אנו מודים דוד Theilmann (פסיפיק Agri-Food Research Centre, Summerland, קולומביה הבריטית) למתן AcMNPV baculovirus ו לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן קנדה עבור חדשנות (CFI), המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR), מייקל סמית הקרן לבריאות מחקר (MSFHR), ואת למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) .

חלק 1: הכנת ביציות Xenopus עבור microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חתיכה קטנה (כ 2 ס&quot;מ) של השחלה laevis Xenopus לשפופרת 50 מ&quot;ל חרוטי המכיל 20 מ&quot;ל של תמיסת collagenase (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל collagenase בסידן ללא מלח שונה של בארת: mm 0.82 88 mM NaCl, 1 mM KCl, MgSO 4, 10 Hepes מ&quot;מ, pH 7.5). Collagenase משמש כדי להסיר את התאים זקיק אשר מקיפים את ביציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על מצע שייקר ורוק אותו בעדינות (בכל סל&quot;ד 100) במשך שעה אחת. פעם זה משתנה עם המון שונים של collagenase. כך לאחר שעה אחת, לקחת דגימה קטנה של ביציות ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ לנתח. כראוי דה folliculated ביציות צריכים להיות מופרדים היטב זה מזה, ועל זה צריך להיות קל להכניס מחט זכוכית לתוך הביצית. אם ביציות אינם מספיק דה folliculated, הם עזבו את הפתרון collagenase ובדק שוב כל חמש דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את ביציות שלוש פעמים (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.82 mM MgSO 4, 0.33 mM Ca (NO 3) 2, 0.41 mM CaCl 2, 10 Hepes מ&quot;מ, pH 7.5) מלוחים שונה של בארת&#39;, ולהעבירם אל צלחת בקוטר 100 מ&quot;מ פטרי המכילות MBS פלוס 1% פניצילין / סטרפטומיצין. ביציות מוכנים כעת להיות microinjected. אם microinjection יבוצעו ביום אחר, בחנות ביציות על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, בחר בוגרת השישי בשלב ביציות עבור microinjection. ביציות אלה הם גדולים, עם ניגודיות טובה בין האונה חיה שחורה האונה בצבע שמנת צמחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת VI ביציות בוגרות שלב לתוך צלחת microwell (Nunc, 10 נפח היטב μl). זה צריך להיעשות בזהירות, תוך שימוש pipettor 200 μl עם קצה פיפטה כי נחתך בסוף כדי לאפשר שאיבה של ביציות undisrupted. </li></ol> חלק 2: Microinjection של ביציות Xenopus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את המצע לייבא להיות microinjected ידי הוספת כמות קטנה של כחול bromphenol 1%, כדי לסייע להדמיה של microinjection. לדוגמה, נוסיף 1 μl של כחול bromphenol עד 10 μl של המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים רצועה קטנה של Parafilm על צלחת בקוטר 100 מ&quot;מ פטרי, לוותר על ירידה של 5 μl של הפתרון להיות מוזרק על רצועת Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מחט הזריקה מכויל בעבר (מתקבל על ידי משיכת 6.6-μl micropipette דראמונד עם הזרק + פולר Matic) עם פתרון להיות מוזרק. לשם כך, microinjector מוגדר על מצב השאיפה. כדי לכייל את מחט הזריקה לעשות מסמן נקודה על המחט כל 0.5 מ&quot;מ, אשר מתאימות בהיקף של 50 nl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זריקה cytoplasmic, הכנס את קצה המחט לתוך הביצית בחצי הכדור צמחיים, קרוב מאוד בחצי הכדור החי, בזווית של כ 45 מעלות. הפעל את ההגדרה microinjector כדי microinject ו microinject כל הביצית עם 50 nl של המצע לייבא. מסמן נקודה על המחט משמשים כדי לפקח על כמות המצע כי כבר הזריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ביציות מוזרק אל צלחת פטרי קטנה (35 מ&quot;מ קוטר) מלא MBS, ועל דגירה בטמפרטורת החדר למשך פרק הזמן הרצוי (נקודות זמן נבחרים כדי לאפשר תצפית של המצע לייבא הקשורים NPCs, זה קורה בין 10 ל 30 דקות חלבונים עבור וירוסים מועברים באופן פעיל לכיוון ה NPC, הפעם גם תלוי במקום ההזרקה ואת גודל של החלבון / וירוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הדגירה תושלם, העברת ביציות כדי בקבוקון 4 מ&quot;ל כוס המכילה glutaraldehyde 2% MBS, ולתקן לילה בשעה 4 ° C. </li></ol> חלק 3: Dissection של ביציות Xenopus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף את ביציות 3 פעמים עם MBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביציות כדי בצלחת פטרי קטן מלא חיץ מלח נמוכה (LSB: 1 mM KCl, 0.5 mM MgCl 2, 10 HEPES מ&quot;מ, pH 7.5). באמצעות מיקרוסקופ הניתוח, לנתח פינצטה, להסיר את מוט הצמחי מן הביצית כל אחד. זה שימושי כדי לייצב את הביצית להיות גזור עם זוג אחד פינצטה, בעוד זוג אחר משמש כמו מספריים כדי להסיר את מוט צמחיים. בשלב זה ניתן להעריך את ההצלחה של microinjection על ידי נוכחות של גוון כחול cytosol. הפרוטוקול