עבודה זו נתמכה כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82172107), הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), קרן המחקר הרפואי של שנזן (SMRF. D2301015), ועדת החדשנות העירונית למדע וטכנולוגיה של שנזן (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) והקרן המיוחדת של מחוז לונגגאנג לפיתוח כלכלי וטכנולוגי (LGKCYLWS2022007).

דגימות נלקחו מהתורמים הבריאים בהסכמה מבית החולים לבריאות יולדות וילדים במחוז שנג'ן לונגגנג, גואנגדונג, סין. השימוש בדגימות אנושיות למחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים שנזן, אוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית (SZLDH2020LSYM-095) וועדת האתיקה הרפואית של בית החולים ליולדות וילדים במחוז שנג'ן לונגגנג (LGFYYXLLS-2020-005). כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות שאושרו. פרטי הריאגנטים והציוד בו נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.
1. איסוף חבל הטבור האנושי
<ol><li>יש להשיג דגימות חבל טבור אנושי מבית החולים השיתופי בתנאים סטריליים. הערה: בחר תורם מתחת לגיל 35, רצוי פרימיפרה, ללא היסטוריה של הפטיטיס, מחלות המועברות במגע מיני או הפרעות גנטיות. תוצאות בדיקת הקבלה עבור וירוס הפטיטיס B, וירוס הפטיטיס C וציטומגלווירוס צריכות להיות שליליות. בחר ניתוח קיסרי כמצב הלידה.</li>
	<li>בחר פיסת UC ישרה ושלמה באורך של כ-10-15 ס"מ.</li>
	<li>סוגרים את שני הקצוות במלקחיים המוסטטיים וסוגרים קשרים כירורגיים בקצה הפנימי בין המלקחיים מיד לאחר לידת יילוד מלא בניתוח קיסרי. (UC נאסף כפי שמוצג באיור 1, שלב 1). הערה: הפעלת הניתוח הקיסרי מבטיחה שהאיסוף יהיה סטרילי. השתמש בקשרים כירורגיים בתפר בגודל 0 או 2-0 לחוזק מתיחה טוב יותר.</li>
	<li>חתכו את חבל הטבור הקשור בין המלקחיים לקשרים באמצעות מספריים כירורגיים (איור 1, שלב 1).</li>
	<li>שטפו אותו בתמיסת מלח כדי להסיר קרישי דם מזהמים על פני השטח והעבירו מיד לצינור פלסטיק סטרילי של 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל של מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS). הערה: לא נעשה שימוש באנטיביוטיקה במהלך ההעברה.</li>
	<li>אטמו את הצינור. הניחו אותו על קרח בקופסת פוליסטירן ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C לפני העברתו למעבדה. הערה: נתח את הכבל תוך 4 שעות מרגע האיסוף.</li>
</ol>2. בידוד הג'לי של וורטון מחבל הטבור
<ol><li>עבד את חבל הטבור לפי השלבים הבאים:<ol><li>הכינו מגש מעוקר עם כלי ניתוח, כלים ארוזים אספטית בקוטר 90 מ"מ, פיפטות 1000 מיקרוליטר, PBS סטרילי, תמיסת אתנול 75% ומדיום תרבית MSC אנושי נטול קסנו. הערה: המלקחיים עם השיניים ומהדקי היתושים מאפשרים לטפל בכבל החלקלק ביעילות.</li>
		<li>יש לטהר את הפריטים הנדרשים ואת אזור העבודה לפני הנחת הפריטים בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. הערה: אפשר לאוויר באזור העבודה להתנקות למשך מספר דקות לפני תחילת העבודה.</li>
		<li>יש לחטא את פני השטח של הצינור ולהסיר את הדגימה לתוך צלחת פטרי בארון הבטיחות הביולוגית. טבלו את הדגימה עם הקשרים באתנול 75% למשך 30 שניות ולאחר מכן שטפו אותה מספר פעמים עם PBS סטרילי בצלחת פטרי חדשה. הערה: יש לקשור את הכבל לפני טבילה באתנול 75%, ויש להגביל את זמן הטבילה ל-30 שניות עד דקה כדי לחטא את הכבל במלואו ללא נזק.</li>
