הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM

הפונקציות של חלבונים הן תלויות טמפרטורה והן אופטימליות בטמפרטורה. פרוטוקול זה מספק דרך לפתור מבנים חלבוניים בטמפרטורות גבוהות יותר. גישה זו יכולה לספק מבנים רלוונטיים מבחינה פונקציונלית ולשפר את ההבנה של התלות בטמפרטורה של מבנים חלבוניים.

מי שידגים את ההליך יהיה יואן-צ'יה צ'אנג, מנהל המתקן של האקדמיה סיניקה קריו EM. התחל על ידי יצירת חור של סנטימטר אחד בצינור צנטריפוגה של 50 מ"מ בקצה הסגור שלו. מקם את הצינור בתא מנגנון הוויטריפיקציה בשקע המים העל-קולי.

הגדר את טמפרטורת מנגנון הוויטריפיקציה לטמפרטורה שצוינה, ואפשר לתא מנגנון הוויטריפיקציה להגיע ל-55 מעלות צלזיוס וללחות יחסית של 100%. תן לו לעמוד לפחות חצי שעה כדי לייצב את התנאים לפני תחילת הניסוי. מניחים את אמבט המים על פלטה חמה ומכוונים את הצלחת החמה לטמפרטורה הרצויה.

בדוק עם מדחום כדי לוודא שהמים מגיעים ל -55 מעלות צלזיוס. דגירה של הדגימה באמבט המים, ומחממים מראש את קצה הפיפטה בקצה הפלטה החמה במשך שתי דקות או יותר לפני ניסוי ההכתמה. זוהר לפרוק רשת נתמכת פחמן חורי ב 25 מיליאמפר במשך 30 שניות.

הכניסו את נייר הסינון של הוויטריפיקציה לתא מנגנון הוויטריפיקציה לא לפני חמש דקות לפני ניסוי ההכתמה. לדגום את הפינצטה עם הרשת במנגנון vitrification במשך שתי דקות או יותר. בנה את מיכל האתאן עם אתאן על פי נהלים סטנדרטיים, כדי להבטיח שהאתאן לא יעלה על גדותיו.

השתמש פיפטה כדי להחיל שבעה עד תשעה microliters של הדגימה על הרשת. לאחר מכן המתן שנייה עד שתיים, הכתם למשך שנייה עד שנייה וחצי, וצלל במהירות את הדגימה לתוך אתאן נוזלי. מעבירים את הרשת מאתאן נוזלי לקופסת הקריו המאוחסנת בחנקן נוזלי.

גזור את הרשתות ופורק אותן כדי לרכוש מיקרוסקופ אלקטרונים או מכשיר Cryo EM. השתמש במסך התצוגה של מכשיר ה- Cryo EM ובפונקציית המינון הנמוך של התוכנה, כדי לסנן את מצב הקרח ברשת ואת התפלגות הדגימה ברשת. אם איכות הרשת המתקבלת אינה טובה, חזור על תהליך הכנת הרשת בתנאים מגוונים כגון זמן המתנה, זמן הכתמה וכו '.

אם איכות הרשת המתקבלת טובה, חזור על אותם שלבים כדי ליצור רשתות בטמפרטורה שונה. העבר את הרשתות באיכות טובה למכשיר Cryo EM ברזולוציה גבוהה. ביצוע איסוף נתונים וניתוח נתונים על פי נהלים שנקבעו.

במקרה של הרשת המוצלחת, נוצר שיפוע קרח עם קרח עבה יותר בפינה השמאלית העליונה של הרשת וקרח דק יותר בפינה הימנית התחתונה. קופסאות כחולות וירוקות המתאימות לאיסוף נתונים נצפו ברשת המוצלחת. ניגוד בהיר נצפה ברשת השנייה.

מציין שכבה דקה, של קרח או היעדר קרח. רק שני ריבועים נמצאו מתאימים לאיסוף נתונים ברשת השנייה. אחת הרשתות כללה קרח בעיקר בצורת גבישין, שלא היה מתאים לאיסוף נתונים.

מצד שני, הרשת השנייה הראתה ששכבת הקרח נמצאת ברובה במצב אמורפי המתאים לאיסוף נתונים. הכנת המיכל ואחרים צריכה להיות שלמה על פי נקודת זמן. בקרת זמן וסיום הניסוי במהירות ובדייקנות הם החשובים ביותר.

בהתאם לתוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה, ייתכן שהחוקר יצטרך להיות זהיר יותר בהגדרת התנאים הפשוטים.