המשימה המדעית הכוללת של הקבוצה שלנו היא לפתח טיפולים לפציעות שרירים ושלד טראומטיות באמצעות אסטרטגיות ביו-הנדסיות. באופן ספציפי, אנו מהנדסים חומרים בעלי תכונות ביופיזיקליות ניתנות לכוונון כדי לווסת סביבות חוץ-תאיות ולהניע פנוטיפים תאיים מתחדשים. המטרה שלנו היא להשתמש בחומרים אלה כדי לשפר בסופו של דבר את הריפוי ולקדם את איכות החיים.
על ידי החלת גזירה על קולגן במהלך פיברוגנזה, ניתן לשלוט בארגון או באניזוטרופיה של סיבי הקולגן הבודדים כדי ליצור פיגומים עם סיבי דפוס מיושרים מאוד או אקראיים עם תכונות בקנה מידה ננומטרי. תכונות אלה יכולות להנחות אינטראקציות תאיות וארגון שלד תאים לאורך כיוון הסיבים. פרוטוקול זה יכול לייצר ביו-חומרים עם דפוס סיבי בקנה מידה ננומטרי ללא ציוד מיוחד יקר או ריאגנטים.
זה הופך אותו לנגיש יותר מטכניקות ייצור פיברו אחרות ויעיל ביותר עבור יישומי הנדסת רקמות אינוטרופיים. התוצאות שלנו הכינו את הקרקע להתאמת פרוטוקול זה לחלבוני מטריצה חוץ-תאיים אחרים. אנו בוחנים קישור ביולוגי העשוי משריר נטול תאים כדי לראות כיצד חיקוי דפוסי רקמות והרכב חלבון יכול לשפר את ההתחדשות.
העבודה הזו גם מכינה את הקרקע לשימוש בביו-חומר שלנו במגוון רקמות שונות. כיום אנו משתמשים בטכנולוגיה זו כדי ליצור רקמות מהונדסות שיכולות להקל על ריפוי מורכב של סוגי רקמות מרובים. ובמקביל, אנו בוחנים כיצד לסנכרן את החומרים המהונדסים שלנו עם גירויים מכניים.
אנו מקווים להשיג הבנה עמוקה יותר של האופן שבו תכונות בקנה מידה ננומטרי מנחות פנוטיפים תאיים ולפתח טיפולים מהונדסים חזקים יותר בעתיד. כדי להתחיל, חתוך את צינור הדיאליזה לכשלושה סנטימטרים והחזיר אותו למים טהורים במיוחד. לאחר מכן מהדקים קצה אחד של הצינור עם קליפ צינורות דיאליזה באמצעות מזרק של 10 מיליליטר המצויד במחט בגודל 18, והעבירו חמישה עד שישה מיליליטר של קולגן זנב עכברוש מסוג אחד לתוך הצינור.
לאחר מכן, מהדקים את הקצה השני של הצינור כדי לסגור אותו. לאחר מכן, הניחו שכבה בעובי של 0.5 עד סנטימטר אחד של פוליאתילן גליקול או פתיתי יתד בתחתית צלחת זכוכית. לאחר מכן הנח את צינור הדיאליזה המלא בקולגן על שכבת היתד.
מוסיפים עוד פתיתי יתד כדי לכסות לחלוטין את הצינור ומכניסים את הכלי למקרר של ארבע מעלות צלזיוס. כל 10 עד 15 דקות, הסר את פתיתי היתד הרטובים מפני השטח של צינור הדיאליזה. מחזירים את הצינור בשכבה טרייה של יתד יבש ומחזירים את המנה למקרר של ארבע מעלות צלזיוס.
לאחר 30 עד 35 דקות, הסר את פתיתי היתד הרטובים מפני השטח של צינור הדיאליזה. שטפו את פתיתי היתד הרטובים במי ברז וייבשו את הצינור בעזרת טישו. לאחר מכן שחרר קצה אחד של הצינור והעביר את הקולגן הדיאליזה לצינורות מיקרו צנטריפוגה.
