המחברים מבקשים להודות לבוב פרימן לאימונים וקירשנר המעבדה לשימוש במתקן הצפרדע, וחברי מעבדת Vactor אן על תמיכה. אנו מודים לניקון מרכז ההדמיה בבית הספר לרפואה ברווארד לקבלת סיוע במיקרוסקופ אור לתמונות באיור 1. עבודה זו מומנה על ידי הבא: NRSA NIH המלגה ומלגת K99-NIH לאל, מדע בסיסי שותפות מימון <a href="https://bsp.med.harvard.edu/" target="_blank">(https://bsp.med.harvard.edu/)</a> לAEF, וNIH RO1 NS035909 לDVV

הערה: אנו מתארים את השלבים בשני הסעיפים הראשונים רק בקצרה, כמו פרוטוקולים מצוינים עם מידע מפורט שפורסמו במקומות אחרים המתמקדים באופן ספציפי יותר בשלבים הבאים (לדוגמה 8-12). בנוסף, הפרוטוקול הכללי של עבודה עם תאי עצב בעמוד שדרת Xenopus בתרבות תא החייה כבר פורסם בעבר במאמר שיטות מפורט 8. אנו ממליצים בחום לבדוק את המאמר כהשלמה לסרטון הזה, למרות שכאן אין לנו לספק מספיק מידע כדי לבצע בהצלחה ולפתור את הנתיחה העצבית צינור ופרוטוקול ציפוי בשלב 3. 1. הפריה במבחנה של Xenopus ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג ביצים מצפרדעים נשיות שהוזרקו כוריוני 12-18 שעות גונדוטרופין (400 יחידות / צפרדע) לפני איסוף הביצים. איסוף ביצים בפתרון של 1X מארק השתנה רינגר (MMR) (0.1 מ &#39;NaCl, 2.0 mM KCl, 1.0 mM 4 MgSO, 2.0 mM CaCl 2, HEPES 5.0 מ&quot;מ, pH 7.4 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפרות ביציות במבחנה עם אשכים טחונים, כפי שתואר לעיל 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי לפחות 20 דקות, הסר את מעייל ריבת עובר על ידי עוברים דוגרים בציסטאין 2% ב1X MMR (הובא ל-pH 7.8 עם NaOH) במשך 3-5 דקות. לשטוף עם 0.1x MMR (או 0.1x MBS (המתכון השתנה של בארת&#39; המלוח, 1X: 88 המ&quot;מ NaCl, 1 המ&quot;מ KCl, 0.7 המ&quot;מ CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 2.5 המ&quot;מ 3 NaHCO, 5 HEPES מ&quot;מ, pH 7.8)) 3 -5 פעמים, ולשמור על עוברים בטמפרטורת חדר עד לזריקות, או אם ירצו, עוברי מקום ב14-18 מעלות צלזיוס להאט פיתוח. </li></ol> 2. Microinjection של רנ&quot;א הערה: בעוד שאנו מנצלים הזרקת RNA כאן, טכניקות אלה אינן מוגבלות לRNA, ו-DNA, חלבונים, חומצות גרעין או שונות למניפולציה גנטית יכול לשמש גם וכבר תארו בעבר 12. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הניסוי, RNAs עבור תיוג מבני cytoskeletal או אחרים arדואר משועתק מתבניות DNA לינארית באמצעות mMessage mMachine הערכה (Ambion). mRNAs דורש &#39;כובע ו3&#39; 5 זנב polyadenylation לקדם תרגום ותמנע פגיעה בעוברים. pCS2 + הוא וקטור נפוץ בשימוש למטרה זו, וערכת השעתוק כוללת אנלוגית כובע במהלך תגובת הסינתזה. אנחנו מחדש להשעות mRNA תומלל בnuclease ללא DDH 2 0, בריכוז מניות בין 500 ל -2000 ng / μl, ואחרי האחסון מהיר ב-80 ° C. לפני הזריקה, לדלל RNA בDDH 2 0 לריכוז המתאים להזרקה. כפי שהזריק נפח קטן בלבד לעוברים, resuspending במאגר אינו הכרחי. ריכוז הזריקה הסופית שלנו הוא בדרך כלל 50-200 pg / nl, תלוי במבנה, ואנחנו בדרך כלל תהיינה להזריק עד 4 nl לעובר, אם כי מעבדות רבות באופן מסורתי להזריק עד 10 nl, אשר הוא כ 1% מהנפח הכולל של עובר. RNA יכול להיות רעיל במינונים גבוהים, והמנה כל סוגי עוברlly נע בין 10 pg לng 1, אם כי עד 5 ng יכול להיות נסבל תלוי בגן ובטהרה בפרט. עם זאת, ללוקליזציה חלבון הדמיה, הרמה הנמוכה ביותר האפשרית צריכה להיות מוזרקת למנוע לכלוכים על ביטוי. רנ&quot;א לEB1-GFP בפרוטוקול זה משמש בסכום סופי של 250 עמ &#39;לעובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מחטי הזרקה על ידי משייכת נימים עם מחט 9 חולץ, לקוטר קצה ~ 0.2 מיקרומטר. עם P-87 חולץ סאטר, אנו משתמשים בהגדרות הבאות: החום 644, משיכה 125, מהירות 70, זמן 250, אבל פרמטרים אלה משתנים בהתאם למכונה ויש סדרו לאחר שינוי הנימה (אנו משתמשים כיום 2.5 מ&quot;מ נימת תיבה מרובעת שהיא 2.5 מ&quot;מ רחב). תחת מיקרוסקופ, לשבור מחט קצה עם מלקחיים בזווית כדי ליצור צורת נוצה, כמו. ישנן שיטות אחרות לשבירה ומילוי מחטי הזרקה (לדוגמה 11,12), אבל אנחנו ממלאים את המחט עם רנ&quot;א ידי הצבת ירידה קטנה (0.5 - μl 1) לקצה האחורי שלמחט. לmicroinjecting לעוברים, יש מספר מערכות הזרקה זמינות מסחרי, שתיים