Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (82172107), dalla Natural Science Foundation of Guangdong Province, Cina (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), Shenzhen Medical Research Fund (SMRF. D2301015), il Comitato municipale per l'innovazione scientifica e tecnologica di Shenzhen (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) e il Fondo speciale per lo sviluppo economico e tecnologico del distretto di Longgang (LGKCYLWS2022007).

I campioni sono stati ottenuti da donatori sani e consenzienti dell'ospedale per la maternità e l'assistenza sanitaria infantile del distretto di Shenzhen Longgang, Guangdong, Cina. L'uso di campioni umani per lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale di Shenzhen, dall'Università di Medicina Cinese di Pechino (SZLDH2020LSYM-095) e dal Comitato Etico Medico dell'Ospedale per la Maternità e l'Assistenza Sanitaria Infantile del Distretto di Shenzhen Longgang (LGFYYXLLS-2020-005). Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida approvate. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Raccolta del cordone ombelicale umano
<ol><li>Ottenere campioni di cordone ombelicale umano dall'ospedale cooperativo in condizioni sterili. NOTA: Scegli un donatore di età inferiore ai 35 anni, preferibilmente una primipara, senza storia di epatite, malattie sessualmente trasmissibili o disturbi genetici. I risultati dell'esame di ammissione per il virus dell'epatite B, il virus dell'epatite C e il citomegalovirus devono essere negativi. Scegli il taglio cesareo come modalità di parto.</li>
	<li>Seleziona un pezzo dritto e intatto di UC di circa 10-15 cm di lunghezza.</li>
	<li>Chiudere entrambe le estremità con una pinza emostatica e legare con nodi chirurgici all'estremità interna tra le pinze subito dopo il parto di un neonato a termine con taglio cesareo. (UC raccolto come mostrato nella Figura 1, passaggio 1). NOTA: L'operazione del taglio cesareo garantisce che la raccolta sia sterile. Utilizzare nodi chirurgici di sutura di dimensione 0 o 2-0 per una migliore resistenza alla trazione.</li>
	<li>Tagliare il cordone ombelicale legato tra la pinza e i nodi usando le forbici chirurgiche (Figura 1, passaggio 1).</li>
	<li>Sciacquarlo con una soluzione salina per rimuovere eventuali coaguli di sangue contaminanti sulla superficie e trasferirlo prontamente in una provetta di plastica sterile da 50 ml contenente 20 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). NOTA: Durante il trasferimento non è stato utilizzato alcun antibiotico.</li>
	<li>Sigillare il tubo. Metterlo sul ghiaccio in una scatola di polistirolo e conservarlo a 4 °C prima di trasportarlo in laboratorio. NOTA: Sezionare il cavo entro 4 ore dalla raccolta.</li>
</ol>2. Isolamento della gelatina di Wharton dal cordone ombelicale
<ol><li>Elaborare il cordone ombelicale seguendo i passaggi seguenti:<ol><li>Preparare un vassoio sterilizzato con strumenti chirurgici, piastre da 90 mm confezionate in modo asettico, pipette da 1000 μl, PBS sterile, soluzione di etanolo al 75% e terreno di coltura MSC umano privo di xeno. NOTA: Le pinze dentate e i morsetti antizanzare consentono di trattare in modo efficiente il cavo strisciante.</li>
		<li>Decontaminare la superficie e la zona di lavoro necessari prima di posizionare gli articoli all'interno della cappa di biosicurezza. NOTA: Lasciare che l'aria della zona di lavoro sfiati per alcuni minuti prima di iniziare il lavoro.</li>
		<li>Disinfettare la superficie della provetta e rimuovere il campione in una capsula di Petri nella cabina di biosicurezza. Immergere il campione con i nodi in etanolo al 75% per 30 s e poi risciacquarlo più volte con PBS sterile in una nuova capsula di Petri. NOTA: Il cavo deve essere legato prima di immergerlo in etanolo al 75% e il tempo di immersione deve essere limitato da 30 s a 1 minuto per disinfettare completamente il cavo senza danni.</li>
