В исследовании оценивается концентрация глюкозы в образцах микроорганизмов с использованием методов количественного определения бактериальных и дрожжевых фильтров. Цель состоит в том, чтобы повысить точность измерения грамма массы глюкозы в микробиологических исследованиях. Проблемы включают в себя точное количественное определение низкой концентрации глюкозы в сложных микробиологических образцах и разграничение микробных и экологических источников глюкозы в смешанных культурах.
Исследование показало четкую корреляцию между конкретными штаммами микробов и скоростью потребления ими глюкозы, показывая, как факторы окружающей среды влияют на метаболические пути. Наш протокол улучшает обнаружение глюкозы за счет повышения специфичности и чувствительности при одновременном сокращении времени обработки. Контролируемое использование серной кислоты сводит к минимуму помехи.
Будущие исследования будут сосредоточены на оптимизации методов определения глюкозы для применения в промышленной микробиологии и изучении роли конкретных генов в метаболизме глюкозы в различных условиях окружающей среды. Для начала взвесьте 1,28 грамма дигидрофосфата калия и 0,1304 грамма дигидрофосфата калия в стеклянной мензурке. Добавьте 70 миллилитров деионизированной воды, и отрегулируйте pH до 5,5 с помощью 1 молярной соляной кислоты или гидроксида калия.
Затем перелейте раствор в 100-миллилитровую мерную колбу, и отрегулируйте объем до 100 миллилитров с помощью деионизированной воды. Храните приготовленный раствор в янтарной емкости при температуре 4-8 градусов Цельсия до трех месяцев. Далее взвесьте 0,01 грамма о-дианизидина дигидрохлорида в 2-миллилитровой центрифужной пробирке.
С помощью пипетки объемом 1000 микролитров добавьте 1 миллилитр деионизированной воды, чтобы растворить соединение, и медленно перемешайте раствор. Оберните трубку центрифуги алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света, и храните при температуре 20 градусов Цельсия. Затем добавьте раствор о-дианизидигидрохлорида в 10 миллилитров фосфатного буфера, взятого в 100-миллилитровую мерную колбу, и доведите итоговый объем до 100 миллилитров с помощью фосфатного буфера.
Переложив раствор в янтарную колбу, храните ее при температуре 4-8 градусов Цельсия в течение 3-4 месяцев. Теперь поместите в ледяную баню 100-миллилитровую мерную колбу с 30 миллилитрами деионизированной воды. Через 10 минут медленно влейте 51 миллилитр 98%-ной серной кислоты вниз по стенкам колбы, при этом аккуратно встряхивая ее.
Позже отрегулируйте итоговый объем до 100 миллилитров с помощью деионизированной воды, и переложите раствор в стеклянную янтарную колбу для хранения. Для получения фермента нужно взвесить 0,01 грамма глюкозооксидазы в 2-миллилитровой стерильной микропробирке. Добавьте в микропробирку 1 миллилитр 50-миллимолярного буфера ацетата натрия при pH 5 и аккуратно перемешайте.
Затем в новую 2-миллилитровую микропробирку взвесьте 0,0031 грамма фермента пероксидазы, и растворите его в 1 миллилитре фосфатного буфера, установленного на pH 5,5. Накройте обе микротрубки, содержащие ферменты, алюминиевой фольгой и храните их при температуре 20 градусов Цельсия. Затем приготовьте 1 грамм на литр стандартного раствора D-глюкозы, используя деионизированную воду.
Для начала подготовьте стандарт глюкозы и все другие необходимые растворы для анализа. Добавьте соответствующий объем глюкозы в свежие 2-миллилитровые трубки. Установите сухую термованну на 37 градусов Цельсия, и дайте ей стабилизироваться.
Добавьте соответствующие объемы буфера в каждую микротрубку, а затем 3,3 микролитра глюкозооксидазы и 1,2 микролитра пероксидазы. Инкубируйте трубки при температуре 37 градусов Цельсия, и установите таймер на 20 минут. Сразу после инкубации добавьте в каждую микротрубку по 750 микролитров 50%-ной серной кислоты, и поместите их на ледяную баню на 2 минуты для остывания.
Переложите охлажденную смесь объемом 1,500 микролитра в пластиковую кювету, и измерьте поглощение на 529 нанометрах. Затем очистите рабочую зону 70%-ным спиртовым раствором и зажгите горелку, чтобы обеспечить асептику. Получают бактерии или дрожжи в жидкой питательной среде.
Переложите 100 микролитров культуры в 1,5-миллилитровые микропробирки с помощью стерильных наконечников. Центрифугируйте образцы при 7 500 G в течение 7 минут при 4 градусах Цельсия. После центрифугирования следует осторожно удалить надосадочную жидкость, которая содержит глюкозу в растворе.
Смешайте 0,5 микролитра надосадочной жидкости со всеми требуемыми компонентами для приготовления реакционной смеси. Инкубируйте микротрубки в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия, и сразу же добавьте 750 микролитров 50% серной кислоты. Дайте смеси остыть на ледяной бане в течение 2 минут.
Наконец, измерьте поглощение на 529 нанометрах. Спектрофотометрический анализ показал максимальный пик поглощения на уровне 529 нанометров. Анализ потребления глюкозы Debaryomyces hansenii продемонстрировал последовательные результаты между методами глюкозооксидазы и ДНС до тех пор, пока не проявились значительные различия через 6, 8 и 12 часов.
Применение сернокислотного метода глюкозооксидазы способствовало анализу высоких концентраций глюкозы до 100 граммов на литр с надежными результатами после разведения.