מן שכיח ביותר להיות פיק ההזרקה (מערכות רפואיות), וNanoject (דראמונד המדעי) (ראה עמוד 11 למידע נוסף). אנו משתמשים במערכות הרפואית PLI-100 Pico-Injector, שמשתמש בגז דחוס לתקופה מוגדרת של זמן דיגיטלי כדי לספק כרכי nanoliter עקביים. נפח הזרקה חייב להיות מכויל לכל micropipette החדש באמצעות מיקרומטר במה, וזמן הזרקה צריך להיות מותאם להשגת כמות רצויה של רנ&quot;א המוזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מופרה עובר ב1 - לשלב 4-תא לתוך צלחת פלסטיק המכילה Ficoll 5% בMMR 0.1x. מחזיק את העובר במקום עם מלקחיים, או הצבה בפלטפורמה מחזיקה (רשת פלסטיק, עם רשת ~ 1 מ&quot;מ, דבקה בתחתית הצלחת בפלסטלינה או שעוות שיניים), להזריק לעצמה רצויה לסטומרים בעלי חיים (ראה שלב 2.1 לפרטים בדבר היקפי הזרקה). להפיץ בכמה locations ברחבי עובר, זריקה אחת לפחות לכל אחד מבעלי חי לסטומרים, לקבל התפלגות אחידה יותר (לדוגמה, לעובר בשלב 4-תא, אנחנו בדרך כלל להזריק 1-2 פעמים בכל blastomere, ואילו בשלב 2-תא עובר, אנחנו מזריקים 2-4 פעמים בכל blastomere). יתרון של מתנה עד שלב התא 2-4 הוא שאתה להבטיח את העובר החל לדבוק באופן נורמלי. עם זאת, אם הזמן הוא מהות, אתה יכול להתחיל בשלב 1-התא, עם הבדל קטן בתוצאה הסופית שאינן זקוקים יותר לעוברים להיות מוזרקים. עוברים בשלב בוגרים יותר יכולים לשמש גם כן, וזה שימושי במיוחד אם סוגי תאים ספציפיים ממוקדים להזרקה, אבל כמו שאנחנו מעדיפים בדרך כלל ביטוי רחב יותר, אנחנו מזריקים בעוברים צעירים כדי להפחית את הצורך בזריקות יותר רבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים הזריקו לצלחת פלסטיק המכילה MMR 0.1x ולאפשר להם להתפתח עד שלב 20-23 13. דגירת עוברים ב14-22 ° C בהתאם spe הרצויעורך של פיתוח. (לביתור צינורות עצביים למחרת, השתמש ~ 22 ° C. עבור היום אחרי, השתמש ~ 14 ° C.) </li></ol> 3. Dissection צינור עצבי וציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קודם לביצוע הניתוחים, להכין את מנות תרבות 14. ראשית, coverslips מעייל עם מספיק פתרון של 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פולי ליזין ב PBS לברכה על פני coverslip, של או מאטק או מנות תרבות Lab-Tek, ודגירה במשך שעה אחת (לחלופין, אפשר להשתמש בזכוכית יושבת coverslips רופף בצלחת פטרי, על מיקום מאוחר יותר בשקופיות זכוכית עבור הדמיה וimmunocytochemistry). לשאוב ולשטוף עם עודף של PBS 3 פעמים, ולתת להתייבש. אז מנות מעייל עם 10 מיקרוגרם / המ&quot;ל laminin ב PBS (אנחנו בדרך כלל להשתמש ב500 μl לcoverslip, מספיק לברכה שמעל פני השטח) למשך שעה ב37 מעלות. לשאוב פתרון laminin ולשטוף 3 פעמים עם עודף של PBS, נזהר שלא לתת למשטחים laminin מצופים נחשפו לממשק האוויר. Replacהדואר PBS עם תרבות אמצעי תקשורת (צלצול של 50%, L-15 תקשורת 49%, סרום שור עוברי 1%, בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין וgentamycin, pH 7.4 ומסנן מעוקר). (מדיה רינגר, 115 המ&quot;מ NaCl, KCl 2.5 מ&quot;מ, 2 המ&quot;מ CaCl 2, 10 mM pH Hepes 7.4, 0.5 המ&quot;מ EDTA). בעוד הפרוטוקול שלנו משתמש באמצעי תקשורת זה, יש לציין כי מדובר במועשר תקשורת משותפת לתרבויות גנגליון רשתית מבוגרות Xenopus, שבו תאי העצב הפחיתו אנרגיה שמורה. תרבויות בעמוד שדרה צעירות לשרוד ולגדול ליותר מ 24 שעות בתקשורת של האצבעות טהורות ללא גורמי צמיחה נוספים, וזה אכן אחד היתרונות של שימוש במערכת זו. אופציונלי: תוספת NT3 וBDNF (לריכוזים סופיים של כל 25 ng / μl) לתקשורת התרבות להגדיל תולדת האקסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלל השונות בביטוי של mRNA המוזרק, עוברים עשויים להפגין פסיפס של קרינה. קודם לביצוע נתיחות, עובר מסך לנוכחות של קרינה, כדי לזהות העוברים האלה שEXPציידת חלבון היתוך הניאון בצינור העצבי. הנח עוברי ניאון בשלב 20-23 לתוך קערת פלסטיק agarose מצופה מלאה בתקשורת של שטיינברג (58 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 0.44 mM Ca (NO 3) 2, 1.3 המ&quot;מ 4 MgSO, 4.6 mM טריס, pH ל -7.8 אז autoclaved) 5. להכנת המנה agarose המצופה, מעייל התחתון של צלחת פלסטיק מומס עם 1% agarose ב0.1x MMR ובואו להתקשות. זה מספק משטח רך ולכן הניזק שאינו מתרחש למלקחיים העדינים ומחטי טונגסטן