		<li>חותכים את הקשרים וחותכים את החוט בין שני קשרים לרוחב לחתיכות קצרות באורך של כ-2 ס"מ בעזרת מספריים ומלקחיים כירורגיים. הערה: יש להיפטר מקצות הכבל עם קשרים. אורך ה- UC לא צריך להיות ארוך מדי או קצר מדי; שני התנאים עשויים להגביר את הקושי של הניתוח.</li>
		<li>מחוררים את הווריד (כלי גדול יותר) עם PBS באמצעות פיפטות 1000 μL עד שהנוזל היוצא מהקצה השני של החוט הופך לשקוף לחלוטין19.</li>
	</ol></li>
	<li>לנתח את חבל הטבור.<ol><li>מעבירים את אחת החתיכות שכבר נחתכו לצלחת פטרי חדשה. הערה: שני עורקים ווריד אחד צריכים להיות חשופים באופן גלוי בחתך8 (איור 2B).</li>
		<li>הוסף את הכמות המתאימה של PBS כדי לשמור על הכבל רטוב לאורך כל הפעולה.</li>
		<li>אחזו בחוט במלקחיים ומשכו את העורקים לאורך צירו הראשי בעזרת מלחציים ליתושים. הערה: נסה למשוך מהקצה השני של החוט אם העורק נקרע, מכיוון שלדופן העורק יש גמישות רבה.</li>
		<li>קבע את הכבל אופקית כאשר הצד העבה פונה כלפי מעלה על ידי הכנסת להב אחד של המלקחיים לווריד הטבור ולאחר מכן הידוק חזק, תוך הקפדה על הידוק המלקחיים בצד העבה יותר.</li>
		<li>בצעו חתך ליניארי בשכבת אפיתל מי השפיר מקצה אחד לשני לאורך קצה הלהב השני של המלקחיים באמצעות אזמל (איור 3). הערה: שמור על שלמות הג'לי של וורטון על ידי חיתוך WJ קטן ככל האפשר.</li>
		<li>התחילו בפינה אחת של מרווח החיתוך. הרימו את פינת אפיתל מי השפיר עם מלחציים בשיניים והמשיכו לחתוך אופקית עוד קצת עם מספריים בקרנית לאורך המשטח הפנימי של האפיתל.<ol><li>להפריד את הג'לי של וורטון ואת אפיתל מי השפיר עם מלחציים ובהדרגה להרחיב לכל המעגל של קצה אחד של UC. קלפו את שכבת האפיתל לאורכה (איור 3). הערה: הג'לי של וורטון הוא רקמת חיבור רירית המוקפת באפיתל מי השפיר הצפוף8. הפעולה כולה צריכה להיות חלקה, אך ניתן להשתמש במלחציצי יתושים לדיסקציה קהה אם נתקלים בקשיים במהלך הקילוף.</li>
		</ol></li>
		<li>הכניסו את שני הלהבים של המלקחיים לתוך הווריד, הדקו חלק מ-WJ, ואז הפכו אותו מבפנים החוצה כדי לחשוף את האפיתל של וריד הטבור (איור 3).</li>
		<li>קלפו את אפיתל הווריד בקלות, שכן המתח הפנימי יוצר הפרדה בין אפיתל הווריד לבין ה-WJ הפריווסקולרי (איור 3).</li>
	</ol></li>
	<li>נתח את UC באמצעות השיטה המקובלת להשוואה20.<ol><li>בחרו דגימה נוספת שכבר נחתכה במשקל כמעט זהה לזה של החוט הקודם והעבירו אותה לצלחת פטרי חדשה.</li>
		<li>חותכים לאורך וריד הטבור לאורכו עם מספריים ומפיצים את UC כדי לחשוף את כלי הדם ואת WJ.</li>
		<li>הסר את וריד הטבור ושני עורקים, והסר את ה- WJ משכבת האנדותל בעזרת מספריים ואזמל.</li>
	</ol></li>
</ol>3. בידוד ותרבות של UC-MSCs
<ol><li>מניחים את WJ שנאסף בצלחת פטרי 90 מ"מ מסומנת מראש וחותכים אותו לחתיכות 1-3 מ"מ עם מספריים ומלקחיים.</li>
	<li>הפכו את המנה עם המכסה בתחתית והניחו אותה באינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות כדי לחזק את החיבור בין החתיכות למשטח הפלסטיק.</li>
	<li>הופכים את המנה, ומוסיפים בעדינות כמות מתאימה של מדיום תרבית MSC אנושי לתרבית נוספת. הערה: השתמש במהירות הנמוכה ביותר כדי לוודא שהחלקים עדיין מחוברים.</li>
