מחקר זה נועד לבסס פרוטוקול יעיל לשימור תכולת דרכי הנשימה של עכברים במודלים של זיהום ריאות. אנו מפתחים את היכולת לענות על השאלה היכן נוחתים נבגי פטריות שנשאפים בריאות. לאחרונה, קבוצות רבות זיהו תפקידים לתאי אפיתל שונים בדרכי הנשימה בחישת זיהומים וייזום תגובות חיסוניות מגנות.
תאי אפיתל אלה נעים בין תאי מועדון בסימפונות לתאי אפיתל מסוג II בנאדיות הסופיות. טכניקת הכנת הריאות הנפוצה היא לנפח את הריאה עם הקיבוע הנוזלי כדי לשמר את רקמת הריאה לניתוחים היסטולוגיים במורד הזרם. עם זאת, טכניקה זו עוקרת תוכן של דרכי הנשימה, כגון נבגי פטריות שנשאפו.
הפרוטוקול שלנו משמר את המיקום הטבעי של נבגי הפטרייה הנשאפים בריאה תוך שמירה על מורפולוגיה ריאתית תקינה באמצעות ניפוח אוויר וקיבוע ריאות תקין באמצעות זלוף כלי דם. אנו מקווים להשתמש בפרוטוקול זה כדי לאפיין את הצמתים הברונכואלבאולרים שבהם נראה שהנבגים נוחתים במודל שלנו, אך נשתמש במיקומי הנבגים בקרבת תאי אפיתל שונים ונחקור את התגובות החיסוניות המתקבלות. כדי להתחיל, יש לצבוע פעם אחת פי 10 בעוצמה של שישה נבגי Coccidioides posadasii עם ריכוז של חמישה מיקרו-מולרים של CFSE למשך 30 דקות ב-30 מעלות צלזיוס.
לאחר הצביעה יש לשטוף את הנבגים עם PBS. צנטריפוגה של הנבגים ב-12,000 גרם והשעתה את הגלולה ב-25 מיקרוליטר PBS לחיסון נבגים בריכוז המתאים. הכן פיפטה עם 25 מיקרוליטר של חיסון הנבגים.
לאחר הרדמת העכבר בצנצנת Nalgene, מקם את העכבר במצב שכיבה ביד אחת ואפשר לו לקחת שלוש עד חמש נשימות מתנשפות רגילות. הנח את קצה הפיפטה בחלק האחורי של אורו-לוע העכבר ושחרר את החיסון במהלך השאיפה. הרגישו פצפוצים בהיבטים האחוריים והקדמיים של בית החזה של העכבר עם היד והאגודל כדי לאשר שאיפת החיסון.
רססו את העכבר המורדם עמוק באתנול 70%. בעזרת מספריים, חותכים בזהירות את עור העכבר, ואז מפרקים אותו כדי לחשוף את הצפק. לאחר מכן, משוך את העור מהחצי העליון מעל ראשו של העכבר, ושחרר את הזרועות.
כעת, חותכים את קרום הצפק בעצם החזה ולאורך ההיבט התחתון של כלוב הצלעות, חושפים את הצפק. עקור את הכבד בצורה נחותה כדי לחשוף את הסרעפת. השתמש במספריים כדי לנקב בזהירות את הסרעפת הרחק מפרנכימת הריאות.
לאחר מכן, חתוך את כלוב הצלעות בצד שמאל כדי לחשוף את הלב. בעזרת מחט בגודל 30, הזרקו חמישה עד 10 מיליליטר PBS לחדר הימני. לאחר הסרת המחט, השתמש במחט חדשה כדי להזריק חמישה מיליליטר של פורמלין ניטרלי 10% לחדר הימני.
בעזרת מספריים, הסר את החצי הקדמי של כלוב הצלעות. כדי לחשוף את קנה הנשימה, חותכים את הצלעות העליונות ועצמות הבריח מימין ומשמאל לצוואר, והימנעו מקו האמצע שבו שוכב קנה הנשימה. בעזרת מלקחיים, אחזו את הצלעות העליונות ועצמות הבריח הנותרות ליד קו האמצע של הצוואר ומשכו בעליונות עד לחשיפת קנה הנשימה.
הכן חוט תפר של 10 סנטימטר ומשוך אותו מתחת לקנה הנשימה. קשרו מראש קשר רופף בקצה התחתון של קנה הנשימה החשוף. לאחר מכן, הכינו מזרק אוויר של מיליליטר אחד עם קטטר בגודל 18.
בעזרת מחט בגודל 18, צור חור בקנה הנשימה בקצה העליון של האזור החשוף. כעת, הכנס את הקטטר לתוך החור, והבטיח התאמה הדוקה כדי למנוע בריחת אוויר. לאחר מכן, הזריק לאט מיליליטר אחד של אוויר לריאות במשך 10 שניות, תוך צפייה בהתנפחות של כל אונות הריאה.