המשמשים במהלך שלבי נתיחה שלאחר מכן. הנתיחה של עוברים מעבר שלב 23 אפשרית, אבל זה מאתגר יותר כרקמות לדבוק באופן הדוק יותר זה לזה ולכן דורשות טיפול ארוך יותר עם collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת ביתור, להסיר את קרום vitelline עם מלקחיים עדינים, ואז לבודד את החלק הגבה כולו של העובר, על ידי ביצוע סדרה של חתכים. כשאתה יושב ומלקחיים להחזיק את העובר במקום, השתמש שני לעשות חתך עלצד של העובר על מנת לחשוף את הפנים החלולים. לאחר מכן, השתמש בשני המלקחיים לצבוט לאורך הרקמה בין שתי מחציות גב וגחון של העובר, כך גזירת העובר בחצי לבודד את החלק הגבה מכיל את הצינור העצבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח explant הגבה בצינור אפנדורף עם 2 מ&quot;ג / המ&quot;ל collagenase בתקשורת של טיינברג לדקות 15-20 במסובב, כדי לשחרר את הרקמות, ולאחר מכן explant הגבה פיפטה לתוך צלחת פלסטיק agarose מצופה עם הפתרון של טרי שטיינברג. לחלופין, explant ניתן להציב בצלחת הפטר שמכילה תמיסת collagenase במשך 15 דקות, שבו כל הנתיחה ואז אפשר תהיה פועל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג מלקחיים, בעדינות לנתח את הצינור העצבי מהאפידרמיס הגבה וnotochord הגחון. חלק את קצה המלקחיים בין האפידרמיס והרקמה שמתחתיו ומושך באיטיות חזרה לאפידרמיס, וחושף את הצינור העצבי מתחת. לאחר מכן, השתמש 1 מלקחיים להחזיק את הרקמות ואחרות כדי להחליק את הקצה ביןצינור עצבי וnotochord. לבסוף, להשתמש במלקחיים כדי להסיר את somites בכל צד של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הצינור העצבי למנת agarose מצופה מלאה בתרבית, כמתואר בשלב 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי האוסף של מספר צינורות עצביים, לחתוך אותם לחתיכות רבות (כ 20, אם כל הצינור מבודד) באמצעות מחטי טונגסטן חדד או מלקחיים, ולאחר מכן את החלקים בצלחת מנות התרבות מלאה במדיום (מוכן בשלב 3.1), והוא מתפשט את explants באופן שווה בשורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ציפוי, אל תזוז את הכלים כי זה יפריע לתאים הקשורים. דגירת explants הצינור העצבי מצופה סביב 20-22 מעלות צלזיוס אנו נוהגים להשאיר את המנה של תאים על הספסל בטמפרטורת חדר למשך הלילה. אחד היתרונות של Xenopus laevis הנוירונים הוא שחממה מיוחדת לתרבית תאים המווסתת את רמות 2 או טמפרטורת CO אין צורך. Neurites קונוסים צמיחה יכולים להיות שנצפו וצולמו בטמפרטורת החדר 12-24 שעות לאחר ציפוי, למרות תולדה יכולה להיות מואצת עם התוספת של גורמי גדילה. באופן כללי, ביטוי של RNA או מוצר פלסמיד יגרום ביטוי משתנה בין תאים, ובכך ייתכן שיש מגוון של רמות ביטוי קרינה בין קונוסים צמיחה. אנו צפינו בביטוי RNA של חלבוני ניאון יישמרו גם 48 שעות לאחר ציפוי, למרות שזה תלוי במבנה המסוים. </li></ol> 4. נציג תוצאות לאחר ביצוע הפרוטוקול, אשר סכם באיור 1A, explants הבריא, נתח-כהלכה ותרבית עצבי ישלח את האקסונים או neurites רבים בכל כיוון על laminin / מצע פולי ליזין, שמוצג בתרשים 1B. את הקונוסים הצמיחה בקצוות של אקסונים ניתן הדמיה על ידי או אופטיקה DIC, כפי שניתן לראות בתרשים 1C, לדינמיקת תנועתיות כוללת תמונה, או מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוציה גבוהה לבחון את localization של חלבוני cytoskeletal מתויגים-fluorescently, למשל, EB1-GFP מוצג באיור 1D. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4232/4232fig1.jpg" /> איור 1. סיכום של פרוטוקול ניסוי, ותוצאה צפויה. א) פרוטוקול זרימת תרשים. לראות את הסרט לפרטים בדבר נתיחה ביום 3. הצינור העצבי כולה צריך לחתוך לכ 20 חתיכות שווות בהגודל ומתפזר באופן שווה בשורות על coverslip. בקריקטורה זו, מספריים מתוארים לייצג חיתוך הרקמות עם מלקחיים עדינים. CG גונדוטרופין כוריוני B) תמונת דסק&quot;ש של אקסונים או neurites צומחים מתוך explant (explant בפינה שמאלית עליונה). ג) תמונה גבוהה יותר הגדלה של חרוט צמיחה בקצה האקסון הולך וגדל. ד) תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של EB1-GFP בחרוט צמיחה. 10 מיקרומטר סרגל קנה מידה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4232/4232fig1large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