	<li>שנה את מדיום התרבות האנושי של MSC כל 3 ימים. להחליף שני שלישים של המדיום ולראות את המראה של outgrowth של תאים סיביים כל 2 ימים ב 7 הימים הראשונים, לשנות את המדיום המלא, ולצפות בו על בסיס יומי לאחר מכן. הערה: הימנעו מהזזת צלחת הפטרי במשך 7 הימים הראשונים. הצמיחה המובחנת של תאים דמויי פיברובלסטים נצפתה תוך כ -4 ימים.</li>
	<li>תת-תרבות עד שהמפגש מגיע ל-80%. הערה: שלב זה נמשך 7-10 ימים.<ol><li>חממו מראש את PBS, 0.25% טריפסין, ותרבית MSC אנושית נטולת קסנו בינונית ל-37°C באמבט מים.</li>
		<li>יש לשטוף עם PBS לאחר שאיפת הסופרנטנט עם פיפטה, ולנתק את התאים עם 0.25% טריפסין שחומם מראש עד שניתן יהיה לעקור את התאים על ידי הקשה על צלחת הפטרי.</li>
		<li>נטרל את הטריפסין על-ידי ערבוב מדיום תרבית MSC שחומם מראש ביחס של 4:1, אסוף את מתלה התא ואת הצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C. הערה: תאים אלה נחשבים למעבר 0 (P0).</li>
		<li>יש להשליך את הסופרנאטנט עם פיפטה, להשהות מחדש את התאים בתווך תרבית MSC האנושי, ולחסן לצלחות פטרי חדשות בצפיפות זריעה של 1x104 תאים לסמ"ר2 לצורך התפשטות.</li>
	</ol></li>
	<li>באמצעות המוציטומטר, ספור את מספר התא הכולל של שתי השיטות לאחר הגברה במעבר הראשון, השני והשלישי. קבע את המורפולוגיה של התא תחת המיקרוסקופ במעברים הראשון, השלישי והחמישי. הערה: המורפולוגיה של תאים אלה צריכה להיות דומה לתאי P0.</li>
	<li>השתמש בתאים במעבר החמישי עבור ציטומטריית זרימה וניסויים אחרים.</li>
</ol>4. ביטוי סמני פני התא על ידי ציטומטריית זרימה
<ol><li>נתק תאי מעבר 5 (P5) עם 0.25% טריפסין, שטוף את התאים עם חיץ צביעת תאים, וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השהה מחדש את הכדוריות עם חיץ צביעת התא ל 100 μL כל אחת.</li>
	<li>סמן כל צינור והוסף את הכמויות המתאימות של נוגדנים, אשר צומדו עם Allophycocyanin (APC), fluorescein isothiocyanate (FITC) או phycoerythrin (PE): CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE בהתאם להוראות היצרן21. יש לדגור במשך 15-20 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>צנטריפוגו את התאים המוכתמים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, לשאוף את supernatant עם פיפטה, ולשטוף פעם אחת עם חיץ צביעת התא.</li>
	<li>חזור על הצנטריפוגה וההשעיה של התאים עם 300 μL של חיץ צביעת התא.</li>
	<li>הריצו את התאים דרך ציטומטר הזרימה ונתחו את התאים המוכתמים בנוגדנים בהתאם להוראות היצרן.</li>
</ol>5. קביעת עקומת גדילת תאים בשיטת ספירת התאים
<ol><li>הכינו תרחיף חד-תאי של תאי P5 בשתי שיטות על ידי דילולם במדיום תרבית MSC אנושי.</li>
	<li>זרעו 8,000 תאים לבאר בצלחת בת 24 בארות, ובסך הכל נזרעו 21 בארות מכל שיטה. הערה: מערבבים את התאים בעדינות על ידי ניפוח ויניקה עם פיפטות לפני הזריעה.</li>
	<li>קציר תאים משלוש בארות לאחר 24 שעות של זריעה. בצע ספירת תאים באמצעות המוציטומטר כדי לחשב את הערך הממוצע. הערה: נער את הצלחת לפני ספירת התא. ניתן להאריך את משך הרעידות כדי למנוע היווצרות של צברי תאים.</li>
	<li>חזור על ספירת התאים כל 24 שעות למשך זמן כולל של 7 ימים. התווה עקומת גדילה באמצעות זמן (d) על ציר X וספירת תאים (x104/mL) על ציר Y.</li>
</ol>

