M.Z. ו- K.S.F. ועבודה זו נתמכה על ידי מענק שהוענק במסגרת אתגר החדשנות של פיט (PInCh), באמצעות המכון למדעי הקליניקה והתרגום באוניברסיטת פיטסבורג, ומענק NHLBI R01 HL153407, שהוענק ל- M.Z.

הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פיטסבורג אישרה את כל הפרוטוקולים של בעלי חיים המפורטים בפרסום זה לפני ביצוע כל אחד מהניסויים בבעלי חיים אלה.
הערה: פרוטוקול זה מפרט כיצד לבצע מחקרי סיווג רירי vivo באמצעות הדמיה רדיונוקלידית עם סורק SPECT /CT דו-מודאלי. הטכניקות שהוכחו הן כיול מערכת פועל, עכברים הרדמה, צנרור קנה הנשימה של עכברים, החדרת האיזוטופ לתוך הריאות, הדמיה כפולה מודאליות, רישום משותף של תמונות אלה, וניתוח.
1. הגדרת מערכת SPECT/CT
<ol><li>תכנן זרימת עבודה מתאימה והגדר לפני הפעלת ניסויים באמצעות בעלי חיים חיים.<ol>
<li>השתמש ברכישת SPECT המורכבת מ- 60 תחזיות עם גודל צעד של 6o בין תחזיות עם רדיוס סיבוב של 40 ס"מ. רכישת CT מורכבת מ-220 תחזיות עם זווית של 1.6o בין התחזיות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ודא כי המערכת יש קולימטורים MWB הנכון עבור עכברים הדמיה SPECT במקום. אם הקולימטורים הבלתי הולמים מותקנים, השתמש באשף הקולימטור כדי להתקין את הקולימטורים הנכונים.</li>
	<li>הפעל את כיול המערכת הדרוש כדי להכין את המערכת לשימוש. הערה: רכיבי SPECT ו- CT של הסורק זקוקים לכיול. כייל את רכיבי ה- CT באמצעות מיזוג מקור וכיול כהה/בהיר (D/L) פעם ביום, כיול היסט מרכזי (COS) כל שבועיים, והערך את חומרת הרנטגן מדי חודש. רכיבי SPECT צריכים להיות מכוילים פעם בשנה.<ol>
<li>כדי להעריך את חומרת הרנטגן, סמן את התיבה הערך חומרת רנטגן במהלך כיול CT(תפריט כיול CT משלים).</li>
		<li>כדי לבצע מיזוג מקור, סמן את התיבה בצע מיזוג מקור במהלך כיול CT(תפריט כיול CT משלים).</li>
		<li>כדי לבצע כיול D/L, סמן את התיבה D/L לצד פרוטוקול רכישת CT המשמש במהלך ניסויים במהלך כיול CT. בטל את הסימון של כל הפרוטוקולים האחרים(תפריט כיול CT משלים).</li>
		<li>כדי לבצע כיול COS, החלף את המיטה בכלי טבעת הכיול, התאם את הגדרות סוג המיטה כך שיתאימו להגדרות בקרת התנועה וסמן את התיבה COS לצד פרוטוקול רכישת CT המשמש במהלך ניסויים במהלך כיול CT. בטל את הסימון של כל הפרוטוקולים האחרים(תפריט כיול CT משלים, טבעת כיול משלימה).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אינטובציה והטמעה של עכבר
<ol><li>לשקול את העכברים להיבדק. אם סורקים עכברים מרובים, יש לסמן את העכברים למטרות זיהוי באמצעות שיטות כגון אגרוף באוזן או סימון הזנב.</li>
	<li>הרדמה של עכבר באמצעות 1.5% isoflurane עם זרימת גז של 2 L / min O2 בתא גזים במשך ~ 5 דקות כדי לייצר הרדמה של עומק מספיק, עד הנשימה מאטה ~ 55-65 נשימות לדקה 16 (איור 1A).</li>
	<li>הסר את העכבר מן התא ולהשעות על ידי החותכים הקדמיים על דוכן אינטובציה בשיפוע 45o. ציידו את מעמד הצנרור בקונוס אף כדי לוודא שהעכבר מורדם במהלך הצנרור (איור 1B).</li>
	<li>חבר קצה אחד של חוט סיב אופטי של 50 מיקרומטר למקור אור וחוט קנולה של 20 מד מעליה באמצעות החוט כדי לשמש כמדריך(איור 1C).</li>
	<li>פתח את הפה של העכבר ולמשוך את הלשון קדימה באמצעות מלקחיים קהים. האר את חוט ההנחיה והשתמש בו כדי לדמיין את מיתרי הקול(איור 1D).</li>
	<li>מעבירים את חוט ההנחיה דרך מיתרי הקול כך שהחוט נמצא ממש מעבר למיתרי הקול ונחים בקנה הנשימה העליון. החלק את הצינורית בגודל 1 אינץ' קדימה לאורך החוט כדי לצנרר את העכבר, והעבר את הצינורית עמוק מספיק כך שהרכזת שלה היא נגד החותכות של החיה(איור 1E). הסר את החוט משאיר את הצינורית במקום.</li>
	<li>בדוק את הצנרור על ידי חיבור קצר של הצינורית באצבע ובדיקת שינויים בנשימה. נשימה מופסקת או נשימה מתוחה תוך חיבור ונשימה מואצת עם השחרור הם סימנים של צנרור קנה הנשימה הנכון. אם אין שינוי בדפוסי הנשימה בעת חיבור הצינורית, האחרון סביר בוושט.</li>
	<li>הכן 0.2 mCi של קולואיד טכנציום-גופרית 99m(99mTc-Sc) בנפח של 10 μL, ופיפט לתוך הצינורית. אפשר לעכבר לשאוף אותו באופן ספונטני לריאות במשך 1-2 דקות (איור 1F). הסר את הצינורית לפני העברת העכבר למשטח של הסורק. הערה: הרדיונוקליד הוכן ומסונן על ידי קרדינל בריאות.</li>
</ol>3. הדמיית SPECT/CT
<ol><li>מעבירים את העכבר למשטח 25 מ"מ עם חרוט האף ומאובטחים עם סרט הדבקה, מקפידים לא להדביק את החזה והבטן חזק מדי כדי למנוע פגיעה בנשימה. יש להקפיד להסיר את כל תגי האוזן ממתכת המחוברים לעכבר.</li>
	<li>הכן פנטום רדיואקטיבי המורכב 0.05 mCi ב 200 μL ומניחים כמות זו בצינור PCR 0.2 מ"ל. מקם את הצינור על ידי הדבקה על המשטח מתחת לבטן התחתונה של העכבר, הימנעות חפיפה עם הריאות. הערה: הפנטום משמש לצורך רישום משותף של תמונות CT ו- SPECT, כמו גם שליטה שלילית לסילוק.</li>