<ol>
	<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li><li>Buck, K. B., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+turning+induced+by+direct+local+modification+of+microtubule+dynamics.">Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics.</a> J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).</li><li>Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. 42, 913-926 (2004).</li><li>Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+adhesion+and+signaling+dynamics+in+Xenopus+laevis+growth+cones.">Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones.</a> Dev. Neurobiol. , (2011).</li><li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation.">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).</li><li>Tanaka, E., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+growth+cone+turning+at+substrate+boundaries.">The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries.</a> J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).</li><li>Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+dynamics+in+growth+cone+motility+and+axonal+growth.">The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth.</a> J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).</li><li>Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+Xenopus+spinal+neurons+in+live+cell+culture.">Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture.</a> Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , (2010).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+Eggs+from+Xenopus+laevis+Females.">Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females.</a> J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).</li><li>Lavery, D. L., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+and+loss-of-function+strategies+in+Xenopus.">Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Guirland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cAMP+signaling+through+G-protein-coupled+receptors+mediates+growth+cone+attraction+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide.">Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).</li><li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture.">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).</li><li>Turney, S. G., Bridgman, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+stimulates+and+guides+axonal+outgrowth+via+growth+cone+myosin+II+activity.">Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).</li><li>Weinl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+turning+of+Xenopus+retinal+axons+induced+by+ephrin-A5.">On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5.</a> Development. 130, 1635-1643 (2003).</li><li>Knoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration.">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).</li><li>Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+expression+in+transgenic+Xenopus+embryos.">Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos.</a> Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