דיסקציה ובידוד של WJ-MSCs מחבל הטבור האנושי

<ol>
	<li>Abbaszadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+potential+of+Wharton's+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells:+A+new+horizon+of+stem+cell+therapy.">Regenerative potential of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: A new horizon of stem cell therapy.</a> J Cell Physiol. 235 (12), 9230-9240 (2020).</li><li>Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+clinical+applications+of+Wharton's+jelly-derived+mesenchymal+stromal+cells.">Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells.</a> Curr Res Transl Med. 68 (1), 5-16 (2020).</li><li>Kim, D. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wharton's+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells:+Phenotypic+characterization+and+optimizing+their+therapeutic+potential+for+clinical+applications.">Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: Phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications.</a> Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).</li><li>Drobiova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells:+A+concise+review+of+their+secretome+and+prospective+clinical+applications.">Wharton's jelly mesenchymal stem cells: A concise review of their secretome and prospective clinical applications.</a> Front Cell Dev Biol. 11, 1211217 (2023).</li><li>Joerger-Messerli, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+from+Wharton's+jelly+and+amniotic+fluid.">Mesenchymal stem cells from Wharton's jelly and amniotic fluid.</a> Best Pract Res Cl Ob. 31, 30-44 (2016).</li><li>Pera, M., Subramanian, A., Fong, C. -. Y., Biswas, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+characterization+of+cells+from+the+various+compartments+of+the+human+umbilical+cord+shows+that+the+Wharton's+jelly+compartment+provides+the+best+source+of+clinically+utilizable+mesenchymal+stem+cells.">Comparative characterization of cells from the various compartments of the human umbilical cord shows that the Wharton's jelly compartment provides the best source of clinically utilizable mesenchymal stem cells.</a> Plos One. 10 (6), 0127992 (2015).</li><li>Petrenko, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+different+sources,+with+a+focus+on+neuroregenerative+potential.">A comparative analysis of multipotent mesenchymal stromal cells derived from different sources, with a focus on neuroregenerative potential.</a> Sci Rep. 10 (1), 4290 (2020).</li><li>Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Wharton's+jelly:+The+rich,+but+enigmatic,+source+of+mesenchymal+stromal+cells.">Concise review: Wharton's jelly: The rich, but enigmatic, source of mesenchymal stromal cells.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (7), 1620-1630 (2017).</li><li>Pan, Y., Wu, W., Jiang, X., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+in+cardiovascular+and+cerebrovascular+diseases:+From+mechanisms+to+therapy.">Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cardiovascular and cerebrovascular diseases: From mechanisms to therapy.</a> Biomed Pharmacother. 163, 114817 (2023).</li><li>Elshaer, S. L., Bahram, S. H., Rajashekar, P., Gangaraju, R., El-Remessy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mesenchymal+stem+cells+for+enhanced+therapeutic+utility+in+ischemic+vascular+diseases.">Modulation of mesenchymal stem cells for enhanced therapeutic utility in ischemic vascular diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (1), 249 (2021).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+Crohn's+disease:+Systematic+review+and+meta-analysis+of+preclinical+and+clinical+studies.">Stem cell therapy for Crohn's disease: Systematic review and meta-analysis of preclinical and clinical studies.</a> Stem Cell Res Ther. 12 (1), 463 (2021).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+mechanisms+of+mesenchymal+stem+and+stromal+cells+in+inflammatory+diseases.">Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases.</a> Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).</li><li>Kassem, D. H., Kamal, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wharton's+jelly+MSCs:+Potential+weapon+to+sharpen+for+our+battle+against+DM.">Wharton's jelly MSCs: Potential weapon to sharpen for our battle against DM.</a> Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).</li><li>Saleh, M., Fotook Kiaei, S. Z., Kavianpour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Wharton+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells+in+patients+with+pulmonary+fibrosis.">Application of Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells in patients with pulmonary fibrosis.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 71 (2022).</li><li>Varaa, N., Azandeh, S., Khodabandeh, Z., Gharravi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cell:+Various+protocols+for+isolation+and+differentiation+of+hepatocyte-like+cells;+narrative+review.">Wharton's jelly mesenchymal stem cell: Various protocols for isolation and differentiation of hepatocyte-like cells; narrative review.</a> Iran J Med Sci. 44 (6), 437-448 (2019).</li><li>Hassan, G., Kasem, I., Soukkarieh, C., Aljamali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+isolate+and+expand+human+umbilical+cord+derived+mesenchymal+stem+cells:+Using+explant+method+and+umbilical+cord+blood+serum.">A simple method to isolate and expand human umbilical cord derived mesenchymal stem cells: Using explant method and umbilical cord blood serum.</a> Int J Stem Cells. 10 (2), 184-192 (2017).</li><li>Naeem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+isolation+and+culture+protocols+for+human+amniotic+mesenchymal+stem+cells.">A comparison of isolation and culture protocols for human amniotic mesenchymal stem cells.</a> Cell Cycle. 21 (15), 1543-1556 (2022).</li><li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton's+jelly.">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> Biomed Res Int. 2013, 428726 (2013).</li><li>Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+animal+serum+free+expansion+of+human+umbilical+cord+derived+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+and+endothelial+colony+forming+progenitor+cells+(CFCs).">Isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (CFCs).</a> J Vis Exp. (32), e1525 (2009).</li><li>Beeravolu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+umbilical+cord+and+fetal+placenta.">Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta.</a> J Vis Exp. (122), e55224 (2017).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine.">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li><li>Sypecka, M., Bzinkowska, A., Sulejczak, D., Dabrowski, F., Sarnowska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+optimal+manufacturing+protocols+and+therapeutic+properties+of+mesenchymal+stem/stromal+cells+derived+from+Wharton's+jelly.">Evaluation of the optimal manufacturing protocols and therapeutic properties of mesenchymal stem/stromal cells derived from Wharton's jelly.</a> Int J Mol Sci. 24 (1), 652 (2022).</li><li>Binato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+human+mesenchymal+stem+cells+during+in+vitro+culture:+Considerations+for+cell+therapy.">Stability of human mesenchymal stem cells during in vitro culture: Considerations for cell therapy.</a> Cell Prolif. 46 (1), 10-22 (2012).</li><li>Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+cultivation,+and+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells.</a> Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).</li><li>Hendijani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture:+An+advantageous+method+for+isolation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+tissues.">Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues.</a> Cell Prolif. 50 (2), 12334 (2017).</li></ol>

