私たちは、細胞内シアリル化複合糖質を高い空間分解能で可視化するための簡単なプロトコルを提示し、特別な機器の必要性を排除します。この方法は、さまざまな病理学的状況での生合成、密輸、およびリサイクルの研究を容易にします。これを達成するために、代謝標識、クリックケミストリー、および拡大顕微鏡法を組み合わせています。
STEDやSTORMのような超解像顕微鏡技術により、科学者は回折の壁を突破することができますが、高価な機器が必要です。最近、拡張顕微鏡は、サンプルを物理的に拡大することによって解像度を向上させる、よりアクセスしやすい代替手段として浮上しています。この方法は、あらゆるルーチンのフルリソース顕微鏡で使用できます。
高価で時間がかかり、アクセスが難しく、広範な最適化が必要な超解像顕微鏡は必要ありません。したがって、この方法はほとんどの研究室に簡単に転用できます。まず、調製した細胞に500マイクロモルのN-アジドアセチルマンノサミンを添加した1ミリリットルの培地を加え、5%の二酸化炭素雰囲気下で摂氏37度で24時間インキュベートします。
次に、サンプルを1ミリリットルのPBSで洗浄します。500マイクロリットルの5%パラホルムアルデヒドを使用して、各カバースリップの細胞を固定し、室温で15分間休ませます。次に、蓋付きの不透明なボックスを使用してカスタムの湿度チャンバーを準備します。
濡れたあぶらとり紙を底に置き、その上にパラフィルムの層を置きます。セルを上に向けてパラフィルムにカバースリップを置きます。細胞の透過化には、0.5%Triton X-100をPBSに200マイクロリットル加え、室温で15分間添加します。
次に、200マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄します。CuAAC反応バッファーを調製し、所定の成分を使用して操作されたアジド修飾シアル化糖鎖を標識します。反応を開始するには、各カバースリップに200マイクロリットルのCuAACバッファーを追加し、サンプルを完全に覆います。
その後、カバースリップを200マイクロリットルのPBSで3回洗浄して反応を停止し、余分なプローブと試薬を取り除きます。サンプルを摂氏4度で1時間、200マイクロリットルのBSAブロッキングバッファーでインキュベートします。一次抗体を含む溶液70μLをカバースリップに加え、4°Cで1時間インキュベートします。
次に、100 μLの蛍光二次抗体を各カバースリップに加え、室温で光から保護して1時間インキュベートします。カバースリップをPBSで3回洗浄した後、カバースリップを6ウェルプレートに移し、サンプルを4°Cの2ミリリットルのPBSに数日間、光から保護して保存します。まず、免疫染色細胞をn-アクリロイルスクシンイミドとn-アクリロイルスクシンイミドとPBS中濃度3.2ミリグラム/ミリリットルで、機械式シェーカーで室温で1時間インキュベートします。
次に、サンプルを1ミリリットルのPBSで3回洗浄します。次に、70マイクロリットルのモノマー溶液をパラフィルムの上に置きます。10%N、N、N'N'テトラメチルエチレンジアミンと10%過硫酸アンモニウムの1.4マイクロリットルを加え、次にそれらを滴に混ぜます。
セルを下に向けて、カバースリップを溶液にすばやく置きます。溶液を湿ったチャンバー内で室温で1時間重合させます。次に、1ミリリットルの消化緩衝液をハイドロゲルに加え、機械式シェーカーで摂氏37度で3時間分解を進めます。
消化緩衝液を取り除いた後、ゲルを2ミリリットルの脱イオン水で3回洗浄します。次に、ヒドロゲルを3ミリリットルの脱イオン水で2時間膨張させ、30分ごとに水を交換します。まず、顕微鏡の電源を入れ、光源が温まっていることを確認します。
次に、バイオイメージング取得ソフトウェアを開きます。チャンネルを作成するには、蛍光色素に対応するレーザー励起波長を選択し、それに応じてレーザーを活性化します。開口数が1.4の63倍油浸対物レンズまたは同等の対物レンズなど、適切な対物レンズを選択してください。
次に、直径32mmのカバースリップを顕微鏡に適合したホルダーに置き、固定します。免疫染色細胞サンプルを下向きにして32 mmカバースリップに置き、脱イオン水を一滴加えてサンプルの乾燥を防ぎます。次に、カバースリップ付きのホルダーを対物レンズの上の顕微鏡ステージに置きます。
拡大後のイメージングでは、カバースリップにハイドロゲルをセットし、タイルスキャンを行います。明視野または低レーザー強度蛍光モードを使用して、関心のある領域を特定し、焦点を合わせます。次に、スキャン速度、平均化数、方向、スキャンモード、方法、ピンホールサイズなどの画像取得パラメータを設定して、目的の観察を実現します。
次に、Live Fluorescenceモードを使用してソフトウェアで細胞を可視化します。レーザー出力を徐々に増やし、検出器のゲインとオフセットを調整して、過度のノイズを導入せずに信号を増幅し、過度の露出なしに鮮明な蛍光の視覚化を確保します。最後に、画像取得を実行し、データを目的の形式で保存し、将来の参照用に適切なメタデータが含まれていることを確認します。
取得が完了したら、ピンセットを使用して移し替えを容易にするために少量の脱イオン水を加え、サンプルを6ウェルプレートに戻します。フェレット核の平均直径は、膨張前の17.7マイクロメートルから膨張後の70.3マイクロメートルに増加し、膨張係数が4であることを示しています。拡大顕微鏡法前の線維芽細胞のマーキングパターンは、ゴルジ装置の細胞内の詳細を示す顕著な赤色と緑色の蛍光を示したが、分解能は限られており、死後の分析を妨げていた。
拡大顕微鏡法の後、線維芽細胞内にはより複雑な緑色と赤色の小胞が見えるようになり、細胞内構造の空間分解能が大幅に向上したことが観察されました。