explants העצבי Xenopus laevis לשלוח neurites בצורה מאוד חזקה על ידי 24 שעות לאחר הציפוי בlaminin / מצע פולי ליזין אם תנאים מתאימים. עם המצע הזה, קונוסים צמיחה הם מאוד ניע ויכולים להשיג אורכי האקסון של עד 1 מ&quot;מ, המשתרעים לכל הכיוונים החיצוניים מexplant, למרות שאורכים אופייניים הם 100 מיק?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> גונדוטרופין כוריוני </td><td> Argent מעבדות כימיות </td><td> C-HCG-ON-10 </td></tr><tr><td> ציסטאין </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 52-90-4 </td></tr><tr><td> mMessage mMachine ערכה </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td></tr><tr><td> נימי Borosil מחטי 1.2 מ&quot;מ (OD) x 0.9 מ&quot;מ (ID) </td><td> Fhc </td><td> 30-31-0 </td></tr><tr><td> Ficoll </td><td> סיגמא </td><td> F2637 </td></tr><tr><td> דומון # 5 Biologie Inox מלקחיים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 9001-12-1 </td></tr><tr><td> מנות מאטק </td><td> מחצלת Tek תאגיד </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 21083-027 </td></tr><tr><td> פולי-L-lysine </td><td> סיגמא </td><td> P-1399 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> סיגמא </td><td> L2020 </td></tr><tr><td> NT3 </td><td> סיגמא </td><td> N1905 </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> סיגמא </td><td> B3795 </td></tr></tbody></table>