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.

MSCs מייצגים תחום דינמי של מחקר עם השלכות עמוקות על רפואה רגנרטיבית22. תכונותיהם הייחודיות הופכות אותם למוקד מחקר מדעי וטומנים בחובם פוטנציאל לחולל מהפכה בטיפול במגוון רחב של מחלות ופציעות7. WJ-MSCs הם תת-קבוצה נפרדת של MSCs, אשר ניתן לקבל מרקמת החיבור הג'לטינית בתוך UC המ?...

מאז הבידוד הראשון של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) מהג'לי של וורטון (WJ) בשנת 1991, תאי גזע רב-פוטנטיים אלה זכו לתשומת לב משמעותית מצד חוקרים בשל תכונות ההתחדשות שלהםויכולת התמיינות רב-שושלות 1. MSCs ניתן לבודד ממקורות שונים, כולל מח עצם, דם היקפי, מוך השן, רקמת שומן, עובר (הפלה אנושית), ורקמות הקשורות ללידה2. חבל הטבור (UC) התגלה כמאגר מבטיח בשל אופיו הלא פולשני, תפוקת התאים השופעת ויכולת ההתמיינות שלו, המציג קצב גבוה של התפשטות, פוטנציאל התמיינות ותכונות אפנון חיסוני3. MSCs עובריים מפגינים גבעול חזק ותכונות חיסוניות, מה שהופך אותם למוקד העיקרי של ניסויים קליניים ומחקר בסיסי שנערך בשני העשורים האחרונים 2,4,5. MSCs הנגזרים מ- UC הם בעלי פוטנציאל טיפולי מעולה בהשוואה למקורות אחרים של MSC, כגון מח עצם או רקמת שומן 6,7.
UC מורכב אפיתל מי שפיר, שלושה כלי דם (שני עורקים ווריד אחד), ואת החומר הג'לטיני המכונה WJ3. באופן מסקרן, UC מהווה כלי דם פשוט, המורכב רק אנדותל ומזותליום, אבל לא טוניקה adventitia; WJ אינו מכיל לימפה או עצבים8. UC מציג מבנה ייחודי אידיאלי להפרדה מגזרית. UC-MSCs ממוקמים בעיקר ב- WJ. MSCs יכולים להיות מבודדים ממדורים שונים של WJ, כולל מי שפיר, subamnion (מי השפיר והתת-אמניון המוגדרים גם כאזור רירית הטבור), והאזור הפרי-וסקולרי של WJ8. לכל אזור ב-WJ יש מבנה משלו, מאפיינים אימונוהיסטוכימיים ותפקוד 3,6.
MSCs שבודדו מה- WJ של UC נחשבים באופן נרחב כבעלי תועלת קלינית טובה יותר בהשוואה לאלה מאזורים אחרים3. WJ-MSCs נחקרו בהרחבה במסגרות פרה-קליניות וקליניות לטיפול במחלות שונות בשל פוטנציאל ההתמיינות הרב-קווי שלהם, תכונות אימונומודולטוריות, השפעות פרקריניות, השפעות אנטי דלקתיות ותכונות חסויות חיסון 2,3. WJ-MSCs הוכחו כמבטיחים בטיפול במגוון מחלות, כולל מחלת השתל נגד המאכסן (GvHD), דחיית שתלים, מחלת קרוהן, מחלות אוטואימוניות ומחלות לב וכלי דם 9,10,11,12,13,14. ככל שהביקוש הקליני ל-WJ-MSCs ממשיך לגדול, היצע המחסור בחבל הטבור מהווה כיום מכשול ליישומים הנרחבים שלהם.
התפוקה של WJ-MSCs תלויה בשיטה המשמשת לחילוץ תאים15. בעוד WJ-MSCs ניתן לבודד באמצעות תרבית explant או עיכול אנזימים, השיטה האחרונה יש זמן התפשטות ארוך יותר שעלול להגדיל את הסיכון של נזק לתאים ולהפחית את הכדאיות התא16. עם זאת, מחקרים רבים הראו כי שיטת תרבית explant מגבירה את תפוקת התאים ואת הכדאיות, וכי גורמים paracrine שוחרר רקמות explant גם לעזור לקדם את התרבות תאים17,18.
מחקר זה יישם גישת דיסקציה ייחודית להשגת WJ שלם, והניב MSCs עם יכולת שגשוג משופרת, כדאיות וכמות, תוך מזעור הנזק ל- WJ. שיטה חדשנית זו מציעה אסטרטגיה יעילה לבידוד WJ-MSCs, תוך מתן מענה לצרכים קריטיים ביישומי MSC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD44 Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>338806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD73 (Ecto-5&#39;-nucleotidase) Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>344006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>400122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>HIRAYAMA</td>
			<td>HVE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Cell Counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>FL-CD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAMBANKER Cryopreservation Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>302-14681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Buffer</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Machine</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean Bench</td>
			<td>Shanghai ZhiCheng</td>
			<td>C1112B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERAcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro- thermostatic Blast Oven</td>
			<td>Shanghai JingHong</td>
			<td>DHG-9423A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD105 Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>323204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>400110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Superior Marienfeld</td>
			<td>640410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10&#215;)&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>421002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Biological Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Vert. A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Storage Tank</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY50935-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline (NS)</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>393112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD19 Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>392506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD34 Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>343606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>368510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human HLA-DR Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>307606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>400114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG2a, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>400214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Electronic Balance</td>
			<td>Satorius</td>
			<td>PRACTUM313-1CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snowflake Ice Machine</td>
			<td>ZIEGRA</td>
			<td>ZBE 30-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steriled 50 mL plastic tube</td>
			<td>Greniner</td>
			<td>227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic Water Bath</td>
			<td>Shanghai YiHeng</td>
			<td>HWS12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 1:250</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraGRO-Advanced</td>
			<td>Helios&#160;</td>
			<td>HPCFDCGL50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure and Pure Water Purification System</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Milli-Q Reference</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeno-Free Human MSC Culture Medium</td>
			<td>FUKOKU&#160;</td>
			<td>T2011301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells with high yields and low damage