	<li>הכנס את העכבר למערכת SPECT/CT, בחר את זרימת העבודה של הדימות והפעל את תוכנית ההתקנה.</li>
	<li>הגדר את מיקום הגלאים בעכבר והפעל את זרימת העבודה של הדימות.</li>
	<li>הכינו כלוב לעכברים שקיבלו רדיואקטיביות לאחר ההליך, עם גישה בלתי מוגבלת למזון ומים, ותיוג ברור באמצעות מדבקת בטיחות לקרינה.</li>
	<li>עם השלמת זרימת העבודה, להסיר את העכבר ממשטח ההדמיה, ולאפשר לו להתאושש בכלוב מוכן למשך 6 שעות בין הסריקות (סוף הסריקה 1 לתחילת הסריקה 2) עם גישה libitum המודעה למזון ומים. 6 שעות נבחר כפי שהוא תואם את פרק הזמן שבו אישור ליניארי בהתאם לתפקוד ריסים מתרחש עם מעט מאוד סיווג מכתשים.</li>
	<li>לאחר 6 שעות, הרדמה מחדש של העכבר וסריקה, יחד עם הפנטום, באמצעות אותה זרימת עבודה כדי למדוד את כמות האיזוטופ פינה את דרכי הנשימה. הערה: זה קריטי כדי לאפשר לעכבר להתאושש כמו הרדמה ללא הפרעה עם isoflurane במשך 6 שעות יוביל אפקט משמעותי ריסים-דיכאון, וכתוצאה מכך כמעט אפס סיווגים mucociliary.</li>
</ol>4. ניתוח
<ol><li>לאחר ההדמיה, בצעו לאחר העיבוד שחזור תמונות מלאות של מחסנית תלת-ממד.<ol>
<li>היסטוגרמה תמונות SPECT באמצעות ההגדרות הסטנדרטיות של היצרן עבור Tc 99m,ולאחר מכן לשחזר באמצעות אלגוריתם MAP3D ופונקציית התפשטות נקודה (PSF) שחזור. הערה: השחזור בוצע באמצעות 8 איטרציות ו- 6 ערכות משנה. שחזור יעיל זקוק ליחס בין קבוצות משנה לתחזיות ב- 1:10 או לחלק באופן שווה למספר התחזיות, כך שנעשה שימוש ב- 6 ערכות משנה עקב הרכישה באמצעות 60 תחזיות.</li>
		<li>לשחזר את תמונות CT באמצעות אלגוריתם פלדקאמפ ומסנן שפ-לוגן. הערה: השחזור בוצע באמצעות 4 איטרציות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבד את תמונות CT ו- SPECT ב- FIJI ImageJ21 באמצעות כלי השריד כדי ליצור תמונות תצוגה קורנל מתמונות צירי ברירת המחדל. לאחר מכן בצע הקרנת סכום מחסנית z בתמונת SPECT כדי להוסיף את נתוני הספירה מכל פרוסה וליצור תמונה אחת כדי להקל על הניתוח.</li>
	<li>לשנות גודל ולרשום במשותף את תמונות CT ו- SPECT באמצעות צינור הפנטום Eppendorf כהפניה (איור 2A,B). עקוב אחר מדידות עקביות של שינוי גודל והשתמש בהן בכל הדגימות.</li>
	<li>בינריז של תמונת CT באמצעות סף אוטומטי, ולאחר מכן היפוך המחסנית וביצוע הקרנת סכום מחסנית z כדי ליצור חלוקה לרמות של הריאות לניתוח (איור 2C).</li>
	<li>סובבו את תמונות CT ו-SPECT ומזגו את התמונה בעזרת כלי הערוצים. חשב MCC על-ידי ציור החזר על ההשקעה סביב הריאה הימנית ומדידתו (איור 2D). הערה: מדידה זו תהיה של הספירה הכוללת בריאה הימנית עבור 0 ו 6 נקודות זמן שעה, עם תמונות 6 שעות מתוקן עבור ריקבון רדיואקטיבי באמצעות הנוסחה: N(t) = N0e-t. 99 מ' Tc-Sc יש קבוע ריקבון של 3.21e-5 לשנייה עם זמן מחצית חיים של ~ 6 שעות. לאחר מכן ניתן להשתמש בערכים אלה כדי לחשב מרווח באחוזים. הערה: ריאה ימנית נבחרה עבור ציור החזר על ההשקעה ומדידת ספירות כמו אישור רירי יעביר את radioisotope מתוך הריאות אל הלוע משם הוא ייבלע בסופו של דבר בבטן. לעתים קרובות למדי, ספירות ניתן לראות בבטן שעשויים לחפוף עם הריאה השמאלית ולכן לייצר ספירות שגויות. זה מבלבל ניתן להימנע על ידי מדידת ספירות בריאה הימנית בלבד.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Afzelius, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-related+diseases.">Cilia-related diseases.</a> Journal of Pathology. 204 (4), 470-477 (2004).</li><li>Mitchell, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+eukaryotic+cilia+and+flagella+as+motile+and+sensory+organelles.">The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).</li><li>Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution:+Tracing+the+origins+of+centrioles,+cilia,+and+flagella.">Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella.</a> Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).</li><li>Randell, S. H., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=University+of+North+Carolina+Virtual+Lung,+G.+Effective+mucus+clearance+is+essential+for+respiratory+health.">University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).</li><li>Wanner, A., Salathe, M., O'Riordan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucociliary+clearance+in+the+airways.">Mucociliary clearance in the airways.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154, 1868-1902 (1996).