Presentiamo un protocollo semplice per la visualizzazione dei glicoconiugati sialilati intracellulari con un'elevata risoluzione spaziale, eliminando la necessità di apparecchiature specializzate. Questo metodo facilita lo studio della biosintesi, del traffico e del riciclaggio in vari contesti patologici. Per raggiungere questo obiettivo, combiniamo la marcatura metabolica, la chimica a scatto e la microscopia ad espansione.
Le tecniche di microscopia a super-risoluzione come STED e STORM consentono agli scienziati di superare la barriera della diffrazione, ma richiedono attrezzature costose. Recentemente, il microscopio ad espansione è emerso come un'alternativa più accessibile che migliora la risoluzione ingrandendo fisicamente il campione. Questo metodo può essere utilizzato con qualsiasi microscopio di routine a risorse complete.
Non richiede microscopi a super risoluzione, che sono costosi, richiedono tempo, sono di difficile accesso e richiedono un'ampia ottimizzazione. Pertanto, questo metodo è facilmente trasferibile alla maggior parte dei laboratori. Per iniziare, aggiungere un millilitro di terreno integrato con 500 micromolari di N-azidoacetilmannosamina alle cellule preparate e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5%.
Quindi, lavare i campioni con un millilitro di PBS. Utilizzando 500 microlitri di paraformaldeide al 5%, fissare le cellule su ogni vetrino coprioggetti e lasciarle riposare per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, prepara una camera umida personalizzata utilizzando una scatola opaca con coperchio.
Posiziona un pezzo di carta assorbente bagnato sul fondo, quindi stendi sopra uno strato di parafilm. Posizionare i vetrini coprioggetto sul parafilm con le celle rivolte verso l'alto. Per la permeabilizzazione cellulare, aggiungere 200 microlitri di Triton X-100 allo 0,5% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di PBS. Preparare un tampone di reazione CuAAC per marcare i glicani sialilati modificati con azide ingegnerizzati utilizzando i componenti indicati. Per avviare la reazione, aggiungere 200 microlitri di tampone CuAAC a ciascun vetrino coprioggetto e coprire accuratamente il campione.
Quindi, lavare i vetrini coprioggetti tre volte con 200 microlitri di PBS per fermare la reazione e rimuovere la sonda e i reagenti in eccesso. Incubare i campioni per un'ora a quattro gradi Celsius in 200 microlitri di tampone bloccante BSA. Aggiungere 70 microlitri della soluzione contenente l'anticorpo primario ai vetrini coprioggetti e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce.
Quindi, aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario fluorescente a ciascun vetrino di copertura e incubare per un'ora a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Dopo aver lavato i vetrini coprioggetto tre volte con PBS, trasferire i vetrini coprioggetto in una piastra a sei pozzetti e conservare i campioni in due millilitri di PBS a quattro gradi Celsius per alcuni giorni al riparo dalla luce. Per iniziare, incubare le cellule immunocoloranti con n-acriloilsuccinimide a una concentrazione di 3,2 milligrammi per millilitro in PBS su un agitatore meccanico per un'ora a temperatura ambiente.
Quindi, lavare i campioni tre volte con un millilitro di PBS. Ora, metti una goccia da 70 microlitri di soluzione monomerica su un pezzo di parafilm. Aggiungere 1,4 microlitri di tetrametiletilendiammina al 10% di N, N, N'N' e persolfato di ammonio al 10%, quindi mescolarli alla goccia.
Posizionare rapidamente il vetrino coprioggetti sulla soluzione con le celle rivolte verso il basso. Lasciare polimerizzare la soluzione per un'ora a temperatura ambiente in una camera umida. Quindi, aggiungi un millilitro di tampone di digestione all'idrogel e lascia che la digestione proceda per tre ore a 37 gradi Celsius su uno shaker meccanico.
Dopo aver rimosso il tampone digestivo, lavare il gel tre volte con due millilitri di acqua deionizzata. Ora, lasciare che l'idrogel si espanda in tre millilitri di acqua deionizzata per due ore, cambiando l'acqua ogni 30 minuti. Per iniziare, accendi il microscopio e assicurati che le fonti di luce siano riscaldate.
Quindi, apri il software di acquisizione Bioimaging. Per creare i canali, selezionare le lunghezze d'onda di eccitazione del laser corrispondenti ai fluorofori e attivare i laser di conseguenza. Selezionare un obiettivo appropriato, ad esempio un obiettivo a immersione in olio 63x con apertura numerica di 1,4 o equivalente.
A questo punto, posizionare e fissare un vetrino coprioggetti di 32 millimetri di diametro in un supporto adatto al microscopio. Posizionare il campione di cellule immunocoloranti con le cellule rivolte verso il basso sul vetrino coprioggetti da 32 millimetri e aggiungere una goccia di acqua deionizzata per evitare che il campione si secchi. Quindi, posizionare il supporto con il vetrino coprioggetto sul tavolino del microscopio sopra l'obiettivo.
Per l'imaging post-espansione, posizionare l'idrogel sul vetrino coprioggetti ed eseguire una scansione delle piastrelle. Utilizzare la modalità campo chiaro o fluorescenza a bassa intensità laser per individuare un'area di interesse e metterla a fuoco. Quindi, impostare i parametri di acquisizione dell'immagine come la velocità di scansione, il numero di media, la direzione, la modalità di scansione, il metodo e le dimensioni del foro stenopeico per ottenere l'osservazione desiderata.
Ora, visualizza le cellule nel software utilizzando la modalità Live Fluorescence. Aumentare gradualmente la potenza del laser e regolare il guadagno e l'offset del rivelatore per amplificare il segnale senza introdurre rumore eccessivo, garantendo una chiara visualizzazione della fluorescenza senza sovraesposizione. Infine, eseguire l'acquisizione dell'immagine e salvare i dati nel formato desiderato, assicurandosi di includere i metadati corretti per riferimento futuro.
Una volta completata l'acquisizione, aggiungere una piccola quantità di acqua deionizzata per facilitare il trasferimento utilizzando una pinzetta e trasferire nuovamente il campione nella piastra a sei pozzetti. Il diametro medio del nucleo di Feret è aumentato da 17,7 micrometri prima dell'espansione a 70,3 micrometri dopo l'espansione, indicando un fattore di espansione di quattro. Il pattern di marcatura dei fibroblasti prima della microscopia ad espansione ha mostrato una fluorescenza rossa e verde prominente che indicava dettagli subcellulari nell'apparato di Golgi, ma con risoluzione limitata, impedendo l'analisi in-death.
Dopo la microscopia ad espansione, è stata osservata una risoluzione spaziale significativamente migliorata delle strutture subcellulari con vescicole verdi e rosse più intricate visibili all'interno delle cellule dei fibroblasti.