סובב לזמן קצר את כל בועות האוויר בקולגן באמצעות מיני צנטריפוגה בטמפרטורה של 2,000 גרם למשך עד 30 שניות בטמפרטורת החדר. אחסן את הקולגן בארבע מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. יום אחד לפני השימוש, שאב כמיליליטר אחד של קולגן שעבר דיאליזה למזרק של מיליליטר אחד עם מחט בגודל 16.
לאחר מכן הסר את המחט ועטוף את ראש המזרק בפרפילם. אחסן את המזרק זקוף בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר הסרה של בועות אוויר קטנות. כדי להתחיל, הוציאו מהמקרר מזרק של קולגן דיאליזה מוכן והצמידו מחט קהה בגודל 22.
הניחו מגלשת זכוכית במכסה של צלחת ארבע בארות וכסו את המגלשה במספיק 37 מעלות צלזיוס PBS חמות כדי להטביע אותה. החזק את המזרק בזווית של כ-30 עד 45 מעלות, והוציא ידנית רצועות דקות של קולגן על מגלשת הזכוכית. המתינו דקה עד שתיים עד שהקולגן ישלים את הפיברוגנזה, או עד שהוא יהפוך ללבן אטום.
לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי לחתוך את רצועות הקולגן לאורך הרצוי. בזה אחר זה, עטפו בעדינות את רצועות הקולגן לאורכן במקביל לאזור הניקוד מעל שבב זכוכית מוכן. תחוב את שולי הרצועות מתחת לשבב.
המשיכו להניח רצועות קולגן עד להשגת המידות הרצויות. כעת, מקם את הקולגן הידרוג'ל החדש שנוצר על פני שתי בארות של צלחת באר. השאירו את ההידרוג'לים על הספסל לייבוש למשך שעה עד שלוש שעות או עד שגבישי מלח PBS מכסים 50% עד 90% משטח ההידרוג'ל.
לאחר מכן טבלו כל הידרוג'ל ב-PBS למשך כ-30 עד 60 שניות או עד שגבישי המלח נמסים. יש לטפטף בעדינות את עודפי ה-PBS מההידרוג'לים בעזרת טישו. לבסוף, הניחו את ההידרוג'לים בחזרה על צלחת הבאר והשאירו אותם לייבוש במכסה אדים למשך הלילה.
כדי להתחיל, הוציאו מזרק קולגן מהמקרר והצמידו מחט קהה בגודל 22. יש להוציא קולגן במהירות של כ-3.2 מיליליטר לדקה על שבב זכוכית יבש. ודא שמספיק קולגן מוחצן כדי לקבל ממדים כמו הידרוגל קולגן מיושר.
כעת, השתמש במלקחיים כדי לטבול את הקולגן המוקצף בשפופרת של 50 מיליליטר של 10XPBS מחומם. המתינו 45 עד 60 שניות עד שהקולגן ישלים את הפיברוגנזה או עד שהוא יהפוך ללבן אטום. לאחר מכן יש לטפוח בעדינות את עודפי ה-PBS מהקולגן בעזרת טישו.
לאחר שטיפה וייבוש ההידרוג'לים, יש לעקר אותם ואת צלחת הבאר שמסביב באתנול 70% למשך 15 דקות. הרם לזמן קצר את ההידרוג'לים באמצע העיקור באמצעות מלקחיים כדי להבטיח שגם החלק התחתון של שבב הזכוכית וגם ההידרוג'ל נמצאים במגע עם אתנול. לאחר מכן הסר את האתנול ואפשר להידרוג'לים להתייבש באוויר למשך 10 דקות.
שטפו את ההידרוג'לים שלוש פעמים ב-PBS סטרילי למשך 10 דקות כל אחד כדי להסיר שאריות אתנול ולהחזיר לחות להידרוג'לים. תמונות שדה בהירות של מיובלסטים ראשוניים של שרירי השלד של עכבר הראו כי הנחיה ננוטופוגרפית אנזוטרופית של קולגן פיברו מקדמת יישור תאי.
