הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

אנו מציגים פרוטוקול פשוט להדמיה של גליקוקונוגטים סיאליליים תוך-תאיים ברזולוציה מרחבית גבוהה, ומבטלים את הצורך בציוד מיוחד. שיטה זו מקלה על חקר הביוסינתזה, הסחר והמיחזור בהקשרים פתולוגיים שונים. כדי להשיג זאת, אנו משלבים תיוג מטבולי, כימיה בקליק ומיקרוסקופ הרחבה.

טכניקות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה כמו STED ו-STORM מאפשרות למדענים להתעלות על מחסום העקיפה, אך הן דורשות ציוד יקר. לאחרונה, מיקרוסקופ הרחבה התגלה כחלופה נגישה יותר המשפרת את הרזולוציה על ידי הגדלה פיזית של הדגימה. ניתן להשתמש בשיטה זו עם כל מיקרוסקופים שגרתיים עם משאבים מלאים.

זה לא דורש מיקרוסקופים ברזולוציה סופר, שהם יקרים, גוזלים זמן, קשים לגישה ודורשים אופטימיזציה נרחבת. לכן, שיטה זו ניתנת להעברה בקלות לרוב המעבדות. כדי להתחיל, הוסף מיליליטר אחד של מדיום בתוספת 500 מיקרו-מולרי N-azidoacetylmanosamine לתאים המוכנים, ודגר במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני.

לאחר מכן, שטפו את הדגימות עם מיליליטר אחד של PBS. בעזרת 500 מיקרוליטר של 5% פרפורמלדהיד, מקבעים את התאים על כל החלקת כיסוי ומניחים להם לנוח במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו תא לח בהתאמה אישית באמצעות קופסה אטומה עם מכסה.

הניחו פיסת נייר סופג רטובה בתחתית, ואז הניחו שכבה של פרפילם מעל. הנח את החלקות הכיסוי על הפרפילם כשהתאים פונים כלפי מעלה. לחדירות תאים, הוסף 200 מיקרוליטר של 0.5% Triton X-100 ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS. הכן מאגר תגובה CuAAC כדי לתייג את הגליקנים הסיאליליים שעברו שינוי באזיד שהונדסו באמצעות הרכיבים הנתונים. כדי ליזום את התגובה, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר CuAAC לכל החלקת כיסוי וכסה את הדגימה ביסודיות.

לאחר מכן, שטפו את החלקות הכיסוי שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS כדי לעצור את התגובה ולהסיר עודפי בדיקה וריאגנטים. דגרו את הדגימות למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס ב-200 מיקרוליטר של מאגר חוסם BSA. הוסיפו 70 מיקרוליטר מהתמיסה המכילה את הנוגדן העיקרי להחלקות הכיסוי ודגרו למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס מוגנות מפני אור.

לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר של הנוגדן המשני הפלואורסצנטי לכל החלקת כיסוי ודגרו למשך שעה בטמפרטורת החדר מוגנת מאור. לאחר שטיפת החלקות הכיסוי שלוש פעמים עם PBS, העבירו את פתקי הכיסוי לצלחת של שש בארות ואחסנו את הדגימות בשני מיליליטר PBS בארבע מעלות צלזיוס למשך מספר ימים מוגנים מפני אור. כדי להתחיל, דגרו את תאי האימונוסטיין עם n-Acryloylsuccinimide בריכוז של 3.2 מיליגרם למיליליטר ב-PBS על שייקר מכני למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS. כעת, הניחו טיפה של 70 מיקרוליטר של תמיסת מונומר על פיסת פרפילם. מוסיפים 1.4 מיקרוליטר של 10% N, N, N'N'Tetramethylethylenediamine ו-10% אמוניום פרסולפט, ואז מערבבים אותם לטיפה.

הנח במהירות את החלקת הכיסוי על התמיסה כשהתאים פונים כלפי מטה. אפשר לתמיסה להתפלמר במשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של חיץ עיכול להידרוג'ל ואפשרו לעיכול להמשיך במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על שייקר מכני.

לאחר הסרת מאגר העיכול, יש לשטוף את הג'ל שלוש פעמים בשני מיליליטר מים נטולי יונים. כעת, השאירו את ההידרוג'ל להתרחב בשלושה מיליליטר מים נטולי יונים למשך שעתיים, והחליפו את המים כל 30 דקות. כדי להתחיל, הפעל את המיקרוסקופ וודא שמקורות האור מתחממים.

לאחר מכן, פתח את תוכנת רכישת ההדמיה הביולוגית. כדי ליצור את הערוצים, בחר את אורכי הגל של עירור הלייזר המתאימים לפלואורופורים והפעל את הלייזרים בהתאם. בחר עדשת מטרה מתאימה כגון אובייקט טבילה בשמן 63x עם צמצם מספרי של 1.4 או שווה ערך.

כעת, הנח ואבטח החלקת כיסוי בקוטר 32 מילימטר במחזיק המותאם למיקרוסקופ. הנח את דגימת התא החיסוני עם תאים הפונים כלפי מטה על החלקת הכיסוי של 32 מילימטר והוסף טיפת מים נטולי יונים כדי למנוע את התייבשות הדגימה. לאחר מכן, הנח את המחזיק עם החלקת הכיסוי על שלב המיקרוסקופ מעל המטרה.

להדמיה לאחר הרחבה, הנח הידרוג'ל על החלקת הכיסוי ובצע סריקת אריחים. השתמש במצב פלואורסצנטי של Brightfield או Low Laser Intensity כדי לאתר אזור עניין ולמקד אותו. לאחר מכן, הגדר את פרמטרי רכישת התמונה כגון מהירות סריקה, מספר ממוצע, כיוון, מצב סריקה, שיטה וגודל חור כדי להשיג את התצפית הרצויה.

כעת, דמיין את התאים בתוכנה באמצעות מצב פלואורסצנטי חי. הגדל בהדרגה את עוצמת הלייזר והתאם את הרווח וההיסט של הגלאי כדי להגביר את האות מבלי להכניס רעש מוגזם, מה שמבטיח הדמיה פלואורסצנטית ברורה ללא חשיפת יתר. לבסוף, בצע את רכישת התמונה ושמור את הנתונים בפורמט הרצוי, תוך הקפדה על הכללת מטא נתונים מתאימים לעיון עתידי.

לאחר השלמת הרכישה, הוסף כמות קטנה של מים נטולי יונים כדי להקל על ההעברה באמצעות פינצטה ולהעביר את הדגימה בחזרה לצלחת שש הבארות. קוטר הגרעין הממוצע של חמוס גדל מ-17.7 מיקרומטר לפני ההתפשטות ל-70.3 מיקרומטר לאחר ההתפשטות, מה שמצביע על מקדם התפשטות של ארבעה. דפוס סימון הפיברובלסטים לפני מיקרוסקופ ההתפשטות הראה פלואורסצנטיות בולטת באדום וירוק המציינת פרטים תת-תאיים במנגנון גולגי, אך ברזולוציה מוגבלת, מה שמנע ניתוח מוות.

לאחר מיקרוסקופ הרחבה, נצפתה רזולוציה מרחבית משופרת משמעותית של מבנים תת-תאיים עם שלפוחיות ירוקות ואדומות מורכבות יותר הנראות בתוך תאי הפיברובלסטים.