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+genetic+analysis+in+mice+unveils+central+role+for+cilia+in+congenital+heart+disease.">Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease.</a> Nature. 521 (7553), 520-524 (2015).</li><li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction+and+respiratory+symptoms+in+patients+with+transposition+of+the+great+arteries.">Airway ciliary dysfunction and respiratory symptoms in patients with transposition of the great arteries.</a> PLoS One. 13 (2), 0191605 (2018).</li><li>Stewart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction:+Association+with+adverse+postoperative+outcomes+in+nonheterotaxy+congenital+heart+disease+patients.">Airway ciliary dysfunction: Association with adverse postoperative outcomes in nonheterotaxy congenital heart disease patients.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (2), 755-763 (2018).</li><li>Garrod, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction+and+sinopulmonary+symptoms+in+patients+with+congenital+heart+disease.">Airway ciliary dysfunction and sinopulmonary symptoms in patients with congenital heart disease.</a> Annals of the American Thoracic Society. 11 (9), 1426-1432 (2014).</li><li>Harden, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+postoperative+respiratory+complications+in+heterotaxy+congenital+heart+disease+patients+with+respiratory+ciliary+dysfunction.">Increased postoperative respiratory complications in heterotaxy congenital heart disease patients with respiratory ciliary dysfunction.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 147 (4), 1291-1298 (2014).</li><li>Leigh, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+genetic+aspects+of+primary+ciliary+dyskinesia/Kartagener+syndrome.">Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/Kartagener syndrome.</a> Genetics in Medicine. 11 (7), 473-487 (2009).</li><li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ivacaftor+on+mucociliary+clearance+and+clinical+outcomes+in+cystic+fibrosis+patients+with+G551D-CFTR.">Effect of ivacaftor on mucociliary clearance and clinical outcomes in cystic fibrosis patients with G551D-CFTR.</a> JCI Insight. 3 (24), (2018).</li><li>Donaldson, S. H., Corcoran, T. E., Laube, B. L., Bennett, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucociliary+clearance+as+an+outcome+measure+for+cystic+fibrosis+clinical+research.">Mucociliary clearance as an outcome measure for cystic fibrosis clinical research.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 4 (4), 399-405 (2007).</li><li>Ledowski, T., Hilmi, S., Paech, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchial+mucus+transport+velocity+in+patients+receiving+anaesthesia+with+propofol+and+morphine+or+propofol+and+remifentanil.">Bronchial mucus transport velocity in patients receiving anaesthesia with propofol and morphine or propofol and remifentanil.</a> Anaesthesia. 61 (8), 747-751 (2006).</li><li>Donnelley, M., Morgan, K. S., Siu, K. K., Parsons, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+deposition+of+pollutant+and+marker+particles+onto+live+mouse+airway+surfaces+enhances+monitoring+of+individual+particle+mucociliary+transit+behaviour.">Dry deposition of pollutant and marker particles onto live mouse airway surfaces enhances monitoring of individual particle mucociliary transit behaviour.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 551-558 (2012).</li><li>Christopher, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+temperature+and+anesthetic+agents+on+ciliary+function+in+murine+respiratory+epithelia.">The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 111 (2014).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography.">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).</li><li>Lam, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+6-mediated+selective+autophagy+regulates+COPD-associated+cilia+dysfunction.">Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5212-5230 (2013).