		<li>Tagliare i nodi e tagliare il cordoncino tra due nodi trasversalmente in pezzi corti di circa 2 cm di lunghezza con forbici chirurgiche e pinze. NOTA: Le estremità del cavo con nodi devono essere smaltite. La lunghezza dell'UC non dovrebbe essere né troppo lunga né troppo corta; Entrambe le condizioni possono aumentare la difficoltà dell'operazione.</li>
		<li>Perfondere la vena (recipiente più grande) con PBS utilizzando pipette da 1000 μl fino a quando il fluido che esce dall'altra estremità del cordone diventa completamente trasparente19.</li>
	</ol></li>
	<li>Sezionare il cordone ombelicale.<ol><li>Trasferire uno dei pezzi già tagliati in una nuova capsula di Petri. NOTA: Due arterie e una vena devono essere esposte visibilmente sulla sezione trasversale8 (Figura 2B).</li>
		<li>Aggiungere la quantità appropriata di PBS per mantenere il cavo bagnato durante l'operazione.</li>
		<li>Afferrare il cavo con una pinza ed estrarre le arterie lungo il suo asse maggiore con l'aiuto di pinze per zanzare. NOTA: Provare a tirare dall'altra estremità del cavo se l'arteria è stata strappata, poiché la parete dell'arteria ha una grande elasticità.</li>
		<li>Fissare il cordino orizzontalmente con il lato più spesso rivolto verso l'alto inserendo una lama della pinza nella vena ombelicale e poi serrando saldamente, assicurandosi che la pinza si blocchi sul lato più spesso.</li>
		<li>Praticare un'incisione lineare sullo strato di epitelio amniotico da un'estremità all'altra lungo il bordo dell'altra lama della pinza utilizzando un bisturi (Figura 3). NOTA: Preserva l'integrità della gelatina di Wharton tagliando il meno WJ possibile.</li>
		<li>Inizia da un angolo della fessura di taglio. Sollevare l'angolo dell'epitelio amniotico con pinze dentate e continuare a tagliare orizzontalmente un po' di più con le forbici corneali lungo la superficie interna dell'epitelio.<ol><li>Separare la gelatina di Wharton e l'epitelio amniotico con le pinze ed espandere gradualmente l'intero cerchio di un'estremità della colite ulcerosa. Staccare lo strato epiteliale nel senso della lunghezza (Figura 3). NOTA: La gelatina di Wharton è un tessuto connettivo mucoso racchiuso dall'epitelio amniotico denso8. L'intera operazione dovrebbe essere regolare, ma le pinze per zanzare potrebbero essere utilizzate per la dissezione smussata se si incontrano difficoltà durante il peeling.</li>
		</ol></li>
		<li>Inserire entrambe le lame della pinza all'interno della vena, bloccare una parte di WJ e quindi capovolgerla per esporre l'epitelio della vena ombelicale (Figura 3).</li>
		<li>Staccare facilmente l'epitelio della vena, poiché la tensione interna crea una separazione tra l'epitelio della vena e il WJ perivascolare (Figura 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Sezionare la UC utilizzando il metodo convenzionale per il confronto20.<ol><li>Scegli un altro campione già tagliato di quasi lo stesso peso del cordone precedente e trasferiscilo in una nuova capsula di Petri.</li>
		<li>Tagliare longitudinalmente lungo la vena ombelicale con le forbici e allargare la UC per esporre i vasi e WJ.</li>
		<li>Rimuovere la vena ombelicale e due arterie e rimuovere il WJ dallo strato endoteliale con forbici e bisturi.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Isolamento e cultura delle UC-MSC
<ol><li>Metti il WJ raccolto in una piastra di Petri da 90 mm pre-etichettata e taglialo in pezzi di 1-3 mm con forbici e pinze.</li>
	<li>Capovolgere la capsula con il tappo sul fondo e metterla in un'incubatrice al 5% di CO2 a 37 °C per 30 minuti per rafforzare l'attaccamento tra i pezzi e la superficie in plastica.</li>
	<li>Capovolgere il piatto e aggiungere delicatamente una quantità appropriata di terreno di coltura MSC umano per un'ulteriore coltura. NOTA: Utilizzare la velocità più bassa per assicurarsi che i pezzi siano ancora attaccati.</li>
