.</a> J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).</li><li>Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+imaging+in+early+stage+non-small+cell+lung+cancer:+still+a+controversial+topic.">Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic.</a> J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).</li><li>Vilari&#241;o, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+in+NSCLC+patients+with+brain+metastases.+Understanding+brain+tumor+microenvironment+and+dissecting+outcomes+from+immune+checkpoint+blockade+in+the+clinic.">Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic.</a> Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).</li><li>Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tumor+microenvironment:+Potential+strategy+for+cancer+therapeutics.">Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).</li><li>Goldberg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+for+management+of+patients+with+NSCLC+and+brain+metastases:+long-term+results+and+biomarker+analysis+from+a+non-randomised,+open-label,+phase+2+trial.">Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial.</a> Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).</li><li>Sukswai, N., Khoury, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+Innovations+for+Diagnosis+and+Tissue-Based+Biomarker+Detection.">Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection.</a> Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+Investigative+and+Toxicologic+Pathology.">Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology.</a> Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+controls+under+control:+the+time+is+now+for+immunohistochemistry.">Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry.</a> J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).</li><li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Wong, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantitative+analysis+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+immunotherapy+outcome+in+metastatic+melanoma.">Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma.</a> Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).</li><li>Sanchez, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunofluorescence+to+measure+dynamic+changes+in+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+PD-L1+in+early-stage+breast+cancer.">Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer.</a> Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunohistochemistry+indicates+biomarkers+in+colorectal+cancer.">Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer.</a> Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).</li><li>Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+immunohistochemistry+protocol+for+detecting+the+guidance+cue+Netrin-1+in+neural+tissue.">An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue.</a> MethodsX. 5, 1-7 (2018).</li><li>McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+immunohistochemical+identification+and+localization+of+Osterix+in+periosteum-wrapped+constructs+for+tissue+engineering+of+bone.">A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone.</a> J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+black+B+reduces+autofluorescence+in+murine+renal+tissue.">Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue.</a> Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Society+for+Immunotherapy+of+Cancer+statement+on+best+practices+for+multiplex+immunohistochemistry+(IHC)+and+immunofluorescence+(IF)+staining+and+validation.">The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation.</a> J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).</li><li>Clarke, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+automated+technology+for+multiplex+biomarker+imaging+and+application+to+breast+cancer.">A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer.</a> Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Ahrens, M. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+pretreatment+of+growth+plate+cartilage+increases+immunofluorescence+sensitivity.">Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity.</a> J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+characteristics+of+autofluorescence+in+renal+tissue+and+methods+for+reducing+fluorescence+background+in+confocal+laser+scanning+microscopy.">Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy.</a> J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).</li></ol>

저자들은 이 논문에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계를 알지 못한다고 선언합니다.

우리는 다중 순환 형광 면역조직화학 염색 과정을 설명했습니다. 1차 항체 선택은 형광 면역조직화학 분석의 중요한 측면이며, 더 나은 특이성과 반복성을 위해 단클론 항체를 권장합니다. 1차 항체의 작동 농도를 최적화하기 위해 면역조직화학 실험을 통해 일련의 희석액을 테스트했습니다. 양성 대조군(표적 항원 발현 평가)과 음성 대조군(1차 항체 배양 없음)은 모두 필수적이며 설정해야 합니?...

