يقيم البحث تركيز الجلوكوز في العينات الميكروبية باستخدام تقنيات القياس الكمي من المرشحات البكتيرية والخميرة. الهدف هو تحسين دقة جرام كتلة الجلوكوز في الدراسات الميكروبيولوجية. تشمل التحديات القياس الدقيق لتركيز الجلوكوز المنخفض في العينات الميكروبية المعقدة والتمييز بين المصادر الميكروبية والبيئية للجلوكوز في المزارع المختلطة.
أظهر البحث ارتباطا واضحا بين سلالات ميكروبية معينة ومعدلات استهلاكها للجلوكوز ، مما يكشف عن كيفية تأثير العوامل البيئية على مسارات التمثيل الغذائي. يعزز بروتوكولنا اكتشاف الجلوكوز من خلال تحسين الخصوصية والحساسية مع تقليل وقت المعالجة. استخدام حامض الكبريتيك بطريقة خاضعة للرقابة يقلل من التداخل.
ستركز الأبحاث المستقبلية على تحسين طرق الكشف عن الجلوكوز لتطبيقات علم الأحياء الدقيقة الصناعية ، والتحقيق في دور جينات معينة في استقلاب الجلوكوز في ظل ظروف بيئية مختلفة. للبدء ، قم بوزن 1.28 جرام من فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم و 0.1304 جرام من فوسفات ثنائي البوتاسيوم في دورق زجاجي. أضف 70 مل من الماء منزوع الأيونات ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.5 باستخدام 1 حمض الهيدروكلوريك المولي أو هيدروكسيد البوتاسيوم.
ثم انقل المحلول إلى قارورة حجمية سعة 100 مل ، واضبط الحجم على 100 مل بالماء منزوع الأيونات. قم بتخزين المحلول المحضر في وعاء كهرماني على حرارة 4-8 درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. بعد ذلك ، تزن 0.01 جرام من o-Dianisidine dihydrochloride في أنبوب طرد مركزي سعة 2 ملليلتر.
باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر، أضف 1 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات لإذابة المركب، واخلط المحلول ببطء. لف أنبوب الطرد المركزي بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء ، وقم بتخزينه على حرارة 20 درجة مئوية. ثم أضف محلول o-Dianisidine dihydrochloride إلى 10 ملليلتر من مخزن الفوسفات المأخوذ في قارورة حجمية سعة 100 ملليلتر ، واضبط الحجم النهائي على 100 مل باستخدام المخزن المؤقت للفوسفات.
بعد نقل المحلول إلى قارورة كهرمانية ، قم بتخزينه على حرارة 4-8 درجات مئوية لمدة 3-4 أشهر. الآن ضع قارورة حجمية سعة 100 مل مع 30 مل من الماء منزوع الأيونات في حمام جليدي. بعد 10 دقائق ، اسكب ببطء 51 مل من 98٪ من حمض الكبريتيك أسفل جدران القارورة مع رجها برفق.
في وقت لاحق ، اضبط الحجم النهائي على 100 مل بالماء منزوع الأيونات ، وانقل المحلول إلى قارورة كهرمانية زجاجية للتخزين. لتحضير الإنزيم ، قم بوزن 0.01 جرام من أوكسيديز الجلوكوز في أنبوب دقيق معقم سعة 2 ملليلتر. أضف 1 ملليلتر من محلول أسيتات الصوديوم 50 ملليمولار عند درجة الحموضة 5 إلى الأنبوب الدقيق واخلطه برفق.
ثم في أنبوب صغير جديد سعة 2 مليلتر ، قم بوزن 0.0031 جرام من إنزيم البيروكسيديز ، وقم بإذابه في 1 مليلتر من مخزن الفوسفات المضبوطة على درجة الحموضة 5.5. قم بتغطية كل من الأنبوبين الدقيقة المحتويين على إنزيمات بورق الألمنيوم ، وتخزينهما عند 20 درجة مئوية. ثم قم بإعداد 1 جرام لكل لتر محلول D-Glucose القياسي باستخدام الماء منزوع الأيونات.
للبدء ، قم بإعداد معيار الجلوكوز وجميع الحلول الأخرى المطلوبة للفحص. أضف الحجم المناسب من الجلوكوز إلى أنابيب جديدة سعة 2 ملليلتر. اضبط الحمام الحراري الجاف على 37 درجة مئوية ، واتركه يستقر.
أضف الكميات المناسبة من المخزن المؤقت إلى كل أنبوب دقيق ، متبوعا ب 3.3 ميكرولتر من الجلوكوز أوكسيديز و 1.2 ميكرولتر من البيروكسيديز. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية ، واضبط المؤقت لمدة 20 دقيقة. مباشرة بعد الحضانة ، أضف 750 ميكرولتر من حمض الكبريتيك بنسبة 50٪ إلى كل أنبوب دقيق ، وضعه في حمام جليدي لمدة دقيقتين حتى يبرد.
انقل الخليط المبرد 1،500 ميكرولتر إلى كوفيت بلاستيكي ، وقم بقياس الامتصاص عند 529 نانومتر. ثم نظف منطقة العمل بمحلول كحول بنسبة 70٪ وأشعل الموقد لضمان التعقيم. الحصول على البكتيريا أو الخميرة في وسط زراعة سائل.
انقل 100 ميكرولتر من المزرعة إلى أنابيب دقيقة سعة 1.5 ملليلتر باستخدام أطراف معقمة. الطرد المركزي للعينات عند 7 ، 500 جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، والتي تحتوي على الجلوكوز في المحلول.
امزج 0.5 ميكرولتر من المادة الطافية مع جميع المكونات المطلوبة لتحضير خليط التفاعل. احتضان الأنابيب الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، وأضف على الفور 750 ميكرولتر من 50٪ حمض الكبريتيك. دع الخليط يبرد في حمام جليدي لمدة 2 دقيقة.
أخيرا ، قم بقياس الامتصاص عند 529 نانومتر. أشار التحليل الطيفي الضوئي إلى ذروة امتصاص قصوى عند 529 نانومتر. أظهر تحليل استهلاك الجلوكوز بواسطة Debaryomyces hansenii نتائج متسقة بين طرق الجلوكوز أوكسيديز ونظام أسماء النطاقات حتى ظهرت اختلافات كبيرة في 6 و 8 و 12 ساعة.
سهل تطبيق طريقة حمض الكبريتيك الجلوكوز أوكسيديز تحليل تركيزات الجلوكوز العالية التي تصل إلى 100 جرام لكل لتر ، مع نتائج موثوقة بعد التخفيف.
