私たちのグループの包括的な科学的使命は、生物工学的戦略を使用して外傷性筋骨格系損傷の治療治療法を開発することです。具体的には、細胞外環境を調節し、再生可能な細胞表現型を促進するために、調整可能な生物物理学的特徴を持つ材料を設計します。私たちの目標は、これらの素材を利用して、最終的に治癒を改善し、生活の質を向上させることです。
線維形成時にコラーゲンにせん断を加えることにより、個々のコラーゲン線維の組織化または異方性を制御して、ナノスケールの特徴を持つ高度に整列したまたはランダムにパターン化された線維線維を持つ足場を生成することができます。これらの特徴は、細胞の相互作用と細胞骨格の組織化を原線維の方向に沿って導くことができます。このプロトコールは、高価な専用機器や試薬を使用せずに、ナノスケールのフィブリラリーパターニングを備えた生体材料を作製できます。
これにより、他の繊維製造技術よりもアクセスしやすく、変力組織工学アプリケーションに非常に効果的です。私たちの結果は、このプロトコルを他の細胞外マトリックスタンパク質に適応させるための舞台を整えます。私たちは、脱細胞化した筋肉から作られたバイオリンクを探求し、組織のパターン化とタンパク質組成の両方を模倣することで再生を促進する方法を確認しています。
この研究は、私たちの生体材料をさまざまな組織で使用するための舞台にもなります。現在、この技術を利用して、複数の組織タイプの複雑な治癒を促進することができる人工組織を作成しています。それと並行して、私たちはエンジニアリング材料と機械的な刺激をいかに相乗効果で実現するかを検討しています。
私たちは、ナノスケールの特徴が細胞の表現型をどのように導くかをより深く理解し、将来的にはより堅牢な工学的治療法を開発したいと考えています。まず、透析チューブを約3インチにカットし、超純水で再水和します。次に、18ゲージの針を備えた10ミリリットルの注射器を使用して透析チューブクリップでチューブの一端をクリップし、5〜6ミリリットルのラットテールコラーゲンタイプ1をチューブに移します。
その後、チューブのもう一方の端をクリップで留めて閉じます。次に、ガラス皿の底にポリエチレングリコールまたはペグフレークの厚さ0.5〜1センチメートルの層を置きます。次に、コラーゲンを充填した透析チューブをペグ層に置きます。
ペグフレークを追加してチューブを完全に覆い、皿を摂氏4度の冷蔵庫に入れます。10〜15分ごとに、透析チューブの表面から濡れたペグフレークを取り除きます。ドライペグの新しい層でチューブを回収し、皿を摂氏4度の冷蔵庫に戻します。
30〜35分後、透析チューブの表面から濡れたペグフレークを取り除きます。濡れたペグフレークを水道水で洗い流し、ティッシュでチューブを軽くたたいて乾かします。次に、チューブの一方の端をクリップから外し、透析したコラーゲンをマイクロ遠心チューブに移します。
室温で最大 30 秒間、 2 、 000G のミニ遠心分離機を使用して、コラーゲン内の気泡を簡単にスピンダウンします。コラーゲンは後で使用するために摂氏4度で保存してください。使用の1日前に、透析したコラーゲンを16ゲージの針で1ミリリットルの注射器に約1ミリリットルのコラーゲンを引き出します。.
次に、針を取り外し、シリンジヘッドをパラフィルムで包みます。シリンジを4°Cで一晩直立させて保管し、小さな気泡を除去できるようにします。まず、準備した透析コラーゲンの注射器を冷蔵庫から取り出し、鈍い22ゲージの針を取り付けます。
4ウェルプレートの蓋にスライドガラスを置き、スライドを37°Cの温かいPBSで覆って水没させます。シリンジを約30〜45度の角度で保持し、コラーゲンの細いストリップをスライドガラスに手動で押し出します。コラーゲンが線維化を完了するまで1〜2分待つか、不透明な白くなるまで待ちます。
次に、鉗子を使用してコラーゲンストリップを希望の長さにカットします。一度に1つずつ、コラーゲンのストリップをスコアのある領域と平行に縦にそっとドレープします。ストリップの端をチップの下に押し込みます。
目的の寸法に達するまで、コラーゲンストリップを配置し続けます。次に、新しく形成されたコラーゲンハイドロゲルをウェルプレートの2つのウェルに置きます。ハイドロゲルをベンチトップに置いて、1〜3時間、またはPBS塩の結晶がハイドロゲル表面の50%から90%を覆うまで乾燥させます。
次に、各ヒドロゲルをPBSに約30〜60秒間、または塩の結晶が溶解するまで沈めます。ハイドロゲルから余分なPBSをティッシュでやさしく軽くたたきます。最後に、ハイドロゲルをウェルプレートに戻し、ドラフトで一晩乾燥させます。
まず、冷蔵庫からコラーゲンの注射器を取り出し、鈍い22ゲージの針を取り付けます。コラーゲンを毎分約3.2ミリリットルで乾燥ガラスチップに押し出します。整列したコラーゲンハイドロゲルのような寸法を得るために、十分なコラーゲンが押し出されていることを確認してください。
次に、鉗子を使用して、押し出したコラーゲンを温めた10XPBSの50ミリリットルチューブに浸します。コラーゲンが線維化を完了するまで、または不透明な白くなるまで45〜60秒待ちます。次に、ティッシュペーパーでコラーゲンから余分なPBSをやさしくたたきます。
ハイドロゲルをすすぎ乾燥させた後、ハイドロゲルと周囲のウェルプレートを70%エタノールで15分間滅菌します。鉗子を使用して滅菌の途中でヒドロゲルを短時間持ち上げて、ガラスチップの下側とヒドロゲルの両方がエタノールと接触していることを確認します。次に、エタノールを取り出し、ヒドロゲルを10分間風乾させます。
ハイドロゲルを滅菌PBSでそれぞれ10分間3回洗浄して、残留エタノールを除去し、ハイドロゲルを再水和します。初代マウス骨格筋筋芽細胞の明視野画像は、コラーゲン線維の異方性ナノトポグラフィーガイダンスが細胞の整列を促進することを示しました。