	<li>Cambiare il terreno di coltura MSC umano ogni 3 giorni. Scambiare due terzi del terreno e osservare la comparsa di crescita di cellule fibrose ogni 2 giorni nei primi 7 giorni, cambiare l'intero terreno e osservarlo su base giornaliera in seguito. NOTA: Evitare di spostare la capsula di Petri per i primi 7 giorni. La distinta crescita di cellule simili a fibroblasti è stata osservata in circa 4 giorni.</li>
	<li>La sottocultura fino alla confluenza raggiunge l'80%. NOTA: Questo passaggio richiede 7-10 giorni.<ol><li>Preriscaldare il terreno di coltura di PBS, tripsina allo 0,25% e MSC umano privo di xeno a 37 °C in un bagno d'acqua.</li>
		<li>Sciacquare con PBS dopo aver aspirato il surnatante con le pipette e staccare le cellule con tripsina preriscaldata allo 0,25% fino a quando le cellule possono essere rimosse picchiettando la capsula di Petri.</li>
		<li>Inattivare la tripsina mescolando il terreno di coltura MSC preriscaldato in un rapporto di 4:1, raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. NOTA: Queste celle sono considerate passaggio 0 (P0).</li>
		<li>Scartare il surnatante con una pipetta, risospendere le cellule nel terreno di coltura di MSC umano e inoculare in nuove piastre di Petri a una densità di semina di 1x104 cellule/cm2 per la propagazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzando un emocitometro, contare il numero totale di cellule dei due metodi dopo l'amplificazione al primo, secondo e terzo passaggio. Determinare la morfologia cellulare al microscopio nel primo, terzo e quinto passaggio. NOTA: La morfologia di queste cellule dovrebbe essere simile alle cellule P0.</li>
	<li>Utilizzare le cellule al quinto passaggio per la citometria a flusso e altri esperimenti.</li>
</ol>4. Espressione di marcatori di superficie cellulare mediante citometria a flusso
<ol><li>Staccare 5 celle di passaggio (P5) con tripsina allo 0,25%, lavare le cellule con un tampone di colorazione cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere i pellet con il tampone di colorazione delle celle a 100 μl ciascuno.</li>
	<li>Etichettare ogni provetta e aggiungere le quantità appropriate di anticorpi, che sono stati coniugati con alloficocianina (APC), isotiocianato di fluoresceina (FITC) o ficoeritrina (PE): CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE seguendo le istruzioni del produttore21. Incubare per 15-20 minuti al buio a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugare le cellule colorate a 300 x g per 5 minuti a 4 °C, aspirare il surnatante con una pipetta e lavare una volta con un tampone di colorazione cellulare.</li>
	<li>Ripetere la centrifugazione e la risospensione delle cellule con 300 μl del tampone di colorazione cellulare.</li>
	<li>Far passare le cellule attraverso il citometro a flusso e analizzare le cellule colorate con anticorpi secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>5. Determinazione della curva di crescita cellulare con il metodo del conteggio cellulare
<ol><li>Preparare una sospensione unicellulare di cellule P5 utilizzando due metodi, diluendole in un terreno di coltura di MSC umano.</li>
	<li>Semina 8.000 cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti, con un totale di 21 pozzetti di ciascun metodo da seminare. NOTA: Mescolare delicatamente le cellule soffiando e aspirando con pipette prima della semina.</li>
	<li>Raccogliere le cellule da tre pozzetti dopo 24 ore di semina. Eseguire il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro per calcolare il valore medio. NOTA: Agitare la piastra prima del conteggio delle cellule. La durata dell'agitazione può essere prolungata per prevenire la formazione di aggregati cellulari.</li>
	<li>Ripetere il conteggio delle celle ogni 24 ore per una durata totale di 7 giorni. Tracciare una curva di crescita utilizzando il tempo (d) sull'asse X e la conta delle cellule (x104/mL) sull'asse Y.</li>
</ol>

