Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82172107), Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong, China (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), Fundo de Pesquisa Médica de Shenzhen (SMRF. D2301015), o Comitê Municipal de Inovação em Ciência e Tecnologia de Shenzhen (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) e o Fundo Especial do Distrito de Longgang para o Desenvolvimento Econômico e Tecnológico (LGKCYLWS2022007).

As amostras foram obtidas de doadores saudáveis e consentidos do Hospital de Saúde Infantil e Maternidade do Distrito de Shenzhen Longgang, Guangdong, China. O uso de amostras humanas para o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Shenzhen, Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (SZLDH2020LSYM-095) e Comitê de Ética Médica do Hospital de Maternidade e Saúde Infantil do Distrito de Shenzhen Longgang (LGFYYXLLS-2020-005). Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes aprovadas. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.
1. Coleta de cordão umbilical humano
<ol><li>Obter amostras do cordão umbilical humano do hospital cooperativo em condições estéreis. NOTA: Escolha um doador com menos de 35 anos de idade, de preferência um primípara, sem histórico de hepatite, doenças sexualmente transmissíveis ou distúrbios genéticos. Os resultados do exame de admissão para vírus da hepatite B, vírus da hepatite C e citomegalovírus precisam ser negativos. Escolha a cesariana como via de parto.</li>
	<li>Selecione uma peça reta e intacta de UC de aproximadamente 10-15 cm de comprimento.</li>
	<li>Feche ambas as extremidades com pinça hemostática e ligue com nós cirúrgicos na extremidade interna entre as pinças logo após o parto de um recém-nascido a termo por cesariana. (UC coletado conforme mostrado na Figura 1, etapa 1). NOTA: A operação da cesariana garante que a coleta seja estéril. Use nós cirúrgicos de sutura tamanho 0 ou 2-0 para melhor resistência à tração.</li>
	<li>Corte o cordão umbilical amarrado entre a pinça e os nós usando uma tesoura cirúrgica (Figura 1, passo 1).</li>
	<li>Enxágue com solução salina para remover quaisquer coágulos sanguíneos contaminantes na superfície e transfira imediatamente para um tubo de plástico estéril de 50 mL contendo 20 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). NOTA: Nenhum antibiótico foi usado durante a transferência.</li>
	<li>Sele o tubo. Colocá-lo sobre gelo numa caixa de poliestireno e guardá-lo a 4 °C antes de o transportar para o laboratório. NOTA: Disseque o cabo dentro de 4 h após a coleta.</li>
</ol>2. Isolamento da geléia de Wharton do cordão umbilical
<ol><li>Processe o cordão umbilical seguindo as etapas abaixo:<ol><li>Prepare uma bandeja esterilizada com instrumentos cirúrgicos, pratos de 90 mm embalados assepticamente, pipetas de 1000 μL, PBS estéril, solução de etanol a 75% e meio de cultura MSC humano livre de xeno. NOTA: A pinça dentada e as pinças de mosquito permitem que o cordão escorregadio seja tratado com eficiência.</li>
		<li>Descontamine a superfície dos itens necessários e a zona de trabalho antes de colocar os itens dentro do gabinete de biossegurança. NOTA: Deixe o ar da zona de trabalho purgar por alguns minutos antes de iniciar o trabalho.</li>
		<li>Desinfete a superfície do tubo e remova a amostra em uma placa de Petri no gabinete de biossegurança. Mergulhe a amostra com os nós em etanol a 75% por 30 s e depois enxágue várias vezes com PBS estéril em uma nova placa de Petri. NOTA: O cabo deve ser ligado antes da imersão em etanol a 75%, e o tempo de imersão deve ser limitado a 30 s a 1 min para desinfetar totalmente o cabo sem danos.</li>
		<li>Corte os nós e corte o cordão entre dois nós transversalmente em pedaços curtos de cerca de 2 cm de comprimento com tesoura cirúrgica e pinça. NOTA: As extremidades do cabo com nós devem ser descartadas. O comprimento da UC não deve ser muito longo ou muito curto; Ambas as condições podem aumentar a dificuldade da operação.</li>
		<li>Perfundir a veia (vaso maior) com PBS usando pipetas de 1000 μL até que o fluido que sai da outra extremidade do cordão se torne completamente transparente19.</li>
	</ol></li>
	<li>Disseque o cordão umbilical.<ol><li>Transfira um dos pedaços já cortados para uma nova placa de Petri. NOTA: Duas artérias e uma veia devem estar expostas visivelmente na seção transversal8 (Figura 2B).</li>
		<li>Adicione a quantidade apropriada de PBS para manter o cabo úmido durante toda a operação.</li>
		<li>Segure o cordão com uma pinça e puxe as artérias ao longo de seu eixo principal com a ajuda de grampos de mosquito. NOTA: Tente puxar da outra extremidade do cordão se a artéria tiver sido arrancada, pois a parede da artéria tem grande elasticidade.</li>
		<li>Fixe o cordão horizontalmente com o lado mais grosso voltado para cima, inserindo uma lâmina da pinça na veia umbilical e, em seguida, apertando firmemente, garantindo que a pinça prenda no lado mais grosso.</li>
		<li>Faça uma incisão linear na camada de epitélio amniótico de uma extremidade à outra ao longo da borda da outra lâmina da pinça usando um bisturi (Figura 3). NOTA: Preserve a integridade da geléia de Wharton cortando o mínimo de WJ possível.</li>
