Nous présentons un protocole simple pour visualiser les glycoconjugués sialylés intracellulaires avec une haute résolution spatiale, éliminant ainsi le besoin d’équipement spécialisé. Cette méthode facilite l’étude de la biosynthèse, du trafic et du recyclage dans divers contextes pathologiques. Pour y parvenir, nous combinons le marquage métabolique, la chimie clic et la microscopie à expansion.
Les techniques de microscopie à super-résolution comme STED et STORM permettent aux scientifiques de dépasser la barrière de diffraction, mais elles nécessitent un équipement coûteux. Récemment, le microscope à expansion est apparu comme une alternative plus accessible qui améliore la résolution en agrandissant physiquement l’échantillon. Cette méthode peut être utilisée avec n’importe quel microscope de routine à ressources complètes.
Il ne nécessite pas de microscopes à super résolution, qui sont coûteux, prennent du temps, sont difficiles d’accès et nécessitent une optimisation importante. Par conséquent, cette méthode est facilement transférable à la plupart des laboratoires. Pour commencer, ajoutez un millilitre de milieu complété par 500 micromolaires de N-azidoacétylmannosamine aux cellules préparées, et incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius sous une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 %.
Ensuite, lavez les échantillons avec un millilitre de PBS. À l’aide de 500 microlitres de paraformaldéhyde à 5 %, fixez les cellules sur chaque lamelle et laissez-les reposer pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, préparez une chambre humide personnalisée à l’aide d’une boîte opaque avec un couvercle.
Placez un morceau de papier buvard humide au fond, puis déposez une couche de parafilm sur le dessus. Placez les lamelles sur le parafilm avec les cellules vers le haut. Pour la perméabilisation cellulaire, ajoutez 200 microlitres de Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante.
Ensuite, lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de PBS. Préparez un tampon de réaction CuAAC pour marquer les glycanes sialylés modifiés à l’azoture modifiés à l’aide des composants donnés. Pour amorcer la réaction, ajoutez 200 microlitres de tampon CuAAC à chaque lamelle de recouvrement et couvrez soigneusement l’échantillon.
Ensuite, lavez les lamelles trois fois avec 200 microlitres de PBS pour arrêter la réaction et éliminer l’excès de sonde et de réactifs. Incuber les échantillons pendant une heure à quatre degrés Celsius dans 200 microlitres de tampon de blocage BSA. Ajoutez 70 microlitres de la solution contenant l’anticorps primaire dans les lamelles et incubez pendant une heure à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’anticorps secondaire fluorescent dans chaque lamelle et incubez pendant une heure à température ambiante à l’abri de la lumière. Après avoir lavé les lamelles trois fois avec du PBS, transférez-les sur une plaque à six puits et stockez les échantillons dans deux millilitres de PBS à quatre degrés Celsius pendant quelques jours à l’abri de la lumière. Pour commencer, incubez les cellules d’immunocoloration avec du n-Acryloylsuccinimide à une concentration de 3,2 milligrammes par millilitre dans du PBS sur un agitateur mécanique pendant une heure à température ambiante.
Ensuite, lavez les échantillons trois fois avec un millilitre de PBS. Maintenant, placez une goutte de 70 microlitres de solution de monomère sur un morceau de parafilm. Ajoutez 1,4 microlitre de 10 % de N, N, N’n’Tétraméthyléthylènediamine et 10 % de persulfate d’ammonium, puis mélangez-les à la goutte.
Placez rapidement la lamelle sur la solution avec les cellules vers le bas. Laisser la solution polymériser pendant une heure à température ambiante dans une chambre humide. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de digestion à l’hydrogel et laissez la digestion se poursuivre pendant trois heures à 37 degrés Celsius sur un agitateur mécanique.
Après avoir retiré le tampon de digestion, lavez le gel trois fois avec deux millilitres d’eau déminéralisée. Maintenant, laissez l’hydrogel se dilater dans trois millilitres d’eau déminéralisée pendant deux heures, en changeant l’eau toutes les 30 minutes. Pour commencer, allumez le microscope et assurez-vous que les sources lumineuses sont réchauffées.
Ensuite, ouvrez le logiciel d’acquisition de bioimagerie. Pour créer les canaux, sélectionnez les longueurs d’onde d’excitation laser correspondant aux fluorophores et activez les lasers en conséquence. Sélectionnez un objectif approprié, tel qu’un objectif à immersion dans l’huile 63x avec une ouverture numérique de 1,4 ou équivalent.
Maintenant, placez et fixez une lamelle de 32 millimètres de diamètre dans un support adapté au microscope. Placez l’échantillon de cellules d’immunocoloration avec les cellules vers le bas sur la lamelle de 32 millimètres et ajoutez une goutte d’eau désionisée pour éviter que l’échantillon ne se dessèche. Ensuite, placez le support avec la lamelle sur la platine du microscope au-dessus de l’objectif.
Pour l’imagerie post-expansion, placez de l’hydrogel sur la lamelle et effectuez un balayage de tuiles. Utilisez le mode de fluorescence à fond clair ou à faible intensité laser pour localiser une zone d’intérêt et la mettre au point. Ensuite, définissez les paramètres d’acquisition d’image tels que la vitesse de balayage, le nombre moyen, la direction, le mode de balayage, la méthode et la taille du sténopé pour obtenir l’observation souhaitée.
Maintenant, visualisez les cellules dans le logiciel en utilisant le mode de fluorescence en direct. Augmentez progressivement la puissance du laser et ajustez le gain et le décalage du détecteur pour amplifier le signal sans introduire de bruit excessif, assurant une visualisation claire de la fluorescence sans surexposition. Enfin, effectuez l’acquisition de l’image et enregistrez les données dans le format souhaité, en veillant à inclure les métadonnées appropriées pour référence future.
Une fois l’acquisition terminée, ajoutez une petite quantité d’eau désionisée pour faciliter le transfert à l’aide d’une pince à épiler et transférez l’échantillon dans la plaque à six puits. Le diamètre moyen du noyau de Feret est passé de 17,7 micromètres avant l’expansion à 70,3 micromètres après l’expansion, ce qui indique un facteur d’expansion de quatre. Le motif de marquage des fibroblastes avant la microscopie à expansion a montré une fluorescence rouge et verte proéminente indiquant des détails subcellulaires dans l’appareil de Golgi, mais avec une résolution limitée, empêchant l’analyse dans la mort.
Après la microscopie à expansion, une résolution spatiale significativement améliorée des structures subcellulaires a été observée avec des vésicules vertes et rouges plus complexes visibles dans les cellules fibroblastiques.