Dissezione e isolamento di WJ-MSC dal cordone ombelicale umano

<ol>
	<li>Abbaszadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+potential+of+Wharton's+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells:+A+new+horizon+of+stem+cell+therapy.">Regenerative potential of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: A new horizon of stem cell therapy.</a> J Cell Physiol. 235 (12), 9230-9240 (2020).</li><li>Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+clinical+applications+of+Wharton's+jelly-derived+mesenchymal+stromal+cells.">Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells.</a> Curr Res Transl Med. 68 (1), 5-16 (2020).</li><li>Kim, D. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wharton's+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells:+Phenotypic+characterization+and+optimizing+their+therapeutic+potential+for+clinical+applications.">Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: Phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications.</a> Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).</li><li>Drobiova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wharton's+jelly+mesenchymal+stem+cells:+A+concise+review+of+their+secretome+and+prospective+clinical+applications.">Wharton's jelly mesenchymal stem cells: A concise review of their secretome and prospective clinical applications.</a> Front Cell Dev Biol. 11, 1211217 (2023).</li><li>Joerger-Messerli, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+from+Wharton's+jelly+and+amniotic+fluid.">Mesenchymal stem cells from Wharton's jelly and amniotic fluid.</a> Best Pract Res Cl Ob. 31, 30-44 (2016).</li><li>Pera, M., Subramanian, A., Fong, C. -. 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H., Kamal, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wharton's+jelly+MSCs:+Potential+weapon+to+sharpen+for+our+battle+against+DM.">Wharton's jelly MSCs: Potential weapon to sharpen for our battle against DM.</a> Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).</li><li>Saleh, M., Fotook Kiaei, S. Z., Kavianpour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Wharton+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells+in+patients+with+pulmonary+fibrosis.">Application of Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells in patients with pulmonary fibrosis.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 71 (2022).</li><li>Varaa, N., Azandeh, S., Khodabandeh, Z., Gharravi, A. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton's+jelly.">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> Biomed Res Int. 2013, 428726 (2013).</li><li>Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+animal+serum+free+expansion+of+human+umbilical+cord+derived+mesenchymal+stromal+cells+(MSCs)+and+endothelial+colony+forming+progenitor+cells+(CFCs).">Isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (CFCs).</a> J Vis Exp. 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Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

Le MSC rappresentano un'area di ricerca dinamica con profonde implicazioni per la medicina rigenerativa22. Le loro proprietà uniche li rendono un punto focale per l'indagine scientifica e hanno il potenziale per rivoluzionare il trattamento di un'ampia gamma di malattie e lesioni7. Le WJ-MSC sono un sottogruppo distinto di MSC, che possono essere ottenute dal tessuto connettivo gelatinoso all'interno della CU situato tra l'epitelio intervascolare e amniotico<sup class="xre...

