La misión científica general de nuestro grupo es desarrollar tratamientos terapéuticos para las lesiones musculoesqueléticas traumáticas utilizando estrategias de bioingeniería. Específicamente, diseñamos materiales con características biofísicas ajustables para modular entornos extracelulares e impulsar fenotipos celulares regenerativos. Nuestro objetivo es utilizar estos materiales para, en última instancia, mejorar la curación y mejorar la calidad de vida.
Mediante la aplicación de cizallamiento al colágeno durante la fibrogénesis, se puede controlar la organización o anisotropía de las fibrillas de colágeno individuales para generar andamios con fibrillas altamente alineadas o de patrón aleatorio con características a nanoescala. Estas características pueden guiar las interacciones celulares y la organización del citoesqueleto a lo largo de la dirección de las fibrillas. Este protocolo puede fabricar biomateriales con patrones fibrilares a nanoescala sin costosos equipos especializados o reactivos.
Esto lo hace más accesible que otras técnicas de fabricación de fibro y altamente efectivo para aplicaciones de ingeniería de tejidos inotrópicos. Nuestros resultados sentaron las bases para adaptar este protocolo a otras proteínas de la matriz extracelular. Estamos explorando un enlace biológico hecho de músculo descelularizado para ver cómo imitar tanto el patrón de tejido como la composición de proteínas puede mejorar la regeneración.
Este trabajo también sienta las bases para el uso de nuestro biomaterial en una variedad de tejidos diferentes. Actualmente estamos utilizando esta tecnología para generar tejidos de ingeniería que pueden facilitar la curación compleja de múltiples tipos de tejidos. Y en paralelo, estamos estudiando cómo crear sinergias entre nuestros materiales de ingeniería y los estímulos mecánicos.
Esperamos lograr una comprensión más profunda de cómo las características a nanoescala guían los fenotipos celulares y desarrollar terapias de ingeniería más robustas en el futuro. Para comenzar, corte el tubo de diálisis a aproximadamente tres pulgadas y rehidrátelo en agua ultrapura. A continuación, sujete un extremo del tubo con una pinza para tubos de diálisis utilizando una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 18, transfiera de cinco a seis mililitros de colágeno de cola de rata tipo uno al tubo.
Después de eso, sujete el otro extremo del tubo para cerrarlo. A continuación, coloque una capa de 0,5 a un centímetro de espesor de polietilenglicol o escamas de clavija en el fondo de un plato de vidrio. A continuación, coloque el tubo de diálisis relleno de colágeno en la capa de clavijas.
Agregue más hojuelas de clavija para cubrir completamente el tubo y coloque el plato en un refrigerador de cuatro grados centígrados. Cada 10 a 15 minutos, retire las escamas de clavija húmedas de la superficie del tubo de diálisis. Recupere el tubo con una capa nueva de clavija seca y devuelva el plato al refrigerador a cuatro grados centígrados.
Después de 30 a 35 minutos, retire las escamas de clavija húmedas de la superficie del tubo de diálisis. Enjuague las escamas de clavija húmedas con agua del grifo y seque el tubo con un pañuelo de papel. A continuación, suelte un extremo del tubo y transfiera el colágeno dializado a tubos de microcentrífuga.
Reduzca brevemente las burbujas de aire en el colágeno con una mini centrífuga a 2.000 g durante un máximo de 30 segundos a temperatura ambiente. Almacene el colágeno a cuatro grados centígrados para su uso posterior. Un día antes de usar, extraiga aproximadamente un mililitro de colágeno dializado en una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 16.
A continuación, retire la aguja y envuelva el cabezal de la jeringa con parafilm. Guarde la jeringa en posición vertical a cuatro grados centígrados durante la noche para permitir la eliminación de pequeñas burbujas de aire. Para comenzar, saque una jeringa de colágeno dializado preparado del refrigerador y coloque una aguja roma de calibre 22.
Coloque un portaobjetos de vidrio en la tapa de una placa de cuatro pocillos y cubra el portaobjetos con suficiente PBS caliente de 37 grados centígrados para sumergirlo. Sosteniendo la jeringa en un ángulo de aproximadamente 30 a 45 grados, extruya manualmente tiras delgadas de colágeno en el portaobjetos de vidrio. Espere uno o dos minutos para que el colágeno complete la fibrogénesis o hasta que se vuelva blanco opaco.
A continuación, utilice unas pinzas para cortar las tiras de colágeno a la longitud deseada. Una a la vez, coloque suavemente las tiras de colágeno a lo largo paralelas a la región marcada sobre un chip de vidrio preparado. Mete los bordes de las tiras debajo del chip.
Continúe colocando tiras de colágeno hasta lograr las dimensiones deseadas. Ahora, coloque el hidrogel de colágeno recién formado en dos pocillos de una placa de pocillo. Deje secar los hidrogeles en la mesa de trabajo durante una a tres horas o hasta que los cristales de sal de PBS cubran entre el 50% y el 90% de la superficie del hidrogel.
A continuación, sumerja cada hidrogel en PBS durante unos 30 a 60 segundos o hasta que los cristales de sal se disuelvan. Frote suavemente el exceso de PBS de los hidrogeles con un pañuelo de papel. Finalmente, vuelva a colocar los hidrogeles en la placa del pocillo y déjelos secar en una campana extractora durante la noche.
Para empezar, saca una jeringa de colágeno de la nevera y coloca una aguja roma de calibre 22. Extruya el colágeno a aproximadamente 3,2 mililitros por minuto sobre un chip de vidrio seco. Asegúrese de que se extruya suficiente colágeno para obtener dimensiones como los hidroteros de colágeno alineados.
Ahora, use pinzas para sumergir el colágeno extruido en un tubo de 50 mililitros de 10XPBS calentado. Espere de 45 a 60 segundos para que el colágeno complete la fibrogénesis o hasta que se vuelva blanco opaco. A continuación, frote suavemente el exceso de PBS del colágeno con un pañuelo de papel.
Después de enjuagar y secar los hidrogeles, esterilícelos junto con la placa del pocillo circundante en etanol al 70% durante 15 minutos. Eleve brevemente los hidrogeles a la mitad de la esterilización con pinzas para asegurarse de que tanto la parte inferior del chip de vidrio como el hidrogel estén en contacto con el etanol. A continuación, retire el etanol y deje que los hidrogeles se sequen al aire durante 10 minutos.
Lave los hidrogeles tres veces en PBS estéril durante 10 minutos cada una para eliminar el etanol residual y rehidratar los hidrogeles. Las imágenes de campo claro de los mioblastos primarios del músculo esquelético del ratón mostraron que la guía nanotopográfica anisotrópica del colágeno fibro promueve la alineación celular.