הוא נמשך רק עבור ביציות שהיו microinjected בהצלחה. בנוסף, אם הדגימות הן להיות מוכן EM, שלב זה לנתיחה עושה את זה הרבה יותר קל למצוא את הגרעין כאשר זמירה ואת חתך את הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את ביציות גזור שוב עם glutaraldehyde 2% LSB שעה אחת בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, לשטוף את ביציות גזור שלוש פעמים עם LSB. </li></ol> חלק 4: הכנת הזריקה ביציות עבור Embedding ו-Thin חתך EM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ביציות גזור לשקופית דיכאון. לשאוב כמה שיותר נוזלים כמו possible, ולאחר מכן במהירות (כך שהם לא לייבש) לכסות את ביציות גזור עם 2% נמוך ההיתוך agarose. בעוד agarose עדיין רך, להשתמש קצה פיפטה להפריד בין ביציות אחד מהשני, ועל מנת להבטיח כי כל הביצית היא עם הפנים כלפי מעלה או כלפי מטה (לא לצדדים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose כדי לחזק למשך כ -10 דקות. לאחר agarose מבצרת, השתמש סכין גילוח לחתוך את agarose לחתיכות קטנות, כל אחד המכיל ביצית גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את agarose-ביציות מוטבע בבקבוקון 4-ml זכוכית, שלאחר לתקן אותם עם 1% OSO 4 ב LSB שעה אחת בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם שלוש פעמים LSB. במידת הצורך, החנות מדגם ב 4 ° C במשך הלילה ולהמשיך את הפרוטוקול למחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברצף מייבשים את דגימות בסדרה עולה של אלכוהול (50, 70, ו 90% אתנול עבור 20 דקות כל אחד). זה ואחריו שני שינויים אתנול 100% במשך 15 דקות כל אחד. לבסוף מייבשים דגימות עם אצטון 100% במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדור דגימות בתערובת 01:01 של EPON (Fluka) ו אצטון למשך שעה אחת, ואחריה חדירה בתערובת 02:01 של EPON ו - אצטון במשך שעתיים, ולבסוף טהור EPON לפחות שש שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מקום תבניות הטבעה שטוח מלאים טריים טהור EPON. ביציות מכוונים בצורה כזאת שהצד של גרעין קרוב הזריקה - במקרה הזה את הצד של ביציות כי כבר גזור - יהיה מחולק הראשון. צעד זה מייעל את הסיכוי חזותי הייבוא ​​של המצע הנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לפלמר EPON יומיים בבית 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להמחיש את הדוגמאות, בלוקים הם גזוז מחולק מכן באמצעות ultramicrotome. מדורים מועברים על גבי רשתות EM, מוכתמים באמצעות הליך רגיל, ועל דמיינו עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. אנחנו לא יראה את החלק הזה של הפרוטוקול כפי שהוא הליך סטנדרטי EM. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג: אם הפרוטוקול היה מוצלח, אז מעטפת הגרעין (NE) ו NPCs צריך להיות נראית בבירור EM micrographs. בהתאם הזריק את המצע ואת משך הזמן בין הזרקה קיבעון, המצע צריך להיות גלוי בפניו cytoplasmic של NPC, על NPC, או על הפנים הגרעינית של NPC. איור 1 מציג NE חתך עם הציטופלסמה הסמוכה (ג) ו - גרעין (n) של הביצית Xenopus כי כבר הוזרקו capsids של baculovirus AcMNPV, מודגרות ב 4 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות, ומעובד להטבעת וסעיף דק EM כמתואר. ראשי חץ הצבע על NPCs. עגינה capsid בפניו cytoplasmic של NPC מצוין על ידי חץ לבן. לעומת זאת, איור 2 מראה NE חתך עם הציטופלסמה הסמוכה (ג) ו - גרעין (n) של הביצית Xenopus כי כבר הוזרק וירוס parvovirus דקה של עכברים (MVM), מודגרות בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות, מעובד להטבעת וסעיף דק EM כמתואר. באמצעות טכניקה זו, מצאנו כי MVM גורם לשיבושים של NE (כהן Panté, 2005). בסוגריים מצביעים על הפסקות NE. ראשי חץ הצבע על NPCs. Capsids MVM המשוערת הקשורים NE מסומנים על ידי חצים לבנים. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="איור 1" width="600" height="459" /> איור 1: מיקרוסקופ אלקטרונים של חתך-NE עם הציטופלסמה הסמוכה (ג) ו - גרעין (n) של הביצית Xenopus כי כבר הוזרקו capsids של baculovirus Ac MNPV, מודגרות ב 4 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות, ועובדו הטבעה וסעיף דק EM כמתואר. ראשי חץ הצבע על NPCs. Capsids מסומנים על ידי חצים לבנים. בר קנה מידה: 100 ננומטר. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="איור 2" width="600" height="264" /> איור 2: מיקרוסקופ אלקטרונים של חתך-NE עם הציטופלסמה הסמוכה (ג) ו - גרעין (n) של הביצית Xenopus כי כבר הוזרק וירוס parvovirus דקה של עכברים (MVM), מודגרות בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות, מעובד להטבעת וסעיף דק EM כמתואר. ראשי חץ הצבע על NPCs. בסוגריים מצביעים על הפסקות NE. Capsids MVM המשוערת הקשורים NE מסומנים על ידי חצים לבנים. בר קנה מידה: 100 ננומטר.