Dal primo isolamento di cellule staminali mesenchimali (MSC) dalla gelatina di Wharton (WJ) nel 1991, queste cellule staminali multipotenti hanno guadagnato un'attenzione significativa da parte dei ricercatori grazie alle loro proprietà rigenerativee alla capacità di differenziazione multilineage. Le MSC possono essere isolate da varie fonti, tra cui il midollo osseo, il sangue periferico, la polpa dentale, il tessuto adiposo, il feto (aborto umano) e i tessuti correlati alla nascita2. Il cordone ombelicale (UC) è emerso come un serbatoio promettente grazie alla sua natura non invasiva, all'abbondante resa cellulare e alla capacità di differenziazione, mostrando un alto tasso di proliferazione, potenziale di differenziazione e proprietà di modulazione immunitaria3. Le MSC fetali mostrano una forte staminalità e proprietà immunitarie, che le rendono l'obiettivo principale degli studi clinici e della ricerca di base condotti negli ultimi due decenni 2,4,5. Le MSC derivate dalla CU hanno un potenziale terapeutico superiore rispetto ad altre fonti di MSC, come il midollo osseo o il tessuto adiposo 6,7.
La CU è composta da epitelio amniotico, tre vasi (due arterie e una vena) e la sostanza gelatinosa nota come WJ3. Curiosamente, la CU costituisce una semplice vascolarizzazione, costituita solo dall'endotelio e dal mesotelio, ma non dalla tunica avventizia; il WJ non contiene linfa o nervi8. L'UC presenta una struttura unica ideale per la separazione segmentale. Le UC-MSC si trovano principalmente nel WJ. Le MSC potrebbero essere isolate da diversi compartimenti del WJ, tra cui l'amnio, il subamnio (l'amnio e il subamnio designati anche come regione di rivestimento del cordone) e l'area perivascolare del WJ8. Ogni regione del WJ ha la propria struttura, caratteristiche immunoistochimiche e funzione 3,6.
Le MSC isolate dal WJ della UC sono ampiamente considerate aventi un'utilità clinica superiore rispetto a quelle di altre regioni3. Le WJ-MSC sono state ampiamente studiate in contesti preclinici e clinici per il trattamento di varie malattie grazie al loro potenziale di differenziazione multilinea, alle proprietà immunomodulatorie, agli effetti paracrini, agli effetti antinfiammatori e alle proprietà immuno-privilegiate 2,3. Le WJ-MSC hanno dimostrato di essere promettenti nel trattamento di una serie di malattie, tra cui la malattia del trapianto contro l'ospite (GvHD), il rigetto del trapianto, il morbo di Crohn, le malattie autoimmuni e le malattie cardiovascolari 9,10,11,12,13,14. Poiché la domanda clinica di WJ-MSC continua ad aumentare, la carenza di offerta di cordoni ombelicali è attualmente un ostacolo alla loro diffusione delle applicazioni.
La resa delle WJ-MSC dipende dal metodo utilizzato per l'estrazione cellulare15. Mentre le WJ-MSC possono essere isolate attraverso la coltura di espianti o la digestione enzimatica, quest'ultimo metodo ha un tempo di propagazione più lungo che può aumentare il rischio di danno cellulare e diminuire la vitalità cellulare16. Tuttavia, numerosi studi hanno dimostrato che il metodo della coltura di espiantazione aumenta la resa e la vitalità delle cellule e che anche i fattori paracrini rilasciati dai tessuti di espiantazione aiutano a promuovere la proliferazione cellulare17,18.
Questo studio ha applicato un approccio di dissezione unico per ottenere WJ interi, producendo MSC con maggiore capacità proliferativa, vitalità e quantità, riducendo al minimo i danni al WJ. Questo metodo innovativo offre una strategia semplificata per l'isolamento delle WJ-MSC, rispondendo alle esigenze critiche nelle applicazioni MSC.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD44 Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>338806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD73 (Ecto-5&#39;-nucleotidase) Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>344006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>400122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>HIRAYAMA</td>
			<td>HVE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Cell Counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>FL-CD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAMBANKER Cryopreservation Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>302-14681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Buffer</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Machine</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean Bench</td>
			<td>Shanghai ZhiCheng</td>
			<td>C1112B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERAcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro- thermostatic Blast Oven</td>
			<td>Shanghai JingHong</td>
			<td>DHG-9423A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD105 Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>323204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>400110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Superior Marienfeld</td>
			<td>640410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10&#215;)&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>421002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Biological Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Vert. A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Storage Tank</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY50935-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline (NS)</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>393112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD19 Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>392506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD34 Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>343606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>368510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human HLA-DR Antibody&#160;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>307606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>400114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG2a, &#954; Isotype Ctrl (FC) Antibody</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>400214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Electronic Balance</td>
			<td>Satorius</td>
			<td>PRACTUM313-1CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snowflake Ice Machine</td>
			<td>ZIEGRA</td>
			<td>ZBE 30-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steriled 50 mL plastic tube</td>
			<td>Greniner</td>
			<td>227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic Water Bath</td>
			<td>Shanghai YiHeng</td>
			<td>HWS12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 1:250</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraGRO-Advanced</td>
			<td>Helios&#160;</td>
			<td>HPCFDCGL50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure and Pure Water Purification System</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Milli-Q Reference</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeno-Free Human MSC Culture Medium</td>
			<td>FUKOKU&#160;</td>
			<td>T2011301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells with high yields and low damage