</li><li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+examine+the+effect+of+chronic+treatment+with+immunosuppressive+drugs+on+mucociliary+clearance+in+a+vagotomized+murine+model.">A pilot study to examine the effect of chronic treatment with immunosuppressive drugs on mucociliary clearance in a vagotomized murine model.</a> PLoS One. 7 (9), 45312 (2012).</li><li>Ortiz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Mucociliary+Clearance+by+Three+Dimension+Micro-CT-SPECT+in+Guinea+Pig:+Role+of+Bitter+Taste+Agonists.">Evaluation of Mucociliary Clearance by Three Dimension Micro-CT-SPECT in Guinea Pig: Role of Bitter Taste Agonists.</a> PLoS One. 11 (10), 0164399 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Solomon, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+ciliary+phenotype+in+primary+ciliary+dyskinesia+by+micro-optical+coherence+tomography.">Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography.</a> JCI Insight. 2 (5), 91702 (2017).</li><li>Nakhleh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+respiratory+ciliary+dysfunction+in+congenital+heart+disease+patients+with+heterotaxy.">High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy.</a> Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).</li><li>Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+aerosol+deposition+restricted+to+the+nose+in+beagle+dogs.">Technique for aerosol deposition restricted to the nose in beagle dogs.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. 23 (4), 519-525 (1988).</li><li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy.">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> Journal of Applied Physiology. 90 (3), 1111-1117 (2001).</li><li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+control+of+mucociliary+clearance+in+murine+lungs:+a+study+in+a+chronic+preparation.">Vagal control of mucociliary clearance in murine lungs: a study in a chronic preparation.</a> Autonomic Neuroscience. 154 (1-2), 74-78 (2010).</li><li>Van Audenhaege, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+SPECT+collimator+selection,+optimization,+and+fabrication+for+clinical+and+preclinical+imaging.">Review of SPECT collimator selection, optimization, and fabrication for clinical and preclinical imaging.</a> Medical Physics. 42 (8), 4796-4813 (2015).</li></ol>

אף אחד מהם לא קשור לעבודה זו.

התפקיד של ריסים נשימתיים מוטיב הן המחלה והן הפיתוח ממשיך להתפתח ולהיות מוערך טוב יותר. סינכרוני, מכות metachronal של ריסים מוטיב מרובים על פני השטח apical של תאים רירית עץ קנה הנשימה ליצור זרימה cephalad לייצר אישור mucociliary או MCC. MCC נפגעת ciliopathies כמו PCD22, מחלות נרכשות כמו COPD18, וחשיבותו מוכרת CHDs, לא נחשב באופן מסורתי ciliopathies. נתונים אחרונים הראו תפקוד לקוי של הנשימה הן CHD עם הטרוטקסיה23 וללא הטרוטקסיה7. כזה תפקוד לקוי של ריסים מוטיל הוכח לתרגם תסמינים נשימתיים גדולים יותר9, כמו גם תחלואה לאחר הניתוחגדול יותר 8. רוב, אם לא כל, של מחלות אלה, יש מודלים העכבר זמין הפרוטוקול שלנו למדידת MCC בעכברים הוא כלי רב ערך שניתן להשתמש בו כדי לבדוק טיפולים פוטנציאליים.
מודלים של בעלי חיים מספקים שירות להבנת מחלות ופיתוח טיפולים. דימות בעלי חיים In vivo מספק תועלת נוספת עם היכולת לרכוש נקודות נתונים מרובות מאותם בעלי חיים, ללא צורך להקריב את בעלי החיים, המאפשר לחוקרים לעקוב אחר מהלך האורך של המחלה, כמו גם משך המחקר של השפעות הטיפול. מודל העכבר של MCC פותח במהלך עשרות שנים על ידי חוקרים מרובים, בתחילה מבוצע על כלבי ביגל באמצעות scintigraphy מישורי, טכניקת הדמיה גרעינית דו מימדית24. הטכניקה הותאמה לשימוש בעכברים עשור לאחר מכן, ואחריה הסתגלות להדמיית SPECT עשור לאחר מכן25,26. הפיתוח של טכניקה זו במודלים של עכבר היה התפתחות גדולה הרלוונטיות של טכניקה זו, בשל הזמינות של מודלים עכבר מרובים של מחלות אנושיות כמו PCD שבו תפקוד ciliary משתנה באופן משמעותי. MCC הוערך במודלים עכבר של denervation ריאות ודיכוי המערכת החיסונית, ויש לו את הפוטנציאל לשמש בשילוב עם דגמים אחרים19,26. מחקרי מדידה MCC בחולים אנושיים עם מחלות בדרכי הנשימה כגון CF, אסטמה, PCD, ו ciliopathies הקשורים CHD נערכו, הניבו תוצאות כי הטכניקה יכולה לסייע הן מחקרים של פיזיולוגיה ריאות ויעילות טיפולית13.
