המחקר מעריך את ריכוז הגלוקוז בדגימות מיקרוביאליות באמצעות טכניקות כימות ממסנני חיידקים ושמרים. המטרה היא לשפר את הדיוק של גרם מסת גלוקוז במחקרים מיקרוביולוגיים. האתגרים כוללים כימות מדויק של ריכוז גלוקוז נמוך בדגימות מיקרוביאליות מורכבות והבחנה בין מקורות מיקרוביאליים וסביבתיים של גלוקוז בתרביות מעורבות.
המחקר הראה מתאם ברור בין זני חיידקים ספציפיים לבין שיעורי צריכת הגלוקוז שלהם, וחשף כיצד גורמים סביבתיים משפיעים על מסלולים מטבוליים. הפרוטוקול שלנו משפר את זיהוי הסוכר על ידי שיפור הספציפיות והרגישות תוך קיצור זמן העיבוד. שימוש בחומצה גופרתית בצורה מבוקרת ממזער הפרעות.
מחקר עתידי יתמקד באופטימיזציה של שיטות זיהוי גלוקוז עבור יישומי מיקרוביולוגיה תעשייתית, וחקירת התפקיד של גנים ספציפיים במטבוליזם של גלוקוז בתנאים סביבתיים משתנים. כדי להתחיל, לשקול 1.28 גרם של פוספט אשלגן dihydrogen ו 0.1304 גרם של פוספט dipotassium בכוס זכוכית. הוסף 70 מיליליטר של מים deionized, ולהתאים את ה- pH ל 5.5 באמצעות 1 חומצה הידרוכלורית מולרית או אשלגן הידרוקסיד.
לאחר מכן להעביר את הפתרון לבקבוק נפח 100 מיליליטר, ולהתאים את נפח ל 100 מיליליטר עם מים deionized. אחסנו את התמיסה המוכנה במיכל ענבר בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים. לאחר מכן, לשקול 0.01 גרם של o-Dianisidine dihydrochloride בצינור צנטריפוגה 2 מיליליטר.
באמצעות פיפטה 1, 000 מיקרוליטר, להוסיף 1 מיליליטר של מים deionized כדי להמיס את התרכובת, ולערבב את הפתרון לאט. עטפו את צינור הצנטריפוגה ברדיד אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסף תמיסת o-Dianisidine dihydrochloride ל- 10 מיליליטר של חיץ פוספט שנלקח בבקבוק נפחי של 100 מיליליטר, והתאם את הנפח הסופי ל- 100 מיליליטר באמצעות מאגר הפוספט.
לאחר העברת התמיסה לצלוחית ענבר, אחסנו אותה בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס למשך 3-4 חודשים. עכשיו מניחים בקבוק נפח 100 מיליליטר עם 30 מיליליטר של מים deionized באמבט קרח. לאחר 10 דקות, שפכו באיטיות 51 מיליליטר של 98% חומצה גופרתית על דפנות הבקבוק תוך כדי ניעור עדין שלו.
מאוחר יותר, להתאים את נפח הסופי ל 100 מיליליטר עם מים deionized, ולהעביר את הפתרון בקבוק ענבר זכוכית לאחסון. להכנת אנזימים, שוקלים 0.01 גרם גלוקוז אוקסידאז במיקרו-צינורית סטרילית של 2 מיליליטר. הוסיפו מיליליטר אחד של חוצץ נתרן אצטט 50 מילימולר ב-pH 5 למיקרו-צינורית וערבבו בעדינות.
לאחר מכן במיקרו-צינורית חדשה של 2 מיליליטר, שוקלים 0.0031 גרם של אנזים פרוקסידאז, וממיסים אותו במיליליטר אחד של חיץ פוספט שנקבע ל- pH 5.5. כסו את שתי המיקרו-צינוריות המכילות אנזימים ברדיד אלומיניום, ואחסנו אותן בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להכין 1 גרם לליטר D-גלוקוז פתרון סטנדרטי באמצעות מים deionized.
כדי להתחיל, להכין את תקן הסוכר ואת כל הפתרונות הנדרשים האחרים עבור הבדיקה. הוסף את נפח הגלוקוז המתאים לצינורות 2 מיליליטר טריים. כוונו אמבט יבש ל-37 מעלות צלזיוס, ואפשרו לו להתייצב.
הוסף את נפחי החיץ המתאימים לכל מיקרו-צינור, ואחריו 3.3 מיקרוליטר של גלוקוז אוקסידאז ו-1.2 מיקרוליטר של פרוקסידאז. לדגור את הצינורות על 37 מעלות צלזיוס, ולהגדיר את הטיימר במשך 20 דקות. מיד לאחר הדגירה, להוסיף 750 מיקרוליטר של 50% חומצה גופרתית לכל microtube, ומניחים אותם באמבט קרח במשך 2 דקות כדי להתקרר.
מעבירים את תערובת 1, 500 מיקרוליטר מקוררת לקובט פלסטיק, ומודדים את הספיגה ב 529 ננומטר. לאחר מכן נקו את אזור העבודה עם תמיסת 70% אלכוהול והדליקו מבער כדי להבטיח אספסיס. להשיג חיידקים או שמרים במדיום תרבית נוזלית.
מעבירים 100 מיקרוליטר של התרבית למיקרו-צינורות של 1.5 מיליליטר באמצעות קצוות סטריליים. צנטריפוגה הדגימות ב 7, 500 גרם במשך 7 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant, אשר מכיל גלוקוז בתמיסה.
מערבבים 0.5 מיקרוליטר של supernatant עם כל המרכיבים הדרושים להכנת תערובת התגובה. לדגור את microtubes במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ומיד להוסיף 750 מיקרוליטר של 50% חומצה גופרתית. תנו לתערובת להתקרר באמבט קרח במשך 2 דקות.
לבסוף, למדוד את הספיגה ב 529 ננומטר. הניתוח הספקטרופוטומטרי הצביע על שיא ספיגה מקסימלי של 529 ננומטר. ניתוח צריכת הגלוקוז על ידי Debaryomyces hansenii הראה תוצאות עקביות בין אוקסידאז גלוקוז ושיטות DNS עד להבדלים משמעותיים שהתגלו לאחר 6, 8 ו -12 שעות.
היישום של שיטת חומצה גופרתית גלוקוז אוקסידאז הקל על ניתוח של ריכוזי גלוקוז גבוהים עד 100 גרם לליטר, עם תוצאות אמינות לאחר דילול.