		<li>Comece em um canto da lacuna de corte. Levante o canto do epitélio amniótico com grampos dentados e continue a cortar horizontalmente um pouco mais com uma tesoura de córnea ao longo da superfície interna do epitélio.<ol><li>Separe a geléia de Wharton e o epitélio amniótico com grampos e expanda gradualmente para todo o círculo de uma extremidade da UC. Retire a camada epitelial longitudinalmente (Figura 3). NOTA: A geléia de Wharton é um tecido conjuntivo mucoso envolvido pelo epitélio amniótico denso8. Toda a operação deve ser suave, mas grampos de mosquito podem ser usados para dissecção romba se houver dificuldades durante o peeling.</li>
		</ol></li>
		<li>Insira as duas lâminas da pinça dentro da veia, prenda uma parte do WJ e, em seguida, vire-a do avesso para expor o epitélio da veia umbilical (Figura 3).</li>
		<li>Retire o epitélio da veia facilmente, pois a tensão interna cria uma separação entre o epitélio da veia e a WJ perivascular (Figura 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecar o usando o método convencional para comparação20.<ol><li>Escolha outra amostra já cortada com quase o mesmo peso do cordão anterior e transfira-a para uma nova placa de Petri.</li>
		<li>Corte longitudinalmente ao longo da veia umbilical com tesoura e espalhe o para expor os vasos e a JU.</li>
		<li>Remova a veia umbilical e duas artérias e retire o WJ da camada endotelial com tesoura e bisturi.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Isolamento e cultura de UC-MSCs
<ol><li>Coloque o WJ coletado em uma placa de Petri pré-rotulada de 90 mm e corte-o em pedaços de 1-3 mm com tesoura e pinça.</li>
	<li>Inverta o prato com a tampa no fundo e coloque-o em uma incubadora de CO5% 2 a 37 °C por 30 min para fortalecer a fixação entre as peças e a superfície plástica.</li>
	<li>Vire o prato e adicione delicadamente uma quantidade adequada de meio de cultura MSC humano para cultura posterior. NOTA: Use a velocidade mais baixa para garantir que as peças ainda estejam presas.</li>
	<li>Troque o meio de cultura MSC humano a cada 3 dias. Troque dois terços do meio e observe o aparecimento de crescimento de células fibrosas a cada 2 dias nos primeiros 7 dias, troque o meio completo e observe-o diariamente a partir de então. NOTA: Evite mover a placa de Petri nos primeiros 7 dias. O crescimento distinto de células semelhantes a fibroblastos foi observado em cerca de 4 dias.</li>
	<li>Subcultura até que a confluência atinja 80%. NOTA: Esta etapa leva de 7 a 10 dias.<ol><li>Pré-aqueça o meio de cultura PBS, 0,25% de tripsina e MSC humano livre de xeno a 37 ° C em banho-maria.</li>
		<li>Enxágüe com PBS após aspirar o sobrenadante com pipetas e retire as células com tripsina a 0,25% pré-aquecida até que as células possam ser desalojadas batendo na placa de Petri.</li>
		<li>Inative a tripsina misturando o meio de cultura MSC pré-aquecido na proporção de 4:1, colete a suspensão celular e centrifugue a 300 x g por 5 min a 4 °C. NOTA: Essas células são consideradas passagem 0 (P0).</li>
		<li>Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta, ressuspender as células no meio de cultura MSC humano e inocular em novas placas de Petri com uma densidade de semeadura de 1x104 células/cm2 para propagação.</li>
	</ol></li>
	<li>Usando um hemocitômetro, conte o número total de células dos dois métodos após a amplificação na primeira, segunda e terceira passagem. Determine a morfologia celular ao microscópio na primeira, terceira e quinta passagens. NOTA: A morfologia dessas células deve ser semelhante às células P0.</li>
	<li>Use células na quinta passagem para citometria de fluxo e outros experimentos.</li>
</ol>4. Expressão de marcadores de superfície celular por citometria de fluxo
<ol><li>Separe as células de passagem 5 (P5) com 0,25% de tripsina, lave as células com tampão de coloração celular e centrifugue a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Ressuspenda os grânulos com tampão de coloração celular a 100 μL cada.</li>
	<li>Rotular cada tubo e adicionar as quantidades apropriadas de anticorpos, que foram conjugados com aloficocianina (APC), isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou ficoeritrina (PE): CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE seguindo as instruções do fabricante21. Incube por 15-20 min no escuro em temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugue as células coradas a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C, aspire o sobrenadante com uma pipeta e lave uma vez com tampão de coloração celular.</li>
	<li>Repita a centrifugação e ressuspensão das células com 300 μL do tampão de coloração celular.</li>
	<li>Passe as células pelo citômetro de fluxo e analise as células coradas com anticorpos de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>5. Determinação da curva de crescimento celular pelo método de contagem de células
<ol><li>Preparar uma suspensão unicelular de células P5 utilizando dois métodos, diluindo-as num meio de cultura MSC humano.</li>
	<li>Semeie 8.000 células por poço em uma placa de 24 poços, com um total de 21 poços de cada método sendo semeado. NOTA: Misture as células suavemente soprando e aspirando com pipetas antes da semeadura.</li>
	<li>Colha células de três poços após 24 h de semeadura. Realize a contagem de células usando um hemocitômetro para calcular o valor médio. NOTA: Agite a placa antes da contagem da célula. A duração da agitação pode ser estendida para evitar a formação de agregados celulares.</li>
	<li>Repita a contagem de células a cada 24 h por um período total de 7 dias. Trace uma curva de crescimento usando o tempo (d) no eixo X e a contagem de células (x104/mL) no eixo Y.</li>
</ol>