חלק חשוב בפרוטוקול זה הוא הגדרת רכישות עם פרמטרי ההדמיה הנכונים כדי להשיג תמונות מדויקות לכימות. מספר גורמים הם המפתח בעת עיצוב הגדרות רכישת SPECT, כולל אילו collimators משמשים, מספר התחזיות לרכוש לכל מהפכה, וגודל שלב הסיבוב. בחירת קולימטור היא גורם מרכזי ברגישות וברזולוציה של הרכישה, וייתכן שיהיה צורך להתאים את הגדרות הרכישה לקולימטור המשמש27. לחלופין, בעת שימוש בבעלי חיים גדולים יותר כמו חולדות, הקולימטורים יצטרכו להיות מותאמים. collimators pinhole מרובים למשל רגישים יותר, אבל יש להקפיד בעת בחירת גודל צעד על מנת למנוע תחזיות חופפות ולגרום multiplexing לא רצוי, אשר יכול להגביר עוד יותר את הרגישות של הרכישה על חשבון כמה עמימות תמונה שיכולה לגרום חפצי שחזור25. כיוונון שחזור הוא גם המפתח ליצירת תמונות הניתנות לכימות. MAP3D הוא אלגוריתם שחזור איטרטיבי נפוץ, ו- PSF הוא מודל שחזור נפוץ. שתיהן אמינות לבנייה מחדש של תמונות, אך יש להקפיד על כך בעת הגדרת מספר האיטרציות וערכות המשנה. מספר גבוה יותר של איטרציות יגדיל את הזמן החישובי הנדרש לשיקום, ויגדיל את איכות השחזור עם ירידה בתשואות עם עלייה נוספת.
כדי לכמת תמונות ב-ImageJ, כלי המדידה האידיאלי לשימוש הוא RawIntDen, שמפיק פלט של הערך הכולל של פיקסלים בבחירה. בעת כימות נתוני SPECT על-פני ROIs ריאות בגדלים שונים, השימוש ב- RawIntDen מספק מידה מוחלטת של ספירות ונמנע מהתאמת המדידה לאזור ההחזר על ההשקעה, כמו המדידה הממוצעת21.
טכניקה זו כוללת מספר מקורות שגיאה משויכים שהחוקר צריך להיות מודע להם בעת יישום טכניקה זו. אחד ההסתבכויות הבולטות הוא השימוש בחומרי הרדמה. Isoflurane הוא משחק מהיר, הרדמה בשאיפה כי העכברים להתאושש במהירות לאחר השלמת רכישה. עם זאת, יש להקפיד לספק לעכברים מספיק זמן להתאושש בכלובים שלהם, ולא לשמור על מורדמת יותר מהנדרש. מניסיוננו האישי (נתונים שלא פורסמו) עכברים שהוחזקו מורדמת ברציפות באמצעות isoflurane בשאיפה בין נקודת הזמן של 0 עד 6 שעות הראו סיווג זניח. כמו כן, מנה מבוקרת של הרדמה יש צורך גם כדי להבטיח התאוששות מהירה. בעת אבטחת החיה למשטח להדמיה, צינור הפנטום המשמש לרישום משותף צריך להישמר נמוך על הבטן, כדי למנוע חפצים חופפים עם הריאות. כמו כן, כדי להבטיח תמונת CT איכותית, הקפד להסיר תגי מתכת מהעכבר כדי למנוע ממצאים מפיזור קרני רנטגן.
ניתן להחיל את פרוטוקול MCC הנוכחי על מודלים רבים של בעלי חיים. טכניקה זו יש השפעה זניחה על בריאותו של החיה נסרק, נסבל היטב על ידי עכברים, ובגלל זה זה יכול לשמש עם מודלים המחלה מבלי לסכן את בריאותם של עכברים עדינים כבר. החוזק של מתודולוגיה זו נובע מכך שהיא טכניקת in vivo, המאפשרת רכישת מדידות עקביות וחוזרות על עצמן של תפקוד דרכי הנשימה ללא הקרבת בעלי חיים כדי לבלות קנה הנשימה עבור וידאו מיקרוסקופיה, כי מודלים ex vivo דורשים26. העקביות של טכניקה זו בהפקת מדידות חוזרות על פני סריקות מרובות של אותם בעלי חיים, מאפשרת לטפל באותה חיה עם סוכנים שונים או טיפולים פוטנציאליים, והשוואות סטטיסטיות שנעשו בין אותה חיה כדי להפחית את השונות הביולוגית הטבועה בכל מודל של בעלי חיים, ובכך להקטין את גודל המדגם הדרוש כדי להראות הבדלים מובהקים סטטיסטית.