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono una popolazione di cellule multipotenti con notevoli proprietà rigenerative e immunomodulatorie. La gelatina di Wharton (WJ) dal cordone ombelicale (UC) ha guadagnato un crescente interesse in campo biomedico come un'eccezionale fonte di MSC. Tuttavia, sono sorte sfide come l'offerta limitata e la mancanza di standardizzazione nei metodi esistenti. Questo articolo presenta un nuovo metodo per aumentare la resa di MSC sezionando WJ intatto dal cordone ombelicale. Il metodo impiega la dissezione smussata per rimuovere lo strato epiteliale, mantenendo l'integrità dell'intero WJ e determinando un aumento della quantità e della vitalità delle MSC raccolte. Questo approccio riduce significativamente gli sprechi di WJ rispetto ai metodi convenzionali di dissezione tagliente. Per garantire la purezza delle WJ-MSC e ridurre al minimo l'influenza cellulare esterna, è stata condotta una procedura che utilizza la tensione interna per staccare l'endotelio dopo aver capovolto la colite ulcerosa. Inoltre, la capsula di Petri è stata capovolta per un breve periodo durante la coltura di espiantazione per migliorare l'attaccamento e la crescita cellulare. L'analisi comparativa ha dimostrato la superiorità del metodo proposto, mostrando una resa più elevata di WJ e WJ-MSC con una migliore vitalità rispetto ai metodi tradizionali. La morfologia e il modello di espressione simili dei marcatori di superficie cellulare in entrambi i metodi confermano la loro caratterizzazione e purezza per varie applicazioni. Questo metodo fornisce un approccio ad alto rendimento e ad alta vitalità per l'isolamento di WJ-MSC, dimostrando un grande potenziale per l'applicazione clinica delle MSC.

Since the first isolation of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) from Wharton&#39;s jelly (WJ) in 1991, these multipotent stem cells have gained significant attention from researchers due to their regenerative properties and multilineage differentiation capacity1. MSCs can be isolated from various sources, including bone marrow, peripheral blood, dental pulp, adipose tissue, fetal (human abortion), and birth-related tissues2. The umbilical cord (UC) has emerged as a promising reservoir due to its non-invasive nature, abundant cell yield and differentiation capacity, exhibiting a high rate of proliferation, differentiation potential, and immune modulation properties3. Fetal MSCs exhibit strong stemness and immune properties, making them the primary focus of clinical trials and basic research conducted over the past two decades2,4,5. UC-derived MSCs have superior therapeutic potential compared to other sources of MSC, such as bone marrow or adipose tissue6,7.
The UC is composed of amniotic epithelium, three vessels (two arteries and one vein), and the gelatinous substance known as WJ3. Intriguingly, the UC constitutes a simple vasculature, consisting only of the endothelium and mesothelium, but not the tunica adventitia; the WJ does not contain lymph or nerves8. The UC presents a unique structure ideal for segmental separation. UC-MSCs are primarily located in the WJ. MSCs could be isolated from different compartments of the WJ, including amnion, subamnion (the amnion and subamnion also designated as cord lining region), and the perivascular area of the WJ8. Each region of the WJ has its own structure, immunohistochemical characteristics, and function3,6.
MSCs isolated from the WJ of the UC are widely regarded as having superior clinical utility compared to those from other regions3. WJ-MSCs have been extensively studied in preclinical and clinical settings for the treatment of various diseases due to their multi-line differentiation potential, immunomodulatory properties, paracrine effects, anti-inflammatory effects, and immune-privileged properties2,3. WJ-MSCs have been proven to hold promise in treating a range of diseases, including graft-versus-host disease (GvHD), graft rejection, Crohn&#39;s disease, autoimmune diseases, and cardiovascular diseases9,10,11,12,13,14. As clinical demand for WJ-MSCs continues to increase, the shortage supply of umbilical cords is currently an impediment to their widespread applications.
The yield of WJ-MSCs is dependent on the method used for cell extraction15. While WJ-MSCs can be isolated through explant culture or enzyme digestion, the latter method has a longer propagation time that may increase the risk of cell damage and decrease cell viability16. However, numerous studies have shown that the explant culture method increases cell yields and viability, and that paracrine factors released from explant tissues also help promote cell proliferation17,18.
This study applied a unique dissection approach to obtain whole WJ, yielding MSCs with enhanced proliferative capacity, viability, and quantity, while minimizing damage to the WJ. This innovative method offers a streamlined strategy for isolating WJ-MSCs, addressing critical needs in MSC applications.