Dissecção e isolamento de WJ-MSCs do cordão umbilical humano

<ol>
	<li>Abbaszadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+potential+of+Wharton's+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells:+A+new+horizon+of+stem+cell+therapy.">Regenerative potential of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: A new horizon of stem cell therapy.</a> J Cell Physiol. 235 (12), 9230-9240 (2020).</li><li>Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+clinical+applications+of+Wharton's+jelly-derived+mesenchymal+stromal+cells.">Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells.</a> Curr Res Transl Med. 68 (1), 5-16 (2020).</li><li>Kim, D. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wharton's+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells:+Phenotypic+characterization+and+optimizing+their+therapeutic+potential+for+clinical+applications.">Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: Phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications.</a> Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).</li><li>Drobiova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells:+A+concise+review+of+their+secretome+and+prospective+clinical+applications.">Wharton's jelly mesenchymal stem cells: A concise review of their secretome and prospective clinical applications.</a> Front Cell Dev Biol. 11, 1211217 (2023).</li><li>Joerger-Messerli, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+from+Wharton's+jelly+and+amniotic+fluid.">Mesenchymal stem cells from Wharton's jelly and amniotic fluid.</a> Best Pract Res Cl Ob. 31, 30-44 (2016).</li><li>Pera, M., Subramanian, A., Fong, C. -. 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Os autores não relatam conflitos de interesse.