뇌 전이(BM)는 가장 흔한 중추신경계(CNS) 종양으로, 비소세포폐암(NSCLC) 사례의 거의 절반에서 발생하며 예후가 좋지 않다1. 비소세포폐암 환자의 약 10%-20%가 초기 진단 시점에 이미 BM을 가지고 있으며, 약 40%의 비소세포폐암 환자가 치료 과정에서 BM으로 발전한다2. 종양 미세환경(tumor microenvironment, TME)은 혈관, 섬유아세포, 대식세포, 세포외기질(ECM), 림프구, 골수 유래 면역세포, 신호전달 분자 3,4와 같은 다양한 구성 요소를 포함하여 비소세포폐암(NSCLC) 발생 및 BM과 밀접한 관련이 있습니다. 미세환경 면역세포는 암세포의 성장과 발달에 영향을 미치는 데 중요한 역할을 합니다. 뇌 전이는 복잡한 면역학적 미세환경과 신호전달 과정을 특징으로 하는 수많은 잠재적 치료 표적을 제시합니다. 예를 들어, PD-1 억제제는 면역관문억제제(ICI)로서 폐암 뇌전이(LCBM) 환자에게 임상적 효능을 보였다. 그러나 PD-1 요법에 대한 반응 빈도는 원발성 NSCLC와 LCBM5 간에 다르며, 이는 종양 면역 미세환경이 중요한 ICI 조절자로 작용한다는 것을 시사한다.
면역조직화학(IHC)은 생물학, 기초 의학 및 병리학 분야에서 매우 유용한 도구입니다6. 이 검출 방법은 조직 슬라이드(7) 상의 항원-항체의 상호작용을 통해 항원 발현을 시각화한다. IHC는 예측 마커를 진단하고, 예후 마커를 평가하고, 표적 치료를 안내하고, 종양 세포의 생물학적 기능을 탐색하는 데 사용됩니다8. 그러나 기존의 IHC 방법은 한 번에 하나의 바이오마커만 검출할 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 면역조직화학 기술의 혁신은 다중 형광 면역조직화학(mfIHC)의 개발로 이어졌으며, 이를 통해 명시야 및 형광 필드 모두에서 동일한 조직 슬라이드에서 여러 단백질 마커를 동시에 식별할 수 있습니다9. 이러한 발전은 TME 내에서 기질 세포, 면역 세포 및 암세포 간의 세포 구성 및 분자 상호 작용에 대한 정확한 분석을 제공합니다.
본 연구에서는 면역세포의 공간적 분포를 분석하기 위한 multiplex cyclic immunohistochemistry 프로토콜을 제시합니다. 토끼와 쥐와 같은 서로 다른 종의 두 가지 1차 항체를 동시에 선택하여 배양한 후 형광 표지 2차 항체를 선택합니다. 항원 회수는 항원-항체 반응의 각 라운드 후에 수행됩니다. 자가형광은 차단되고 4', 6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)은 핵 염색에 사용됩니다. 이 패널에는 CD3, CD8, CD20 및 CK의 순차 검출이 포함되어 있으며, 세포는 마커에 따라 종양 세포(CK+), 성숙 T 세포(CD3+), 세포 독성 T 세포(CD3+CD8+), B 세포(CD20+)로 분류됩니다10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15 mol/L KmnO4</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co. Ltd.</td>
			<td>MST-8005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x sodium citrate&#160;</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>MVS-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>SP KIT-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Pannoramic MIDI</td>
			<td>3D histech Ltd</td>
			<td>Pannoramic MIDI 1.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond primary antibody diluent</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>kit-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;kit-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>RMA-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co. Ltd.</td>
			<td>MAB-0671,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>sig-ma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore Multicut</td>
			<td>lecia</td>
			<td>2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS(powder)</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>PBS-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide viwer&#160;</td>
			<td>3D histech Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry

종양 미세환경은 숙주 세포, 종양 세포, 면역 세포, 기질 세포 및 혈관 조직 간의 상호 작용을 포함합니다. 면역 세포 subset과 표적 단백질을 특성화하고 공간적으로 구성하는 것은 예후 및 치료 목적에 매우 중요합니다. 이는 다중 면역조직화학 염색법의 개발로 이어졌습니다. 다중 형광 면역조직화학을 통해 여러 마커를 동시에 검출할 수 있어 세포 기능 및 세포 간 상호 작용에 대한 포괄적인 이해를 촉진할 수 있습니다. 이 논문에서는 다중 순환 형광 면역조직화학 분석을 위한 워크플로우와 림프구 하위 집합의 정량 분석에서의 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 다중 순환 형광 면역조직화학 염색은 항원 회수, 순환 항체 배양 및 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 슬라이드 염색을 포함하는 표준 면역조직화학과 유사한 단계 및 시약을 따릅니다. 항원-항체 반응 중에 서로 다른 종의 항체 혼합물이 준비됩니다. 항원 회수 시간 및 항체 농도와 같은 조건은 신호 대 잡음비를 높이기 위해 최적화되고 검증됩니다. 이 기술은 재현성이 있으며 면역 요법 연구 및 임상 응용 분야에 유용한 도구 역할을 합니다.

Brain metastases (BM) represent the most common central nervous system (CNS) tumors, occurring in nearly half of non-small cell lung cancer cases (NSCLC), with a poor prognosis1. An estimated 10%-20% of NSCLC patients already have BM at the time of initial diagnosis, and approximately 40% of NSCLC cases will develop BM during the course of treatment2. The tumor microenvironment (TME) is closely associated with NSCLC occurrence and BM, including various components, such as blood vessels, fibroblasts, macrophages, extracellular matrix (ECM), lymphoid, bone marrow-derived immune cells, and signaling molecules3,4. Microenvironmental immune cells play a crucial role in influencing cancer cell growth and development. Brain metastases present numerous potential treatment targets characterized by complex immunological microenvironments and signaling processes. For instance, PD-1 inhibitors have shown clinical efficacy for patients with lung cancer brain metastasis (LCBM) as an immune-checkpoint inhibitor (ICI). However, the frequency of responses to PD-1 therapy varies between primary NSCLC and LCBM5, suggesting that the tumor immune microenvironment acts as a critical ICI regulator.
Immunohistochemistry (IHC) is an invaluable tool in the fields of biology, foundation medicine, and pathology6. This detection method visualizes antigen expression through the interaction of antigen-antibody on a tissue slide7. IHC is used for diagnosing predictive markers, evaluating prognostic markers, guiding targeted therapies, and exploring the biological functions of tumor cells8. However, the traditional IHC method can only detect one biomarker at a time. To address this limitation, the innovation of immunohistochemical technology has led to the development of multiplex fluorescence immunohistochemistry (mfIHC), which allows for the simultaneous identification of multiple protein markers on the same tissue slide, both in bright field and fluorescent field9. This advancement provides accurate analysis of cell composition and molecular interactions among stromal cells, immune cells, and cancer cells within the TME.
In this study, we present a protocol for multiplex cyclic immunohistochemistry to analyze the spatial distribution of immune cells. Two primary antibodies of different species, such as rabbit and rat, are chosen for incubation simultaneously, followed by fluorescence-labeled secondary antibodies. Antigen retrieval is performed after each round of antigen-antibody reaction. Autofluorescence is blocked, and 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) is used for staining the nuclei. The panel includes sequential detection of CD3, CD8, CD20, and CK, cells are categorized according to the markers: tumor cells (CK+), mature T cells (CD3+), cytotoxic T cells (CD3+CD8+), B cells (CD20+)10,11.

