La mission scientifique globale de notre groupe est de développer des traitements thérapeutiques pour les blessures musculo-squelettiques traumatiques en utilisant des stratégies de bio-ingénierie. Plus précisément, nous concevons des matériaux avec des caractéristiques biophysiques réglables pour moduler les environnements extracellulaires et piloter les phénotypes cellulaires régénératifs. Notre objectif est d’utiliser ces matériaux pour améliorer la guérison et faire progresser la qualité de vie.
En appliquant un cisaillement au collagène pendant la fibrogenèse, l’organisation ou l’anisotropie des fibrilles de collagène individuelles peut être contrôlée pour générer des échafaudages avec des fibrilles hautement alignées ou de motifs aléatoires avec des caractéristiques à l’échelle nanométrique. Ces caractéristiques peuvent guider les interactions cellulaires et l’organisation cytosquelettique le long de la direction des fibrilles. Ce protocole permet de fabriquer des biomatériaux avec des motifs fibrillaires à l’échelle nanométrique sans équipement spécialisé ni réactifs coûteux.
Cela le rend plus accessible que d’autres techniques de fibrofabrication et très efficace pour les applications d’ingénierie tissulaire inotrope. Nos résultats ouvrent la voie à l’adaptation de ce protocole à d’autres protéines de la matrice extracellulaire. Nous explorons un lien biologique fabriqué à partir de muscles décellularisés pour voir comment l’imitation de la structure des tissus et de la composition des protéines peut améliorer la régénération.
Ce travail ouvre également la voie à l’utilisation de notre biomatériau dans une variété de tissus différents. Nous utilisons actuellement cette technologie pour générer des tissus modifiés qui peuvent faciliter la guérison complexe de plusieurs types de tissus. Et en parallèle, nous examinons comment mettre en synergie nos matériaux d’ingénierie avec des stimuli mécaniques.
Nous espérons parvenir à une compréhension plus approfondie de la façon dont les caractéristiques à l’échelle nanométrique guident les phénotypes cellulaires et développer des thérapies modifiées plus robustes à l’avenir. Pour commencer, coupez le tube de dialyse à environ trois pouces et réhydratez-le dans de l’eau ultra-pure. Ensuite, coupez une extrémité du tube avec un clip de tube de dialyse à l’aide d’une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 18, transférez cinq à six millilitres de collagène de queue de rat de type un dans le tube.
Après cela, coupez l’autre extrémité du tube pour le fermer. Ensuite, placez une couche de 0,5 à un centimètre d’épaisseur de polyéthylène glycol ou de flocons de cheville au fond d’un plat en verre. Placez ensuite le tube de dialyse rempli de collagène sur la couche de cheville.
Ajoutez plus de flocons de cheville pour couvrir complètement le tube et placez le plat dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Toutes les 10 à 15 minutes, retirez les flocons de cheville mouillés de la surface de la tubulure de dialyse. Récupérez le tube avec une nouvelle couche de cheville sèche et remettez le plat dans le réfrigérateur à quatre degrés Celsius.
Après 30 à 35 minutes, retirez les flocons de cheville mouillés de la surface de la tubulure de dialyse. Rincez les flocons de cheville mouillés à l’eau du robinet et séchez le tube avec un mouchoir en papier. Ensuite, déclipsez une extrémité du tube et transférez le collagène dialysé dans des micro-tubes à centrifuger.
Faites tourner brièvement les bulles d’air dans le collagène à l’aide d’une mini-centrifugeuse à 2 000 g pendant un maximum de 30 secondes à température ambiante. Conservez le collagène à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Un jour avant l’utilisation, prélevez environ un millilitre de collagène dialysé dans une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 16.
Retirez ensuite l’aiguille et enveloppez la tête de la seringue avec du parafilm. Conservez la seringue à la verticale à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour permettre l’élimination des petites bulles d’air. Pour commencer, retirez une seringue de collagène dialysé préparé du réfrigérateur et fixez-y une aiguille émoussée de calibre 22.
Placez une lame de verre dans le couvercle d’une plaque à quatre puits et couvrez la lame avec suffisamment de PBS chaud de 37 degrés Celsius pour l’immerger. En tenant la seringue à un angle d’environ 30 à 45 degrés, extrudez manuellement de fines bandes de collagène sur la lame de verre. Attendez une à deux minutes pour que le collagène termine la fibrogenèse ou jusqu’à ce qu’il devienne blanc opaque.
Ensuite, à l’aide d’une pince, coupez les bandes de collagène à la longueur souhaitée. Une à la fois, drapez doucement les bandes de collagène dans le sens de la longueur, parallèlement à la région entaillée, sur un éclat de verre préparé. Rentrez les bords des bandes sous la puce.
Continuez à placer les bandes de collagène jusqu’à ce que les dimensions souhaitées soient atteintes. Maintenant, positionnez l’hydrogel de collagène nouvellement formé sur deux puits d’une plaque de puits. Laissez sécher les hydrogels sur la paillasse pendant une à trois heures ou jusqu’à ce que les cristaux de sel PBS recouvrent 50 à 90 % de la surface de l’hydrogel.
Ensuite, immergez chaque hydrogel dans du PBS pendant environ 30 à 60 secondes ou jusqu’à ce que les cristaux de sel soient dissous. Tamponnez doucement l’excès de PBS des hydrogels avec un mouchoir. Enfin, replacez les hydrogels sur la plaque du puits et laissez-les sécher dans une hotte pendant la nuit.
Pour commencer, retirez une seringue de collagène du réfrigérateur et fixez-y une aiguille émoussée de calibre 22. Extrudez du collagène à environ 3,2 millilitres par minute sur un éclat de verre sec. Assurez-vous qu’une quantité suffisante de collagène est extrudée pour obtenir des dimensions telles que les hydésrogels de collagène alignés.
Maintenant, utilisez une pince pour immerger le collagène extrudé dans un tube de 50 millilitres de 10XPBS réchauffé. Attendez 45 à 60 secondes pour que le collagène termine la fibrogenèse ou jusqu’à ce qu’il devienne blanc opaque. Ensuite, tamponnez doucement l’excès de PBS du collagène avec un mouchoir.
Après avoir rincé et séché les hydrogels, stérilisez-les ainsi que la plaque de puits environnante dans de l’éthanol à 70 % pendant 15 minutes. Élevez brièvement les hydrogels à mi-chemin de la stérilisation à l’aide d’une pince pour vous assurer que le dessous de la puce de verre et l’hydrogel sont en contact avec l’éthanol. Retirez ensuite l’éthanol et laissez les hydrogels sécher à l’air libre pendant 10 minutes.
Lavez les hydrogels trois fois dans du PBS stérile pendant 10 minutes chacune pour éliminer l’éthanol résiduel et réhydrater les hydrogels. Des images en champ clair de myoblastes primaires des muscles squelettiques de souris ont montré que le guidage nanotopographique anisotrope de la fibro de collagène favorise l’alignement cellulaire.