ההערכה של תפקוד דרכי הנשימה באמצעות טכניקת MCC יכולה להיות מותאמת למגוון מודלים של בעלי חיים וליישם דגמים רבים ושונים של בריאות דרכי הנשימה, כמו גם בדיקת טיפולים חדשים. דרכי הנשימה של דגמי העכבר של PCD ניתן להעריך באמצעות טכניקה זו, כמו גם מודלים של COPD. השיטה שלנו יכולה גם להיות מנוצלת כדי ללמוד השפעות דיפרנציאליות של הרדמה שונים על MCC כי הם בשימוש קליני נפוץ. לבסוף, ההשפעות של סוכנים טיפוליים על דרכי הנשימה ניתן גם להעריך באמצעות מודל זה. כאמור אך נושאת חזרה, שכן היא מדידה in vivo זה מאפשר הערכות MCC חוזרות במהלך מחלה, כמו גם יתרונות הבדיקה של התערבויות טיפוליות לאורך זמן. בנוסף, עכברים הם חיות המעבדה הנפוצות ביותר המשמשות לחיקוי/מחקר של מחלות אנושיות, כאשר במקרים מסוימים, מודלים רבים של עכברים מהונדסים של מחלות אנושיות זמינים לבחירה.

סיליה הם אברונים תאיים מבוססי מיקרוטובולה השמורים לאורך ההיסטוריה האבולוציונית מאצות לבני אדם. הם נובעים משטחי תאים ויש להם מספר פונקציות1, החל מזיהוי אותות חושיים סביבתיים מקומיים ועד תנועתיות, פונקציות שניתן לייחס מבני אדם לאורגניזמים אוקריוטיים חד תאייםמוקדמים 2,3. Cilia יכול להיות לא מוטילי יחיד לשמש אנטנה מיוחדת של התא כדי לעבד אותות סביבתיים; או מוטיב וכפול, מכות בגלים מסונכרנים, מטכרוניים כדי ליצור זרימת נוזלים, כגון בטנה של החצוצרות ודרכי הנשימה העליונות והתחתונות, למעט הסמפונות הסופיות המובילות אל alveoli1,2.
משטח האפיתל הנרחב של דרכי הנשימה חשוף למטח מתמיד של זיהום בצורה של מגוון מזהמים ופתוגנים בשאיפה שעלולים להיות מסוכנים, המחייבים הגנה. מנגנון הגנה מרכזי אחד הוא המנגנון הרירי של עץ קנה הנשימה, שבו זרימה רציפה של ריר מופרש מועברת מכנית מחוץ לדרכי הנשימה על ידי מכות של ריסים מוטיבים מרובים המצפים את המשטחים האפיקליים של תאי האפיתל קנה הנשימה- הסימפונות. אלה מתפקדים כדי ללכוד מזהמים בשאיפה, ובאמצעות המכות המתמשכות והסנכרון שלהם, להעביר אותם cephalad4,5.
סיליה הוכחו כבעלי תפקידי מפתח כגון בפיתוח דפוס שמאלי-ימני בפיתוח עוברים, שם ריסונים מוטיבים בצומת העוברי שובריםסימטריה 6. מוטציות בגנים הקשורים לריסונים נקשרו למחלות כגון מחלות לב מולדות (CHD) בשל המבנה האסימטרי של הלב6. מחקרים אחרונים דיווחו על שכיחות גבוהה של תפקוד לקוי של מערכת הנשימה של חולים עם CHD, כמו גם שכיחות מוגברת של סיבוכים נשימתיים לאחר הניתוח ותסמינים כרוניים בדרכי הנשימה בדרכי הנשימה העליונות והתחתונות7,8,9,10. חולים עם CHD ותפקוד לקוי, עם או בלי הטרוטקסיה, הוכחו כסיכון מוגבר לסיבוכים נשימתיים ותוצאות נשימתיות שליליות לאחר הניתוח5,8,10. מעבר לתפקידם באיתות ופיתוח, החשיבות של ריסוני דרכי הנשימה הוכח על ידי ciliopathies, אשר דוגמה מעולה היא דיסקינזיה ciliary העיקרי (PCD). PCD היא הפרעה מולדת הנובעת ממספר מוטציות המשפיעות על ריסים נשימתיים מוטיב, המוביל דלקות ריאות חוזרות ונשנות, bronchiectasis, ופוטנציאל הצורך בהשתלת ריאות11. בנוסף, למרות ריסונים נורמליים סיסטיק פיברוזיס (CF), ההפרעה מולדת הנפוצה ביותר באוכלוסייה הקווקזית, MCC נפגע עקב ריר עבה, צמיג הנובע מוטציות בגן CFTR12. ישנם דגמי עכבר מרובים של PCD ו- CF, כמו גם מספר גדל והולך של דגמים של CHD. בסופו של דבר ריסונים הם מבנים רב-תכליתיים עם תפקידי מפתח רבים, ושיטה להערכת תפקודם של ריסונים נשימתיים מוטיבים ב- vivo יכולה להיות בעלת ערך למחקר פרה-קליני, ולהערכת ההשפעות של מוטציות כמו גם תרופות על סיווג רירי (MCC)13. השיטה תהיה גם בעלת ערך בהערכת ההשפעות של תרופות חדשניות, ריפוי גנטי או התערבויות על MCC במודלים אלה של העכבר.