ניפוח מלא מביא לכך שהריאות עוטפות מעט את הלב וממלאות את הנפח התפוס בסרעפת הלא מנוקבת. לאחר בידוד הריאות מהעכבר, הנח אותו על הקצה העליון של צינור חרוטי של 50 מיליליטר מלא ב-20 מיליליטר של פורמלין ניטרלי 10%. הנח את חוטי התפרים מחוץ לצינור, ולאחר מכן הברג את המכסה.
כדי להתחיל, שטפו את ריאות העכבר המבודדות ב-PBS, והניחו אותן בתמיסת PBS של 30% סוכרוז למשך 72 עד 96 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר רקמות עודפות והנח את הריאות ב-Cryomold עם מדיום OCT. הקפיאו את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס.
אזנו את הדגימה בבלוקים קריולוגיים OCT במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני חלוקת הבלוקים בעובי של 20 עד 100 מיקרומטר. אספו חלקים על מגלשת זכוכית והניחו להם להתייבש במשך 30 דקות עד שעה. יש להניח את השקופית באמבט PBS בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי להסיר OCT מהרקמה.
לאחר מכן, השתמש במגבון כדי להסיר טיפות עודפות מהיקף המגלשה סביב דגימת הרקמה. צייר היקף סביב הדגימה על השקופית בעזרת עט PAP הידרופובי והניח לו להתייבש במשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 300 מיקרוליטר של תמיסת חסימה טרייה ללא בעלי חיים על המגלשה ודגרו בטמפרטורת החדר.
כעת, דגרו את המגלשה ב-300 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים EpCAM מצומדת נגד עכברים של Alexa Fluor 647 במהלך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף את השקופית פעמיים עם 300 מיקרוליטר PBS למשך חמש דקות. לאחר הייבוש, הוסף טיפה אחת של אמצעי הרכבה מזכוכית SlowFade רך בטמפרטורת החדר לכל פיסת רקמה.
הנח כיסוי מעל הרקמה, וודא שהיא משתרעת מעבר לדגימה ולהיקף הסמן ההידרופובי. כדי להתחיל, הנח את קטע ריאות העכבר המחוסן בנבגים פטרייתיים מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי רב-ערוצי ובחר מטרה מתאימה. כדי ללכוד את כל אונת הריאה, אסוף מספיק אריחי תמונה ומזג אותם יחד.
באמצעות תוכנת המיקרוסקופ, ייצא את התמונה של כל אונת הריאה לעיבוד במורד הזרם. ב-QuPath, צרו קובץ פרויקט והוסיפו את התמונות הפלואורסצנטיות לקובץ. סווג את הפיקסלים החיוביים ל-EpCAM כאפיתל על-ידי בחירה רציפה בסיווג, סיווג פיקסלים וצור סף.
בחר את הרזולוציה, הערוץ, סיגמת ההחלקה וערך הסף כדי לזהות את אזור היעד. שמור את המסווג תחת שם ייחודי ובחר צור אובייקטים. בחלון החדש יצירת אובייקטים, בחר סוג אובייקט חדש כביאור.
עבור אפיתל ריאות, הגדר את גודל האובייקט המינימלי ואת גודל החור המינימלי ל-100 מיקרומטר רבוע. לאחר בחירת OK, הביאורים ייווצרו וניתן לשנות אותם באמצעות כלי המברשת. כדי לסווג נבגים, חזור על השלבים כפי שהודגם עבור הערות אפיתל הריאה.
לאחר מכן, בחלון יצירת אובייקטים, בחר זיהוי כסוג האובייקט החדש. הגדר את גודל האובייקט המינימלי ואת גודל החור המינימלי לאפס מיקרומטר רבוע ובחר Split objects. לאחר מכן, כדי לבצע ניתוח מרחבי של הנבגים ברצף, בחר ניתוח, ניתוח מרחבי וחשב מרחק חתום לביאורים דו מימדיים.
המרחקים לאפיתל חיובי ל-EpCAM יחושבו עבור כל נבג שזוהה. לבסוף, לחץ על מדידה ולאחר מכן על ייצוא מדידות כדי לייצא את התוצאות. נבגים של Coccidioides posadasii הצטברו בעיקר בסימפונות הדיסטליים ובחללים המכתשית הסמוכים בריאות המנופחות באוויר.
נבגים נראו מפוזרים יותר מהסימפונות בריאות רשמיות ומנופחות בנוזל בהשוואה לריאות מנופחות באוויר. המרחק בין נבגים לאפיתל הסימפונות החיובי ל-EpCAM היה גדול יותר בריאות מנופחות בנוזל בהשוואה לניפוח אוויר פיזיולוגי, מה שמעיד על נבגים מפוזרים יותר.
