הכנת דגימת קריוגן מתמודדת עם אתגרים שיכולים להגביל את יעילותה, במיוחד פיזור חלקיקים לא אחיד. בעיה זו מובילה לעתים קרובות לרזולוציה ירודה ולדיוק מופחת במבני חלבון חדשים. גישות ניסיוניות שונות משמשות להתגברות על התפלגות חלקיקים לא אחידה, כולל הוספת חומרי ניקוי או חיקוי ממברנה לדגימה, שינוי סרט התמיכה ברשת והטיית שלב ספציפי במהלך איסוף הנתונים.
פרוטוקול זה מנתח שיטה מעשית פשוטה לטיפול בהתפלגות חלקיקים לא אחידה באמצעות אופטימיזציה של הכנת הדגימה, ומספק את ההתייחסות שלנו לחוקרים להמחיש ביעילות מבנים מקרומולקולות באמצעות קריוגן. כדי להתחיל, אסוף את שברי החלבון המאוגדים המכילים חלבון הלם חום קטן MJ 16.5. השתמש במסננים צנטריפוגליים עם חתך משקל מולקולרי של 50 קילו-דלטון כדי לרכז את השברים בארבע מעלות צלזיוס עד כ-65 מיליגרם.
לאחר הריכוז, צנטריפוגה את הדגימה ב-16,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר אגרגטים. יש לצרף 50 נפחי מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינורות PCR בעלי דופן דקה של 0.2 מיליליטר. למיקרוסקופ אלקטרונים הולכה, הפשירו שני צינורות חלבון קפואים על קרח.
לאחר ההפשרה, החלק את הצינור מספר פעמים כדי לערבב. לאחר מכן צנטריפוגה את תמיסת החלבון ב -16, 000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר אגרגטים. לאחר מכן, הזרקו את הסופרנטנט לעמודת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל ואספו שברי פליטה של 0.5 מיליליטר.
אסוף את השברים האלוציאניים המתאימים לשיא, המציגים את הספיגה האולטרה סגולה הגבוהה ביותר ב-280 ננומטר. להחלפת חיץ, בעזרת זוג מספריים, חותכים קרום דיאליזה לחתיכות בגודל 30 על 30 מילימטר. דגרו את החלקים במים מזוקקים או בתמיסות חיץ כדי לאזן אותם.
לאחר מכן, הוסף 55 מיקרוליטר מתמיסת החלבון לתא עם כפתורי מיקרודיאליזה של 50 מיקרוליטר. החזק את קרום הדיאליזה אנכית באמצעות מלקחיים וגע בעדינות בקצה אחד של הממברנה בנייר טישו כדי לנקז עודפי נוזלים. מכסים בזהירות את כפתור המיקרודיאליזה בקרום.
הנח את טבעת ה-O על גבי קרום הדיאליזה וגלגל אותה בעדינות לתוך החריץ בקצה הכפתור. טבלו כל כפתור דיאליזה בכוס נפרדת המכילה את מאגר היעד כשצד הממברנה פונה כלפי מעלה. השתמש במזרק עם מחט דקה כדי לנקב בזהירות את הממברנה ולשחזר את תמיסת החלבון מתא המיקרודיאליזה.
טען חמישה מיקרוליטר מהדגימה בריכוז של 20 עד 120 ננוגרם למיליליטר על רשת פריקת זוהר. הכינו שלוש טיפות מים של 50 מיקרוליטר כל אחת על דף סרט פרפין. שפשפו את משטח הרשת בטיפות המים כדי לשטוף את הדגימה.
כעת טען חמישה מיקרוליטר של תמיסת אצטט משתנה מסוננת של 1% על הרשת, והסר מיד את תמיסת אצטט המשתנה. טען עוד חמישה מיקרוליטרים של תמיסת אצטט המשתנה על הרשת. גע בעדינות בצד הפינצטה של הרשת עם נייר סינון כדי להסיר תמיסת כתמים עודפת ולתת לרשת להתייבש.
התקן את הפינצטה ומכלול רשת הפריקה הזוהרת על המכשיר. לאחר מכן טען ארבעה מיקרוליטר מהדגימה על צד הפחמן של הרשת. התחל את תהליך הקפאת הצלילה.
כדי להכין את הרשתות לטעינה על מיקרוסקופ אלקטרוני השידור, או TEM, הנח תחילה קופסת רשת המכילה רשתות מזוגגות בתחנת ההרכבה של הרשת האוטומטית ופתח את המכסה של קופסת רשת המכילה רשתות מזוגגות. הנח את טבעת הרשת האוטומטית בחלל החיתוך המיועד בתחנת ההרכבה. הזיזו בזהירות את הרשת המזוגגת מתיבת הרשת והתאימו אותה לטבעת הרשת האוטומטית.
כעת יישר את הדיסק כדי למקם את הפתח העגול על גבי טבעת הרשת האוטומטית ומכלול הרשת. כדי לקבע את הרשת בטבעת הרשת האוטומטית, הנח את כלי הכנסת קליפ C על גבי הרשת ולחץ בעדינות כלפי מטה כדי להדק את קליפ C בפנים. סובב את הדיסק לאחור והעבר את הרשתות המורכבות לתוך תיבת האחסון של הרשת האוטומטית.
הרכיבו את עמדת טעינת הקלטות וקררו אותה עם חנקן נוזלי. הנח את קופסת האחסון האוטומטית בתחנת הטעינה. העבר את מכלול הרשת מתיבת האחסון של הרשת האוטומטית אל הקלטת.
השתמש בידית כדי למקם את הקסטה בקפסולת הטעינה האוטומטית. בדוק את הסיכה בטעינה האוטומטית כדי לאשר את תנועתו החופשית ולוודא שהוא אינו קפוא. הצטברות חלקיקים במערכים נצפתה בכל הרשתות שנבדקו ללא קשר לתנאי החיץ או לשינויים במטען פני השטח.
ריכוז חלבון גבוה יותר בשילוב עם רשתות טעונות שלילית בתשעה מילי-מולרי של מאפיור, 50 מילי-מולרי של נתרן כלורי ו-0.1 מילי-מולרי של מאגר EDTA הביא לפיזור הרצוי של חלקיקים בודדים בתוך חורי הרשת, והפחית את היווצרות מערך החלבונים. מצב אופטימלי זה הוביל לערך יחס שטח FSC חרוטי גבוה של 0.80 וערך SCF של 0.859, המאשר התפלגות חלקיקים אחידה.