As CTMs representam uma área dinâmica de pesquisa com profundas implicações para a medicina regenerativa22. Suas propriedades únicas os tornam um ponto focal para a investigação científica e têm o potencial de revolucionar o tratamento de uma ampla gama de doenças e lesões7. As WJ-MSCs são um subconjunto distinto de MSCs, que podem ser obtidas do tecido conjuntivo gelatinoso dentro da UC situado entre o epitélio intervascular e amniótico23</s...

Desde o primeiro isolamento de células-tronco mesenquimais (MSCs) da geléia de Wharton (WJ) em 1991, essas células-tronco multipotentes ganharam atenção significativa dos pesquisadores devido às suas propriedades regenerativas e capacidade de diferenciação de múltiplas linhagens1. As CTMs podem ser isoladas de várias fontes, incluindo medula óssea, sangue periférico, polpa dentária, tecido adiposo, fetal (aborto humano) e tecidos relacionados ao parto2. O cordão umbilical () tem emergido como um reservatório promissor devido à sua natureza não invasiva, abundante rendimento celular e capacidade de diferenciação, exibindo uma alta taxa de proliferação, potencial de diferenciação e propriedades de imunomodulação3. As CTMs fetais exibem forte estaminalidade e propriedades imunológicas, tornando-as o foco principal de ensaios clínicos e pesquisas básicas realizadas nas últimas duas décadas 2,4,5. As CTMs derivadas de têm potencial terapêutico superior em comparação com outras fontes de CTM, como medula óssea ou tecido adiposo 6,7.
O é composto por epitélio amniótico, três vasos (duas artérias e uma veia) e a substância gelatinosa conhecida como WJ3. Curiosamente, a UC constitui uma vasculatura simples, constituída apenas pelo endotélio e mesotélio, mas não pela túnica adventícia; o WJ não contém linfa ou nervos8. A UC apresenta uma estrutura única ideal para separação segmentar. As UC-MSCs estão localizadas principalmente no WJ. As CTMs podem ser isoladas de diferentes compartimentos da JM, incluindo âmnio, subâmnio (âmnio e subâmnio também designados como região de revestimento do cordão) e a área perivascular da JE8. Cada região da WJ tem sua própria estrutura, características imuno-histoquímicas e função 3,6.
As CTMs isoladas da WJ da UC são amplamente consideradas como tendo utilidade clínica superior em comparação com as de outras regiões3. As WJ-MSCs têm sido extensivamente estudadas em ambientes pré-clínicos e clínicos para o tratamento de várias doenças devido ao seu potencial de diferenciação multilinha, propriedades imunomoduladoras, efeitos parácrinos, efeitos anti-inflamatórios e propriedades imuno-privilegiadas 2,3. As WJ-MSCs provaram ser promissoras no tratamento de uma variedade de doenças, incluindo doença do enxerto contra o hospedeiro (GvHD), rejeição do enxerto, doença de Crohn, doenças autoimunes e doenças cardiovasculares 9,10,11,12,13,14. À medida que a demanda clínica por WJ-MSCs continua a aumentar, a escassez de oferta de cordões umbilicais é atualmente um impedimento para suas aplicações generalizadas.
O rendimento das WJ-MSCs depende do método usado para extração celular15. Embora as WJ-MSCs possam ser isoladas por meio de cultura de explante ou digestão enzimática, o último método tem um tempo de propagação mais longo que pode aumentar o risco de dano celular e diminuir a viabilidade celular16. No entanto, vários estudos mostraram que o método de cultura de explante aumenta a produtividade e a viabilidade celular, e que fatores parácrinos liberados dos tecidos do explante também ajudam a promover a proliferação celular17,18.
Este estudo aplicou uma abordagem de dissecção única para obter WJ inteiro, produzindo MSCs com maior capacidade proliferativa, viabilidade e quantidade, minimizando os danos ao WJ. Este método inovador oferece uma estratégia simplificada para isolar WJ-MSCs, atendendo às necessidades críticas em aplicações MSC.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD44 Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>338806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD73 (Ecto-5&#39;-nucleotidase) Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>344006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>400122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>HIRAYAMA</td>
			<td>HVE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Cell Counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>FL-CD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAMBANKER Cryopreservation Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>302-14681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Buffer</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Machine</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean Bench</td>
			<td>Shanghai ZhiCheng</td>
			<td>C1112B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERAcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro- thermostatic Blast Oven</td>
			<td>Shanghai JingHong</td>
			<td>DHG-9423A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD105 Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>323204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>400110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Superior Marienfeld</td>
			<td>640410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10&#215;)&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>421002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Biological Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Vert. A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Storage Tank</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY50935-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline (NS)</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>393112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD19 Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>392506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD34 Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>343606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>368510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human HLA-DR Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>307606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>400114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG2a, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>400214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Electronic Balance</td>
			<td>Satorius</td>
			<td>PRACTUM313-1CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snowflake Ice Machine</td>
			<td>ZIEGRA</td>
			<td>ZBE 30-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steriled 50 mL plastic tube</td>
			<td>Greniner</td>
			<td>227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic Water Bath</td>
			<td>Shanghai YiHeng</td>
			<td>HWS12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 1:250</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraGRO-Advanced</td>
			<td>Helios&#160;</td>
			<td>HPCFDCGL50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure and Pure Water Purification System</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Milli-Q Reference</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeno-Free Human MSC Culture Medium</td>
			<td>FUKOKU&#160;</td>
			<td>T2011301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells with high yields and low damage