ישנם מודלים רבים ושונים ששימשו להערכת MCC. שיטה בולטת אחת כרוכה בשימוש בצבע כחול מתילן שהוחדיר לתוך הסימפונות, עם אישור נמדד על ידי מדידה סיבית של תנועת צבע14. שיטה זו מוגבלת על ידי היכולת להתבונן בתנועה של הצבע, שהוא שגרתי יותר בבני אדם מאשר במודלים פרה-קליניים של עכברים. שיטה בולטת נוספת היא הדמיית רנטגן סינכרון שלב ניגודיות (PCXI), אשר ניתן להשתמש בהם כדי לעקוב אחר חלקיקים בודדים בדרכי הנשימה. שיטה זו חדשה יחסית ולא נגישה באופן נרחב15. ישנן שיטות ex vivo רבות להערכת דרכי הנשימה על ידי כריתת קנה הנשימה עבור וידאו מיקרוסקופיה, אולם מודלים אלה מספקים תועלת מועטה בחולים אנושיים16. טכניקות ברזולוציה גבוהה להדמיית ריסים כגון טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית מוגבלות באותואופן 17.
במאמר זה, אנו מציגים שיטה לשחזור כדי למדוד MCC ב vivo ששימש למדידת סיווגי ריאות במודלים רבים של בעלי חיים, כמו גם מחקר MCC במחלת ריאות חסימתית כרונית ולהעריך את ההשפעות של תרופות לדיכוי המערכת החיסונית18,19. שיטה זו עוקבת אחר האישור של קולואיד טכנציום-גופרית רדיופארמה 99m(99mTc-Sc), רדיוטר חלקיקי בלתי מסיס, לאחר החדרה לריאות. לאחר מכן ניתן לעקוב אחר הרדיונוקליד באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת פליטת פוטון יחיד (SPECT)18,20. יש לנו עוד יותר מעודן טכניקה זו למדידת MCC באמצעות SPECT מודאליות כפולה טומוגרפיה ממוחשבת (CT) הדמיה עם לוקליזציה משותפת של ספירות radioisotope לריאות ומדידת הירידה בספירות אלה מעל 6 שעות. הדמיה דו-מודאלית, עם רישום משותף של תמונות CT ו- SPECT מאפשר לוקליזציה מדויקת של ספירת קרינה לאזור העניין שלנו, הריאות. למרות שאנו מתארים בפירוט את השיטה למדידת MCC בעכברים, ניתן להתאים את הפרוטוקול כדי ללמוד MCC בחולדות. הקולימטורים יצטרכו להיות מותאמים, כמו גם מינון קרינה. לדעתנו, סריקות MCC עכבר הם מאתגרים יותר מבחינה טכנית בשל גודל בעלי החיים הקטנים, אבל שימושי יותר מאשר חולדות בשל מספר גדול של מודלים עכבר הוקמה של מספר הפרעות אנושיות. בנוסף, בשל העלות הנמוכה יותר שלהם ועלות התחזוקה במושבות בעלי חיים, גודל מדגם גדול יותר הוא ריאלי יותר בעכברים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;m Unjacketed Fiber Optic Wire</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>02-532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Vaporizer</td>
			<td>Vetland Medical</td>
			<td>A13480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>99150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Introcan Safety Catheters 20G 1inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1534477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>118-2097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Intubation Stand</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>ETI-MSE-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Anesthesia Stand</td>
			<td>Summit Anesthesia Solutions</td>
			<td>22860</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice

ריסים מוטיב נשימתי, אברונים מיוחדים של התא, קו פני השטח apical של תאי אפיתל רירית דרכי הנשימה. על ידי מכות באופן מטכרוני, סינכרוני, אלה מרובים, motile, actin מבוססי organelles ליצור זרימת נוזל cephalad ניקוי דרכי הנשימה של מזהמים בשאיפה ופתוגנים. עם זיהום סביבתי גובר, פתוגנים ויראליים חדשניים וחיידקים עמידים לתרופות מרובות, סיווג רירית שנוצר על ידי ריסים (MCC) חיוני לשמירה על בריאות הריאות. MCC הוא גם מדוכא בהפרעות מולדות מרובות כמו דיסקינזיה ciliary ראשונית, סיסטיק פיברוזיס, כמו גם הפרעות נרכשות כמו מחלת ריאות חסימתית כרונית. כל ההפרעות האלה הקימו, במקרה מסוים מרובים, מודלים עכבר. בפרסום זה, אנו מפרטים שיטה המשתמשת בכמות קטנה של רדיואקטיביות והדמיית SPECT/CT דו-מודאלית כדי למדוד MCC במדויק ושחזור בעכברים ב- vivo. השיטה מאפשרת התאוששות של עכברים לאחר הדמיה, הפיכת מדידות סדרתיות לאפשריות, ובדיקת טיפולים פוטנציאליים לאורך זמן. הנתונים בעכברים מסוג בר מדגימים את יכולת השחזור של מדידת MCC כל עוד משולמת תשומת לב מספקת לפרטים, והפרוטוקול דבק בקפדנות.