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הם אוכלוסייה של תאים רב-פוטנטיים בעלי תכונות רגנרטיביות ואימונומודולטוריות יוצאות דופן. הג'לי של וורטון (WJ) מחבל הטבור (UC) זכה להתעניינות גוברת בתחום הביו-רפואי כמקור יוצא מן הכלל של MSCs. עם זאת, התעוררו אתגרים כגון היצע מוגבל וחוסר סטנדרטיזציה בשיטות הקיימות. מאמר זה מציג שיטה חדשנית לשיפור תפוקת MSC על ידי ניתוח WJ שלם מחבל הטבור. השיטה משתמשת בדיסקציה קהה כדי להסיר את שכבת האפיתל, תוך שמירה על שלמות ה- WJ כולו וכתוצאה מכך כמות וכדאיות מוגברת של MSCs שנקטפו. גישה זו מפחיתה באופן משמעותי את פסולת WJ בהשוואה לשיטות דיסקציה חדות קונבנציונליות. כדי להבטיח את טוהר WJ-MSCs ולמזער את ההשפעה התאית החיצונית, בוצע הליך המשתמש במתח פנימי כדי לקלף את האנדותל לאחר היפוך UC. בנוסף, צלחת הפטרי הפכה לזמן קצר במהלך תרבית הצמחים כדי לשפר את ההתקשרות ואת צמיחת התאים. ניתוח השוואתי הראה את עליונותה של השיטה המוצעת, והראה תשואה גבוהה יותר של WJ ו- WJ-MSCs עם כדאיות טובה יותר מאשר שיטות מסורתיות. המורפולוגיה ודפוס הביטוי הדומים של סמני פני התא בשתי השיטות מאשרים את אפיונם וטוהרם עבור יישומים שונים. שיטה זו מספקת גישה בעלת תפוקה גבוהה וכדאיות גבוהה לבידוד WJ-MSC, ומדגימה פוטנציאל גדול ליישום קליני של MSCs.