As células-tronco mesenquimais (CTMs) são uma população de células multipotentes com propriedades regenerativas e imunomoduladoras notáveis. A geléia de Wharton (WJ) do cordão umbilical (UC) tem ganhado um interesse crescente no campo biomédico como uma excelente fonte de MSCs. No entanto, surgiram desafios como oferta limitada e falta de padronização nos métodos existentes. Este artigo apresenta um novo método para aumentar o rendimento do MSC dissecando WJ intacto do cordão umbilical. O método emprega dissecção romba para remover a camada epitelial, mantendo a integridade de todo o WJ e resultando em um aumento da quantidade e viabilidade das MSCs colhidas. Essa abordagem reduz significativamente o desperdício de WJ em comparação com os métodos convencionais de dissecção aguda. Para garantir a pureza das WJ-MSCs e minimizar a influência celular externa, foi realizado um procedimento utilizando tensão interna para descascar o endotélio após a inversão do UC. Além disso, a placa de Petri foi invertida por um curto período de tempo durante o cultivo de explantes para melhorar a fixação e o crescimento celular. A análise comparativa demonstrou a superioridade do método proposto, mostrando um maior rendimento de WJ e WJ-MSCs com melhor viabilidade do que os métodos tradicionais. A morfologia e o padrão de expressão semelhantes dos marcadores de superfície celular em ambos os métodos confirmam sua caracterização e pureza para várias aplicações. Este método fornece uma abordagem de alto rendimento e alta viabilidade para o isolamento de WJ-MSC, demonstrando grande potencial para a aplicação clínica de MSCs.

