בדיקה סלולרית מבוססת כתב לניטור יעילות חיבור

פרוטוקול זה מתאר בדיקה סלולרית לניטור יעילות חיבור, באמצעות כתב ניהול הסתגלות. מאמר זה Assay יכול לשמש כדי ללמוד את ההשפעות של מוטציות הקשורות למחלה באתרי אקסון או חיבור, וכדי לעצב טיפול, חלקיק אחד במיוחד, כדי לשפר את ההכרה של מוטציה לאתרי חיבור חמש נקודות. המעבר בתאי הלה שואפים את המדיום המבוזבז ודגור את התאים עם שלושה מיליליטרים של 0.2 5% נסיעות המכילות EDTA מילימולרי אחד, ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.

לאחר הדגירה בשבעה מיליליטר של DMEM טרי ולהעביר את ההשעיה התא לצינור 10 מיליליטר. צנטריפוגה התאים. לאחר מכן resuspend גלולה התא ב 10 מיליליטר של DMEM טרי, צלחת התאים על צלחת תרבית רקמות חדשה ב 20% מפגש, עבור transsfection של חולף.

לספור את תאי hela עם שקופית ציטומטר hemo נקי ולהכין השעיה עם צפיפות של 2.5 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר, זרע מיליליטר אחד של השעיית התא לתוך כל באר של צלחת 12 היטב ודגור לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת לשאוף את המדיום בילה ולהוסיף 800 microliters של DMEM טרי עם סרום לצלחת. הכינו את תערובות הטרנספקטיון ומערבולת אותם במשך 15 שניות.

לאחר מכן צנטריפוגות התערובות ודגור אותם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר הדגירה להוסיף את כל 200 microliters של תערובת transfection לתוך באר אחת של 12 צלחת תא הלה היטב כדי להשיג נפח סופי של מיליליטר אחד לכל באר, ודגור הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. תגובות התיוג המוכנות מדגרות.

הקדישו מחדש את חרוזי ההרחקה המולקולריים במשקל 25 קילו של דלטון על ידי מערבולת עדינה למשך 10 שניות. הבא להעביר 600 microliters של חרוזים resuspended לעמודה מיני חד פעמית, להציב בצינור איסוף 1.5 מיליליטר, ולהחזיר את מלאי החרוזים לארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה העמודה ולהשליך את הזרימה דרכם.

לאחר מכן לשטוף את החרוזים פעמיים על ידי הוספת 300 מיקרוליטרים של מים חינם RNA לעמודה. לאחר השטיפה השנייה, העבירו את העמוד המצומצם לצינור צנטריפוגות חדש של 1.5 מיליליטר, והוסיפו את תערובת התגובה של קינאז לעמודה. צנטריפוגה העמודה ולאסוף את הזרימה דרך המכיל P32 שכותרתו oligonucleotides.

הוסיפו שני מיקרוגרמים של RNA המופקים מתאי המסוק ל-200 צינורות מיקרו-צנטריפוגות מיקרו-ליטר והוסיפו מים נטולי RNA כדי לפצות את הנפח ל-6.55 מיקרוליטרים. לאחר מכן להוסיף 0.9 microliters מאסטר לערבב אחד לכל צינור PCR המכיל את דגימות RNA, ולדגור את הצינורות תחילה ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן על קרח במשך דקה אחת. הבא ב 2.55 microliters, תערובת מאסטר שתיים, לכל צינור המכיל RNA ומאסטר לערבב אחד, ולדגור את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.

לאחר הדגירה להעביר את הצינורות למחזור תרמי ודגור תחילה ב 50 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, ולאחר מכן ב 70 מעלות צלזיוס, במשך 15 דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של צבע טעינת RNA פורממיד פי 2 לכל דגימה, והמשיכו להפריד את הקטעים לפי דף UIA. סינתזת דנ"א של פרסי.

הוסיפו שני מיקרוגרמים של RNA המופקים מתאי ההלה שעברו טרנסצנטריפוגה, ל-200 צינורות מיקרו-צנטריפוגות מיקרו-ליטר והוסיפו מים חופשיים של RNAs כדי לפצות את הנפח ל-11 מיקרוליטרים נמוכים. לאחר מכן, מוסיפים שני מיקרוליטרים, מאסטר לערבב אחד לכל מדגם ודגור תחילה ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן על קרח במשך דקה אחת. לאחר מכן, להוסיף שבעה microliters, מאסטר לערבב שניים לכל צינור ולדגור את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ואחריו דגירה ב 50 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ו 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.