Autore in primo piano: Progressi negli organoidi vascolarizzati derivati da cellule staminali e isolamento ottimizzato della gelatina di Wharton per una maggiore produzione di MSC

Isolamento di cellule staminali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale con rese elevate e basso danno

Our research used human stem cells to create various organoids. They can mimic human organs. We developed unique techniques for mesoderm and endoderm co-differentiation.They enable these organoids with rich blood networks. These organoids will promote organ development, regeneration medicine, disease model, drug screening, and personalized medicine, such as organoid transplantation. Our protocol addresses a research gap in optimizing the isolation of intact Wharton's jelly from the umbilical cord, while preserving its perivascular and subamniotic components.This method aims to enhance the yield, viability, and proliferative ability of mesenchymal stem cells, offering a cost-effective approach to augment MSC production. The advantage of our protocol lies in its ability to obtain a higher Wharton's jelly's yield and harvest more MSCs with better proliferative ability compared to traditional methods.

Le procedure per la raccolta e la coltura delle UC-MSC, nonché la loro successiva analisi, sono riassunte nella Figura 1. L'UC è stata accuratamente sezionata in diverse sezioni utilizzando il metodo unico; lo schema di funzionamento specifico delle principali procedure è illustrato in Figura 2. La crescita delle cellule dalle colture di espianti è stata monitorata e registrata di routine. Le cellule aderenti a forma di fuso sono state osservate circa 4 gior...

Questo studio presenta un'esclusiva procedura di dissezione smussata per preservare l'integrità della gelatina di Wharton (WJ), con conseguente WJ meno danneggiata e una maggiore quantità e vitalità delle cellule staminali mesenchimali (MSC) raccolte. Il metodo dimostra una resa e una capacità proliferativa superiori rispetto ai metodi convenzionali di dissezione tagliente.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells with remarkable regenerative and immunomodulatory properties. Wharton's jelly (WJ) ...

isolation-umbilical-cord-derived-mesenchymal-stem-cells-with-high

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells with High Yields and Low Damage

795 Views.  Beijing University of Chinese Medicine. La nostra ricerca ha utilizzato cellule staminali umane per creare vari organoidi. Possono imitare gli organi umani. Abbiamo sviluppato tecniche uniche per la co-differenziazione del mesoderma e dell'endoderma.Consentono a questi organoidi di avere ricche reti di sangue. Questi organoidi promuoveranno lo sviluppo degli organi, la medicina della rigenerazione, il modello di malattia, lo screening dei farmaci e la medicina personalizzata, come il trapian...

Video: Autore in primo piano: Progressi negli organoidi vascolarizzati derivati da cellule staminali e isolamento ottimizzato della gelatina di Wharton per una maggiore produzione di MSC