Since the first isolation of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) from Wharton&#39;s jelly (WJ) in 1991, these multipotent stem cells have gained significant attention from researchers due to their regenerative properties and multilineage differentiation capacity1. MSCs can be isolated from various sources, including bone marrow, peripheral blood, dental pulp, adipose tissue, fetal (human abortion), and birth-related tissues2. The umbilical cord (UC) has emerged as a promising reservoir due to its non-invasive nature, abundant cell yield and differentiation capacity, exhibiting a high rate of proliferation, differentiation potential, and immune modulation properties3. Fetal MSCs exhibit strong stemness and immune properties, making them the primary focus of clinical trials and basic research conducted over the past two decades2,4,5. UC-derived MSCs have superior therapeutic potential compared to other sources of MSC, such as bone marrow or adipose tissue6,7.
The UC is composed of amniotic epithelium, three vessels (two arteries and one vein), and the gelatinous substance known as WJ3. Intriguingly, the UC constitutes a simple vasculature, consisting only of the endothelium and mesothelium, but not the tunica adventitia; the WJ does not contain lymph or nerves8. The UC presents a unique structure ideal for segmental separation. UC-MSCs are primarily located in the WJ. MSCs could be isolated from different compartments of the WJ, including amnion, subamnion (the amnion and subamnion also designated as cord lining region), and the perivascular area of the WJ8. Each region of the WJ has its own structure, immunohistochemical characteristics, and function3,6.
MSCs isolated from the WJ of the UC are widely regarded as having superior clinical utility compared to those from other regions3. WJ-MSCs have been extensively studied in preclinical and clinical settings for the treatment of various diseases due to their multi-line differentiation potential, immunomodulatory properties, paracrine effects, anti-inflammatory effects, and immune-privileged properties2,3. WJ-MSCs have been proven to hold promise in treating a range of diseases, including graft-versus-host disease (GvHD), graft rejection, Crohn&#39;s disease, autoimmune diseases, and cardiovascular diseases9,10,11,12,13,14. As clinical demand for WJ-MSCs continues to increase, the shortage supply of umbilical cords is currently an impediment to their widespread applications.
The yield of WJ-MSCs is dependent on the method used for cell extraction15. While WJ-MSCs can be isolated through explant culture or enzyme digestion, the latter method has a longer propagation time that may increase the risk of cell damage and decrease cell viability16. However, numerous studies have shown that the explant culture method increases cell yields and viability, and that paracrine factors released from explant tissues also help promote cell proliferation17,18.
This study applied a unique dissection approach to obtain whole WJ, yielding MSCs with enhanced proliferative capacity, viability, and quantity, while minimizing damage to the WJ. This innovative method offers a streamlined strategy for isolating WJ-MSCs, addressing critical needs in MSC applications.

Autor em destaque: Avanços em organoides vascularizados derivados de células-tronco e isolamento otimizado da geléia de Wharton para produção aprimorada de MSC

Isolamento de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical com alto rendimento e baixo dano

Our research used human stem cells to create various organoids. They can mimic human organs. We developed unique techniques for mesoderm and endoderm co-differentiation.They enable these organoids with rich blood networks. These organoids will promote organ development, regeneration medicine, disease model, drug screening, and personalized medicine, such as organoid transplantation. Our protocol addresses a research gap in optimizing the isolation of intact Wharton's jelly from the umbilical cord, while preserving its perivascular and subamniotic components.This method aims to enhance the yield, viability, and proliferative ability of mesenchymal stem cells, offering a cost-effective approach to augment MSC production. The advantage of our protocol lies in its ability to obtain a higher Wharton's jelly's yield and harvest more MSCs with better proliferative ability compared to traditional methods.

Os procedimentos para coleta e cultura de UC-MSCs, bem como sua análise subsequente, estão resumidos na Figura 1. A UC foi cuidadosamente dissecada em várias seções usando o método único; o diagrama de operação específico dos principais procedimentos é ilustrado na Figura 2. O crescimento de células de culturas de explantes foi rotineiramente monitorado e registrado. Células fusiformes aderentes foram observadas aproximadamente 4 dias após a cultur...

Este estudo apresenta um procedimento único de dissecção romba para preservar a integridade da geléia de Wharton (WJ), resultando em WJ menos danificado e uma maior quantidade e viabilidade das células-tronco mesenquimais (MSCs) colhidas. O método demonstra rendimento superior e capacidade proliferativa em comparação com os métodos convencionais de dissecção aguda.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells with remarkable regenerative and immunomodulatory properties. Wharton's jelly (WJ) ...

isolation-umbilical-cord-derived-mesenchymal-stem-cells-with-high

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells with High Yields and Low Damage

836 visualizações.  Beijing University of Chinese Medicine. Nossa pesquisa usou células-tronco humanas para criar vários organoides. Eles podem imitar órgãos humanos. Desenvolvemos técnicas exclusivas para co-diferenciação de mesoderme e endoderme.Eles permitem que esses organoides tenham ricas redes sanguíneas. Esses organoides promoverão o desenvolvimento de órgãos, medicina regenerativa, modelo de doença, triagem de drogas e medicina personalizada, como transplante de organoides. Nosso protocolo ...

Vídeo: Autor em destaque: Avanços em organoides vascularizados derivados de células-tronco e isolamento otimizado da geléia de Wharton para produção aprimorada de MSC