לאחר מכן, עבור PCR לדלל את תגובת ה- DNA C להניב ריכוז של 100 ננוגרם לכל מיקרוליטר, ולהעביר מיקרוליטר אחד של כל מדגם CDNA לצינורות PCR חדשים. הוסף 10.5 מיקרוליטרים של התערובת הראשית לכל צינור המכיל CDNA, ובצע את ה- PCR. שימוש בתרמוציקלר לאחר השלמת ה- PCR.

הוסף 12.5 מיקרוליטרים של צבע טעינת DNA פורממיד 2X לכל צינור. לחמם את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולהמשיך לבצע דף UIA. פיפטה חמישה מיקרוליטרים של CDNA מדולל לתוך בארות בודדות של צלחת qpcr 96-well משולש.

לאחר מכן להוסיף 10 microliters של תערובת PCR בזמן אמת לכל באר, לאטום את הצלחות עם סרט אופטי, צנטריפוגה כדי לאסוף את התגובות לתחתית הבארות, ולאחר מכן לבצע את qpcr תוך איסוף ערכי מחזור כימות הסף של משרעת היעד. לפני טעינת הסמנים והדגימות, לשטוף את הבארות עם מאגר TBE כדי להסיר את האוריאה מיושבת. לאחר מכן לטעון 10 microliters של כל מדגם לכל באר ולהפעיל את הג'ל ב 300 עד 500 וולט במשך שעתיים עד שלוש שעות, או עד קסילן מגיע לתחתית.

לאחר אלקטרופורזה להסיר את לוחות הזכוכית ממנגנון אלקטרופורזה ולהפריד בזהירות את שתי הצלחות, כך הג'ל שוכב שטוח על כל משטח זכוכית, ולאחר מכן להעביר את הג'ל על נייר סינון לכסות אותו עם ניילון נצמד, באמצעות ואקום מייבש ג'ל לייבש את הג'ל ב 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, לאחר מכן מניחים את הג'ל היבש בקלטת הדמיה זרחנית לדגירה לילית בטמפרטורת החדר. כאשר הוא בא לידי ביטוי בתאי הלה, כתב החיתוך dup 51 minnijean מבטא את התמליל הבוגר באורך מלא שבו אקסון 2 הוא משולב ביעילות. חמש המוטציות העיקריות באתר החיבור ו-dup 51 P מפחיתות את ההכללה השנייה של אקסון מ-95% ל-30% מה שמוביל להיווצרות תעתיק קצר יותר.

ביטוי משותף של dup 51 P עם U15A SNRNA מציל את אקסון שני חיבורים, ומשחזר את היווצרות התמליל באורך מלא. לעומת זאת, ביטוי משותף עם סוג פראי U1 או U15G וריאנט אין השפעה דומה על חיבור dup 51P. זיהוי של תמלילי וריאנט U15A, על ידי הרחבה ראשונית משתמש U1 שבע עד 26 oligo נוקלאוטיד, שהוא 20 נוקלאוטידים ארוכים וזוגות בסיס ליד האדנין במיקום החמישי של U1 SNRNA.

בנוכחות DATP לבד, U1 שבע עד 26 מאפשר שילוב של שניים עד שלושה נוקלאוטידים עבור סוג הבר האנדוגני U1 SNRNA מניב מוצר ארוך 22 או 23 נוקלאוטידים. עבור U15A ו U15G גרסאות הרחבה מסתיימת לאחר הוספת אדנוזין יחיד לייצר מוצר נוקלאוטיד 21. לאחר הנורמליזציה לביטוי U2 SNRNA, גרסאות U1 5g ו- U15A מסוג U1 שהוחלפו באו לידי ביטוי בשלושה עד חמישה קיפולים מעל SNRNA האנדוגני.

איכות הרנ"א שחולצה היא קריטית לניתוח חיבור. לכן, השימוש במים ללא RNA, וטיהור של שירותים עם סוכני השבתה RNAs מומלץ מאוד. מערכת הדיווח המתוארת כאן ניתן ליישם כדי ללמוד את התפקיד של U1 SN RNAs בתקנות חיבור עבור היפוך ההשפעה של מחיר פלאש חיבור מוטציות עבור השתקת גנים באמצעות שינוי U1SN RNAs.