פיתחנו שיטה כרומטוגרפית מהירה המפרידה בין רכיבי תגובת IVT, וניתן להשתמש בה לניטור צריכת NTP וייצור mRNA. בשיטה זו אנו יכולים לייעל את תגובת IVT, למקסם את תפוקת ה-mRNA תוך מזעור היווצרות זיהומים בתהליך ועלות התגובה. המתודולוגיה שלנו הייתה חלוצית בתחום ה-mRNA, והראתה כיצד צימוד נתונים אנליטיים של תגובת IVT יכול להוביל לתשואות גבוהות יותר ולעלויות נמוכות יותר.
התחום בוחן כעת כלים אנליטיים אחרים של תהליכים מוטבעים, כגון ספקטרוסקופיה של ראמאן, אך הכרומטוגרפיה עדיין שומרת על מקום מרכזי בשל כוח הפתרון והמהירות הגבוהה שלה. הראינו כיצד ללכוד כלים אנליטיים בעלי תפוקה גבוהה עם תכנון תוכנת ניסוי כדי לבצע אופטימיזציה מקיפה של תגובת IVT. זה הוביל לתפוקה המדווחת הגבוהה ביותר של תגובת IVT של 25 גרם לליטר.
השיטה שלנו מאפשרת לנטר את ריכוזי ה-mRNA וה-NTP בו זמנית עם זמני קריאה קצרים, ולכן מתאימה לניטור IVT כמעט בזמן אמת. תחום ה-mRNA מתקדם כעת לקראת המשך ייצור ה-mRNA, ואנו כמובן מפתחים כלים מהדור הבא כדי לתמוך במעבר זה. כדי להתחיל, יש להפשיר ולחמם מראש את כל הריאגנטים, למעט אנזימים, בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בבלוק תרמו המוגדר על 300 סיבובים לדקה.
סמן כל צינור עם שעתוק במבחנה או מספר IVT ונקודת זמן. בזמן שהריאגנטים מפשירים פיפטה שני מיקרוליטרים של 100 מילי-מולרי EDTA לצינורות סטריליים של 0.5 מיליליטר. כעת הוציאו את האנזימים מהמקפיא ואחסנו אותם באופן זמני בצידנית.
הכן 50 עד 100 מיקרוליטר מתערובת התגובה עם נפחים מתאימים של ריאגנטים IVT. הוסף T7 RNA פולימראז כמגיב האחרון כאשר כל ריאגנטים IVT מעורבבים. הסר מיד שני מיקרוליטר מתערובת ה-IVT והכניס אותה לצינורות של 0.5 מיליליטר שהוכנו בעבר המכילים שני מיקרוליטר EDTA.
הניחו את צינורות התגובה המכילים תערובות IVT בבלוק התרמו ודגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בכל נקודת זמן רצויה, הסר שני מיקרוליטרים של דגימת IVT מתערובת התגובה ופיפטה לתוך צינורות המכילים EDTA. לאחר ניתוח כרומטוגרפי המאשר את הדלדול המוחלט של NTPs, הרוו תגובות IVT בתפזורת עם EDTA לריכוז סופי של 50 מילימולר.
לתגובת IVT של Fed-Batch יש לערבב מלאי של כל NTP ומגנזיום כלוריד. לאחר הגדרת התגובה, כאשר ריכוז ה-NTP יורד מתחת ל-10%הוסף נפח מתאים של ההזנה לתגובת IVT בתפזורת. לאחר השגת ייצור ה-mRNA הרצוי, השבת את כל התגובה עם EDTA לריכוז סופי של 50 מילימולר.
עבור מיזוג עמודות, אזנו עמודה אנליטית של 0.1 מיליליטר בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות לפני הניתוח. חבר את העמודה למערכת הכרומטוגרפית, לפי הכיוון המצוין על בית העמוד. לאחר מכן שטפו את העמודה ב-50 נפחי עמודות של מים מזוקקים כפולים ואחריהם 50 נפחי עמודות של MPA בקצב זרימה של מיליליטר לדקה.
לאחר מכן, הפעל לפחות שלוש דגימות ריקות תוך הזרקת MPA בלבד לפני הניתוח כדי לקבוע את קו הבסיס. כעת המשך לנתח את דגימת בדיקת התאמת המערכת ודגימות עקומת הכיול. לבדיקת התאמת המערכת, שלב את NTPs מגיב המכסה, תבנית ה-DNA של הפלסמיד וה-mRNA.
כעת צור את תקן הכיול באמצעות דגימת ה-mRNA המטוהרת המדוללת בריכוז ידוע עם שלב נייד A.במידת הצורך, צור תקנים עם ריכוזי NTP סופיים של 0.5, שתיים, חמש, 10, 15 ו-20 מיקרומולר ליצירת עקומת הכיול עבור כל ה-NTPs. קבע את הדילול המינימלי הדרוש לדגימות IVT באמצעות הנוסחה. לפני הדילול לניתוח כרומטוגרפי, מערבולת וסובב את דגימת ה-IVT המרווה.
פיפטה MPA ונתרן כלורי לבקבוקון זכוכית חרוטית, ולאחר מכן הוסף את דגימת ה-IVT המרווה. מערבל את הדגימה המוכנה וטען אותה לתוך הדגימה האוטומטית, המכוונת לארבע מעלות צלזיוס. הזרקו 25 מיקרוליטר מהדגימה המדוללת על העמודה האנליטית ומדדו את הספיגה ב-260 ו-280 ננומטר עבור כל דגימת IVT.
לאחר השלמת הניתוח של כל דגימות ה-IVT, הזרקו שוב את תקן בדיקת התאמת המערכת כדי לאשר את יציבות המערכת. ניתוח מהיר באינטרנט מאפשר לנטר את ייצור ה-mRNA לאורך זמן. בניסוי זה, השווינו את ההשפעה של הרכב מאגר IVT על קינטיקה של IVT.
IVT שבוצע עם מאגר A הביא לקצב הגבוה ביותר של ייצור mRNA, ואחריו מאגר B ותגובת C.IVT יכולה להתבצע גם כ-Fed-Batch. ניטור צריכת NTPs מאפשר להתאים את הריכוז על ידי הזנת NTPs ומגנזיום כלוריד לתגובה. מכיוון שתוספות מזון מדללות את תגובת ה-IVT, ריכוז ה-mRNA ב-IVT יורד בכל מהדורת הזנה.
