이 연구는 박테리아 및 효모 필터의 정량화 기술을 사용하여 미생물 샘플의 포도당 농도를 평가합니다. 목표는 미생물 연구에서 포도당 질량 그램의 정확도를 향상시키는 것입니다. 복잡한 미생물 샘플에서 낮은 포도당 농도를 정확하게 정량화하고 혼합 배양에서 포도당의 미생물 및 환경 포도당 공급원을 구별하는 것이 과제입니다.
이 연구는 특정 미생물 균주와 포도당 소비율 사이의 명확한 상관 관계를 보여주었으며, 환경 요인이 대사 경로에 어떤 영향을 미치는지 밝혔습니다. 당사의 프로토콜은 특이성과 민감도를 개선하는 동시에 처리 시간을 줄여 포도당 검출을 향상시킵니다. 황산을 제어된 방식으로 사용하면 간섭을 최소화할 수 있습니다.
향후 연구는 산업 미생물학 응용 분야를 위한 포도당 검출 방법을 최적화하고 다양한 환경 조건에서 포도당 대사에서 특정 유전자의 역할을 조사하는 데 중점을 둘 것입니다. 시작하려면 유리 비커에 인산이수소칼륨 1.28g과 인산이칼륨 0.1304g의 무게를 잰다. 탈이온수 70ml를 넣고 염산 1몰 또는 수산화칼륨을 사용하여 pH를 5.5로 조정합니다.
그런 다음 용액을 100ml 부피 플라스크로 옮기고 탈이온수로 부피를 100ml로 조정합니다. 준비된 용액을 섭씨 4-8도의 호박색 용기에 최대 3개월 동안 보관하십시오. 다음으로, 2ml 원심분리기 튜브에 0.01g의 o-Dianisidine dihydrochloride의 무게를 잰다.
1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 1 밀리리터의 탈 이온수를 첨가하여 화합물을 용해시키고 용액을 천천히 혼합합니다. 원심분리기 튜브를 알루미늄 호일로 싸서 빛으로부터 보호하고 섭씨 20도에서 보관하십시오. 그런 다음 100ml 부피 플라스크에 담긴 10ml의 인산염 완충액에 o-Dianisidine dihydrochloride 용액을 추가하고 인산염 완충액을 사용하여 최종 부피를 100ml로 조정합니다.
용액을 호박색 플라스크에 옮긴 후 섭씨 4-8도에서 3-4개월 동안 보관하십시오. 이제 100밀리리터의 부피 플라스크와 30밀리리터의 탈이온수를 얼음 수조에 넣습니다. 10분 후 플라스크 벽에 51ml의 98%황산을 천천히 부으면서 부드럽게 흔듭니다.
나중에 탈이온수로 최종 부피를 100ml로 조정하고 용액을 유리 호박색 플라스크에 옮겨 보관합니다. 효소 제제의 경우, 2ml 멸균 마이크로튜브에 0.01g의 포도당 산화효소의 무게를 잰다. pH 5의 50밀리몰 아세트산 나트륨 완충액 1ml를 마이크로튜브에 넣고 부드럽게 섞습니다.
그런 다음 새 2ml 마이크로튜브에 0.0031g의 과산화효소의 무게를 측정하고 pH 5.5로 설정된 1ml의 인산염 완충액에 용해시킵니다. 효소가 들어있는 두 개의 마이크로튜브를 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 20도에서 보관합니다. 그런 다음 탈 이온수를 사용하여 리터당 1g의 D-Glucose 표준 용액을 준비합니다.
먼저 포도당 표준물질과 분석에 필요한 다른 모든 용액을 준비합니다. 신선한 2ml 튜브에 적절한 양의 포도당을 추가합니다. 건조 열조를 섭씨 37도로 설정하고 안정화되도록 합니다.
각 마이크로튜브에 적절한 부피의 완충액을 추가한 다음 3.3마이크로리터의 포도당 산화효소와 1.2마이크로리터의 과산화효소를 추가합니다. 튜브를 섭씨 37도에서 배양하고 타이머를 20분으로 설정합니다. 배양 직후 각 마이크로튜브에 750마이크로리터의 50%황산을 넣고 얼음 수조에 2분 동안 넣어 식힙니다.
냉각된 1, 500마이크로리터 혼합물을 플라스틱 큐벳으로 옮기고 529나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 그런 다음 70% 알코올 용액으로 작업 영역을 청소하고 버너에 불을 붙여 무균 상태를 확인합니다. 액체 배양 배지에서 박테리아 또는 효모를 얻습니다.
멸균 팁을 사용하여 배양액 100마이크로리터를 1.5ml 마이크로튜브로 옮깁니다. 7, 500G에서 섭씨 4도에서 7분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후 용액에 포도당이 포함된 상등액을 조심스럽게 제거합니다.
0.5 마이크로리터의 상등액을 반응 혼합물을 준비하는 데 필요한 모든 성분과 혼합합니다. 마이크로튜브를 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하고 즉시 750마이크로리터의 50%황산을 첨가합니다. 혼합물을 얼음 욕조에서 2분 동안 식히십시오.
마지막으로 529나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 분광 광도계 분석은 529 나노 미터에서 최대 흡광도 피크를 나타냈습니다. Debaryomyces hansenii에 의한 포도당 소비량 분석은 6, 8, 12시간에 유의미한 차이가 나타날 때까지 포도당 산화효소와 DNS 방법 간에 일관된 결과를 보여주었습니다.
포도당 산화효소 황산 방법을 적용하면 리터당 최대 100g의 높은 포도당 농도를 쉽게 분석할 수 있었으며 희석 후 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있었습니다.