<ol>
	<li>Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies.">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li><li>Pant&#233;, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm.">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li><li>Rabe, B., Vlachou, A., Pant&#233;, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome.">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li><li>Cohen, S., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+Envelope:+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope.">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li><li>Pant&#233;, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy.">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li></ol>

Microinjection של ביציות Xenopus בשילוב עם חתך דק EM הוא כלי יעיל לחקר התחבורה nucleocytoplasmic. מערכת זו נעשה שימוש כדי למפות שלבים ברורים של יבוא דרך NPC, עבור אינטראקציה דוגמה מצע לייבא גרעיני עם רכיבים מבניים של ה NPC כמו חוטים cytoplasmic וסל גרעיני (נבדקה על ידי Panté, 2006). הוא שימש גם כדי ...

microinjection of xenopus laevis oocytes

Microinjection של ביציות Xenopus laevis ואחריו במיקרוסקופ אלקטרונים חתך דק (EM) היא מערכת מצוינת לחקר התחבורה nucleocytoplasmic. בגלל גרעין גדול שלה צפיפות גבוהה של קומפלקסים נקבוביות הגרעין (NPCs), תחבורה גרעיני ניתן דמיינו בקלות הביצית Xenopus. תובנה הרבה לתוך המנגנונים של ייבוא, ייצוא גרעיני כבר צבר באמצעות השימוש במערכת זו (נבדקה על ידי Panté, 2006). בנוסף, השתמשנו microinjection של ביציות Xenopus לנתח את המסלולים לייבא גרעיני של וירוסים מספר לשכפל בגרעין המארח. כאן אנו מדגימים את microinjection cytoplasmic של ביציות Xenopus עם מצע לייבא גרעיני. אנחנו גם מראים הכנה של ביציות מוזרק להדמיה על ידי חתך דק EM, כולל לנתיחה, התייבשות, והטבעה של ביציות לתוך שרף אפוקסי הטבעה. לבסוף, אנו מספקים תוצאות נציג עבור ביציות, כי כבר microinjected עם capsid של nucleopolyhedrovirus baculovirus californica Autographa (AcMNPV) או דקה parvovirus וירוס של עכברים (MVM), ולדון יישומים פוטנציאליים של הטכניקה.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes at JoVE.com

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ביציות עם מצע לייבא גרעיני, כמו גם הכנה של ביציות מוזרק להדמיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חתך דק.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Research

JoVE Journal

Biology

22.8K Views.  University of British Columbia - UBC. כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic של Xenopus laevis ביציות עם מצע לייבא גרעיני, כמו גם הכנה של ביציות מוזרק להדמיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חתך דק.

Video: Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

פלסטיק הטבעת ואת חתך של עוברים Xenopus laevis

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

קבלת ביצים Xenopus laevis נקבות

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; קונוסים צמיחה

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...