Since the first isolation of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) from Wharton&#39;s jelly (WJ) in 1991, these multipotent stem cells have gained significant attention from researchers due to their regenerative properties and multilineage differentiation capacity1. MSCs can be isolated from various sources, including bone marrow, peripheral blood, dental pulp, adipose tissue, fetal (human abortion), and birth-related tissues2. The umbilical cord (UC) has emerged as a promising reservoir due to its non-invasive nature, abundant cell yield and differentiation capacity, exhibiting a high rate of proliferation, differentiation potential, and immune modulation properties3. Fetal MSCs exhibit strong stemness and immune properties, making them the primary focus of clinical trials and basic research conducted over the past two decades2,4,5. UC-derived MSCs have superior therapeutic potential compared to other sources of MSC, such as bone marrow or adipose tissue6,7.
The UC is composed of amniotic epithelium, three vessels (two arteries and one vein), and the gelatinous substance known as WJ3. Intriguingly, the UC constitutes a simple vasculature, consisting only of the endothelium and mesothelium, but not the tunica adventitia; the WJ does not contain lymph or nerves8. The UC presents a unique structure ideal for segmental separation. UC-MSCs are primarily located in the WJ. MSCs could be isolated from different compartments of the WJ, including amnion, subamnion (the amnion and subamnion also designated as cord lining region), and the perivascular area of the WJ8. Each region of the WJ has its own structure, immunohistochemical characteristics, and function3,6.
MSCs isolated from the WJ of the UC are widely regarded as having superior clinical utility compared to those from other regions3. WJ-MSCs have been extensively studied in preclinical and clinical settings for the treatment of various diseases due to their multi-line differentiation potential, immunomodulatory properties, paracrine effects, anti-inflammatory effects, and immune-privileged properties2,3. WJ-MSCs have been proven to hold promise in treating a range of diseases, including graft-versus-host disease (GvHD), graft rejection, Crohn&#39;s disease, autoimmune diseases, and cardiovascular diseases9,10,11,12,13,14. As clinical demand for WJ-MSCs continues to increase, the shortage supply of umbilical cords is currently an impediment to their widespread applications.
The yield of WJ-MSCs is dependent on the method used for cell extraction15. While WJ-MSCs can be isolated through explant culture or enzyme digestion, the latter method has a longer propagation time that may increase the risk of cell damage and decrease cell viability16. However, numerous studies have shown that the explant culture method increases cell yields and viability, and that paracrine factors released from explant tissues also help promote cell proliferation17,18.
This study applied a unique dissection approach to obtain whole WJ, yielding MSCs with enhanced proliferative capacity, viability, and quantity, while minimizing damage to the WJ. This innovative method offers a streamlined strategy for isolating WJ-MSCs, addressing critical needs in MSC applications.

זרקור על המחבר: התקדמות באורגנואידים וסקולריים שמקורם בתאי גזע ובידוד אופטימלי של הג'לי של וורטון לייצור MSC משופר

בידוד תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור עם יבולים גבוהים ונזק נמוך

Our research used human stem cells to create various organoids. They can mimic human organs. We developed unique techniques for mesoderm and endoderm co-differentiation.They enable these organoids with rich blood networks. These organoids will promote organ development, regeneration medicine, disease model, drug screening, and personalized medicine, such as organoid transplantation. Our protocol addresses a research gap in optimizing the isolation of intact Wharton's jelly from the umbilical cord, while preserving its perivascular and subamniotic components.This method aims to enhance the yield, viability, and proliferative ability of mesenchymal stem cells, offering a cost-effective approach to augment MSC production. The advantage of our protocol lies in its ability to obtain a higher Wharton's jelly's yield and harvest more MSCs with better proliferative ability compared to traditional methods.

הנהלים לאיסוף וטיפוח UC-MSCs, כמו גם הניתוח הבא שלהם, מסוכמים באיור 1. ה-UC חולק בצורה מסודרת למספר חלקים בשיטה הייחודית; תרשים הפעולה הספציפי של ההליכים העיקריים מתואר באיור 2. צמיחתם של תאים מתרביות צמחים נוטרה ותועדה באופן שגרתי. תאים דבקים בצורת ציר נצפו כ -4 י?...