neural explant cultures from xenopus laevis

התהליך המורכב של הדרכת האקסון מונע בעיקר על ידי חרוט הצמיחה, שהוא המבנה הדינמי ניע בקצה האקסון הולך וגדל. במהלך תולדת האקסון, חרוט הצמיחה חייב לשלב מספר מקורות מידע קיו הדרכה לווסת cytoskeleton כדי להניע את הצמיחה קדימה קונוס ומדויק לנווט למצוא מטרות הספציפיות שלה 1. איך השילוב הזה מתרחש ברמת cytoskeletal עדיין מתפתחים, והבדיקה של חלבון cytoskeletal ודינמיקת מפעיל בתוך חרוט הצמיחה יכולה לאפשר הבהרת המנגנונים אלה. קונוסים צמיחת laevis Xenopus הם גדולים מספיק (10-30 מיקרונים בקוטר) לביצוע גבוה ההדמיה ברזולוצית חיה של דינמיקת cytoskeletal (למשל 2-4) והם קלים לבודד ולטפל בסביבת מעבדה בהשוואה לבעלי חוליות אחרים. הצפרדע היא מערכת מודל קלסית למחקרים התפתחותיים נוירוביולוגיה, ותובנה מוקדמות חשובות למיקרופון חרוט צמיחהדינמיקת rotubule תחילה נמצאה באמצעות מערכת זו 5-7. בשיטה 8 זה, ביצים נאספות ומופרה במבחנה, הזריקה רנ&quot;א קידוד חלבוני היתוך cytoskeletal מתויג fluorescently או מבנים אחרים כדי לתפעל ביטוי גנים, ולאחר מכן אפשרו לפתח לבמת הצינור העצבית. צינורות עצביים מבודדים על ידי נתיחה ואז מתורבתים, וקונוסים צמיחה בneurites נגמל הם צלמו. במאמר זה יתאר כיצד לבצע בשיטה זו, שמטרתה היא לקונוסים תרבות Xenopus laevis צמיחה לניתוח תמונה הבא ברזולוציה גבוהה. למרות שאנו מספקים את הדוגמא של חלבון היתוך עצה + EB1-GFP, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מספר של חלבונים על מנת להבהיר את התנהגותם בתוך חרוט הצמיחה.

Watch this Scientific Journal Video about Neural Explant Cultures from Xenopus laevis at JoVE.com

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

explants העצבי culturing מגזור<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; עוברים המבטאים חלבוני היתוך ניאון מאפשרים הדמיה של דינמיקת cytoskeletal קונוס צמיחה.

תרבויות Explant עצביות מן<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

neural-explant-cultures-from-xenopus-laevis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

12.4K Views.  Harvard Medical School. explants העצבי culturing מגזור Xenopus laevis עוברים המבטאים חלבוני היתוך ניאון מאפשרים הדמיה של דינמיקת cytoskeletal קונוס צמיחה.

Video: Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

גזירת תרבויות Oligodendrocyte מועשר Neuron Oligodendrocyte / Myelinating משותף תרבויות מן שלאחר הלידה רקמות Murine

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissection, תרבות וניתוח של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; רקמת רשתית עוברית

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

סימולטני טרום והקלטת אלקטרו פוסט סינפטי מ<em&gt; Xenopus</em&gt; עצבי שרירי Co-תרבויות

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב<em&gt; Laevis Xenopus</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

הקלטת פעילות עצבית הנגרמת טמפרטורה באמצעות ניטור שינויי סידן נורה חוש הריח של<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

תורם גזירת תרבויות Leptomeninges explant מן לאחר מות המוח האנושי

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls body functions and internal organ rhythms when animals are exposed to emotional challenges and changes in their living environments. In general experiments, signals from different organs, such as the brain and the heart, are recorded by independent recording systems that require multiple recording devices and different procedures for processing the data files. This study describes a new method that can simultaneously monitor electrical biosignals, including tens of local field potentials in multiple brain regions, electrocardiograms that represent the cardiac rhythm, electromyograms that represent awake/sleep-related muscle contraction, and breathing signals, in a freely moving rat. The recording configuration of this method is based on a conventional micro-drive array for cortical local field potential recordings in which tens of electrodes are accommodated, and the signals obtained from these electrodes are integrated into a single electrical board mounted on the animal's head. Here, this recording system was improved so that signals from the peripheral organs are also transferred to an electrical interface board. In a single surgery, electrodes are first separately implanted into the appropriate body parts and the target brain areas. The open ends of all of these electrodes are then soldered to individual channels of the electrical board above the animal's head so that all of the signals can be integrated into the single electrical board. Connecting this board to a recording device allows for the collection of all of the signals into a single device, which reduces experimental costs and simplifies data processing, because all data can be handled in the same data file. This technique will aid the understanding of the neurophysiological correlates of the associations between central and peripheral organs.

This study introduces a method for the simultaneous recording of local field potentials in the brain, electrocardiograms, electromyograms, and breathing signals of a freely moving rat. This technique, which reduces experimental costs and simplifies data analysis, will contribute to the understanding of the interactions between the brain and peripheral organs.

הקלטות סימולטני של פוטנציאל קורטיקלית שדה מקומי, רל, Electromyogram נושם קצב מעכברוש נעה בחופשיות

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...