저자 스포트라이트: Efficient Detection of Immune Cell-Infiltration in Cancer Tissues Using Fluorescent Immunohistochemistry (형광 면역조직화학을 사용한 암 조직의 면역 세포 침투의 효율적인 검출)

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry(다중 순환 형광 면역조직화학)

The challenge for immunohistochemistry is to choose the species of primary and secondary monoclonal antibodies to avoid cross-reactivity and obtain better specificity and repeatability. Gender decision is necessary to optimize the antibody dilution ratio. Meanwhile, another challenge is to align the localization of and the sub structures.The use of this protocol meet the technical evolution of the distribution of three lymphocytic subpopulations, such as CT three, positive CT three, and CT eight positive and CT 20 positive based on in cell counts and the protein expression in conserv tissues, the level of infiltration can be observed too. In our protocol, the parameter Antibodies and the Fluor secondary antibodies derive from different species at the iso mixture making us a efficient. This measure also shows a specific measure between antibody and antigen.

단일 슬라이드에서 5색 다중 형광을 사용한 순환 항원 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다. 분석의 최적화를 통해 서로 다른 종의 두 항체를 배양할 수 있습니다(그림 1). 실험 절차에 필요한 장치에는 압력솥과 면역염색 상자가 포함됩니다(그림 2A).
분석을 완료한 후 슬라이드를 스캔하기 전에 4개의 마커의 유사 색상을 정의합니?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient Detection of Immune Cell-Infiltration in Cancer Tissues Using Fluorescent Immunohistochemistry at JoVE.com

다중 순환 면역조직화학은 반복적인 항원-항체 배양, 이미지 스캐닝, 이미지 정렬 및 통합을 사용하여 여러 마커를 동시에 현장에서 검출할 수 있습니다. 여기에서는 폐암과 쌍을 이루는 뇌 전이 샘플에서 이 기술로 면역 세포 기질을 식별하기 위한 운영 프로토콜을 제시합니다.

The tumor microenvironment involves interactions between host cells, tumor cells, immune cells, stromal cells, and vasculature. Characterizing and ...

면역조직화학의 과제는 교차 반응을 피하고 더 나은 특이성과 반복성을 얻기 위해 1차 및 2차 단클론 항체 종을 선택하는 것입니다. 항체 희석 비율을 최적화하기 위해 성별 결정이 필요합니다. 한편, 또 다른 과제는 하위 구조의 현지화를 조정하는 것입니다.이 프로토콜의 사용은 세포 수 및 보존 조직의 단백질 발현을 기반으로 CT 3, 양성 CT 3 및 CT 8 양성 및 CT 20 양성과 같은 3 개의 림프구 하위 집단 분포의 기술적 진화를 충족하며 침투 수준도 관찰 할 수 있습니다. 프로토콜에서 매개변수 항체와 Fluor 2차 항체는 iso 혼합물에서 서로 다른 종에서 파생되어 효율적입니다. 이 측정은 또한 항체와 항원 사이의 특정 측정을 보여줍니다.

multiplex-cyclic-fluorescent-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry

456 조회수.  The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital. 면역조직화학의 과제는 교차 반응을 피하고 더 나은 특이성과 반복성을 얻기 위해 1차 및 2차 단클론 항체 종을 선택하는 것입니다. 항체 희석 비율을 최적화하기 위해 성별 결정이 필요합니다. 한편, 또 다른 과제는 하위 구조의 현지화를 조정하는 것입니다.이 프로토콜의 사용은 세포 수 및 보존 조직의 단백질 발현을 기반으로 CT 3, 양성 CT 3 및 CT 8 양성 및 CT 20 양성과 ...

비디오: 저자 스포트라이트: Efficient Detection of Immune Cell-Infiltration in Cancer Tissues Using Fluorescent Immunohistochemistry (형광 면역조직화학을 사용한 암 조직의 면역 세포 침투의 효율적인 검출)