מחקר זה מציג הליך דיסקציה קהה ייחודי לשמירה על שלמות הג'לי של וורטון (WJ), וכתוצאה מכך WJ פחות פגום וכמות וכדאיות גדולה יותר של תאי גזע מזנכימליים שנקטפו (MSC). השיטה מפגינה תפוקה ויכולת שגשוג גבוהות בהשוואה לשיטות דיסקציה חדות קונבנציונליות.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells with remarkable regenerative and immunomodulatory properties. Wharton's jelly (WJ) ...

isolation-umbilical-cord-derived-mesenchymal-stem-cells-with-high

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells with High Yields and Low Damage

893 Views.  Beijing University of Chinese Medicine. המחקר שלנו השתמש בתאי גזע אנושיים כדי ליצור אורגנואידים שונים. הם יכולים לחקות איברים אנושיים. פיתחנו טכניקות ייחודיות עבור mesoderm ו endoderm co-differentiation.הם מאפשרים אורגנואידים אלה עם רשתות דם עשירות. אורגנואידים אלה יקדמו פיתוח איברים, רפואת רגנרציה, מודל מ...

Video: זרקור על המחבר: התקדמות באורגנואידים וסקולריים שמקורם בתאי גזע ובידוד אופטימלי של הג'לי של וורטון לייצור MSC משופר

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells with remarkable regenerative and immunomodulatory properties. Wharton's jelly (WJ) from the umbilical cord (UC) has gained increasing interest in the biomedical field as an outstanding source of MSCs. However, challenges such as limited supply and lack of standardization in existing methods have arisen. This article presents a novel method for enhancing MSC yield by dissecting intact WJ from the umbilical cord. The method employs blunt dissection to remove the epithelial layer, maintaining the integrity of the entire WJ and resulting in an increased quantity and viability of harvested MSCs. This approach significantly reduces WJ waste compared to conventional sharp dissection methods. To ensure the purity of WJ-MSCs and minimize external cellular influence, a procedure utilizing internal tension to peel off the endothelium after flipping the UC was conducted. Additionally, the Petri dish was inverted for a short time during explant culture to improve attachment and cell outgrowth. Comparative analysis demonstrated the superiority of the proposed method, showing a higher yield of WJ and WJ-MSCs with better viability than traditional methods. The similar morphology and expression pattern of cell surface markers in both methods confirm their characterization and purity for various applications. This method provides a high-yield and high-viability approach for WJ-MSC isolation, demonstrating great potential for the clinical application of MSCs.

This study presents a unique blunt dissection procedure to preserve the integrity of Wharton's jelly (WJ), resulting in less damaged WJ and a greater quantity and viability of the harvested mesenchymal stem cells (MSCs). The method demonstrates superior yield and proliferative ability compared to conventional sharp dissection methods.

Isolation and Culture of Wharton&#39;s Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells (WJ-MSCs) from the Umbilical Cord

To begin, place all the sterile surgical instruments on the working platform. In the biosafety cabinet, disinfect the surface of the tube containing the previously collected human umbilical cord with 75%ethanol. Remove the sample into a Petri dish.Immerse the sample with the knots in 75%ethanol for 30 seconds. Then, in a new Petri dish, rinse the sample multiple times with sterile PBS. Using surgical scissors and forceps, cut the knots off, then cut the cord between two knots transversely into short pieces.Perfuse the vein with PBS using a one milliliter pipette until the fluid coming out of the other end of the cord becomes completely transparent. Transfer one of the already cut pieces of umbilical cord to a new Petri dish. Add the appropriate amount of PBS to keep the cord wet throughout the operation.Grasp the cord with forceps and pull out the arteries along its major axis with the help of mosquito clamps. To fix the cord horizontally with the thicker side facing up, insert one blade of the forceps into the umbilical vein and clamp it tightly, ensuring the forceps clamp on the thicker side. Using a scalpel, make a linear incision on the amniotic epithelium layer from one end to the other, along the edge of the other blade of the forceps.From the cutting gap corner, lift the corner of the amniotic epithelium with tooth clamps, and continue to cut horizontally a little further with corneal scissors along the inner surface of the epithelium. Separate the Wharton's jelly and amniotic epithelium with clamps, and gradually expand to the whole circle of one end of the umbilical cord. Peel off the epithelial layer lengthways.Insert both blades of the forceps inside the vein. Clamp a portion of Wharton's jelly, and then flip it inside out to expose the epithelium of the umbilical vein. Peel off the epithelium of the vein easily.Place the collected Wharton's jelly in a pre-labeled 90 millimeter Petri dish and cut it into one to three millimeter pieces with scissors and forceps. Invert the dish with the cap on the bottom and place it in a 5%carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Change the human mesenchymal stem cell culture medium every three days.Compared to the conventional approach, the unique blunt dissection procedure showed a significant increase in Wharton's jelly yield. Further analysis by counting the total quantity of Wharton's jelly mesenchymal stem cells by both methods showed a pronounced gap in cell quantity with increasing passage numbers. The proliferation rate of mesenchymal stem cells in the novel method was significantly higher after two days.