באמצעות פרוטוקול זה, אנחנו מורדמת עכברים בתא isoflurane (איור 1A). לאחר שהשיגו רמה נאותה של הרדמה, עכברים הונחו על תמיכות אנכיות (איור 1B) ומיתרי הקול הוצגו באמצעות חוט מנחה מואר(איור 1C-1D). העכברים היו צנרור והחדיר עם 0.2 mCi 99mTc-Sc בכמויות של 10 μL דרך קנולה ועכברים מותר לשאוף באופן ספונטני לתוך הריאות (איור 1E-1F). לאחר רכישת ועיבוד התמונה, תמונות ה-CT וה-SPECT היו מקולוסליות (איור 2A)תוך שימוש בצינור הפנטום כציון דרך (איור 2B). מסכות הריאות נוצרו מתמונת CT (איור 2C) ושימשו למשיכה של ROIs סביב הריאה הימנית לניתוח ב- 0 (איור 2D) ו- 6 שעות (איור 2E-2F). כדי לבדוק את יכולת השחזור של הפרוטוקול, נסרקו בסך הכל 8 עכברים פעמיים בימים שונים עם תנאי ניסוי זהים, כאשר ניתוח באמצעות מבחן t מזווג לא מראה הבדל משמעותי בין הסריקות החוזרות (p-value=0.9904)(איור 3A). שני עכברים נוספים נסרקו שלוש פעמים בימים שונים עם תנאי ניסוי זהים, כאשר ניתוח באמצעות ANOVA חד-כיווני מראה התאמה משמעותית בין הסריקות החוזרות (p-value של 0.0041)(איור 3B). בסך הכל נסרקו 8 עכברים והוצגו שתי תמונות מייצגות (איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> איור 1: אינטובציה של עכבר והטמעת איזוטופים. תמונות של השלבים הדרושים כדי לצנרר ולהחדיר איזוטופ לתוך דרכי הנשימה. A) העכבר מורדם בתא. ב)העכבר המומר ממוקם על תמיכה אנכית, מושעה על ידי החותכים הקדמיים. C) חוט סיב אופטי מואר 0.5 מ"מ המשמש כחוט מדריך מוכן על ידי הפעלתו דרך קנולה 20 G. ד)פיו של העכבר נפתח באמצעות מלקחיים ומואר באמצעות המדריך המואר כדי לדמיין את מיתרי הקול. E) הצינורית נדחפת על פני מיתרי הקול והמדריך מוסר. F) איזוטופ מסיס הוא החדיר לתוך הצינורית באמצעות פיפטה והעכבר מותר לשאוף באופן ספונטני את האיזוטופ לתוך הריאות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> איור 2: תמונות SPECT/CT של סריקת MCC. A) תמונת SPECT שהותאם במשותף עם תמונת CT. B) תמונת CT עם צינור פנטום גלוי ששימש ללוקליזציה משותפת. ג)מסכה של דרכי הנשימה הנגזרת על ידי binarizing תמונת CT וביצוע הקרנת סכום מחסנית z. D) מסיכת CT מותאמת במשותף עם תמונת SPECT. החזר על ההשקעה לניתוח נמשך סביב הריאה הימנית. ה)מסכה של דרכי הנשימה בשעה 6 שעות. F) CT ו SPECT תמונה משותפת של דרכי הנשימה ב 6 שעות עם החזר על ההשקעה לניתוח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> איור 3: מדידות אישור של אותם עכברים בסריקות מרובות. א)שני סיווגים חוזרים בודדים נמדדו עבור 8 עכברים ללא שינויים בתנאי הניסוי. בדיקת t מזווגת הראתה כי לא היה הבדל משמעותי בין הסריקות החוזרות עם ערך p של 0.9904. ב)שלושה סיווגים חוזרים בודדים נמדדו עבור שני עכברים ללא שינויים בתנאי הניסוי. ANOVA חד כיווני הראה שיש התאמה משמעותית בין הסריקות החוזרות עם ערך p של 0.0041. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> איור 4: תמונות SPECT/CT המותאמות לשפות נוספות של דרכי הנשימה של 0 ו- 6 שעות בשני עכברים עם ROIs שצוירו ב- 0 ו- 6 שעות המתארות את הריאה הימנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור 1 משלימה: סרטון של מיתרי הקול המוארים בחוט סיב אופטי עם השפעת הנשימה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.</a>
קבצים משלימים. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קבצים אלה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice at JoVE.com

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

בפרסום זה, אנו מתארים פרוטוקולים להערכת סיווג רירי בדרכי הנשימה (MCC) בעכברים ב vivo ניצול הדמיה רדיונוקלדית דו-מודאלית. פרוטוקול זה מיועד טומוגרפיה ממוחשבת פליטת פוטון יחיד (SPECT) ופרוטוקול רכישת טומוגרפיה ממוחשבת (CT) באמצעות עכבר גוף שלם (MWB) collimators במערכת SPECT / CT כפול.

In vivo הערכה של אישור Mucociliary בעכברים

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

in-vivo-evaluation-of-mucociliary-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

4.2K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. בפרסום זה, אנו מתארים פרוטוקולים להערכת סיווג רירי בדרכי הנשימה (MCC) בעכברים ב vivo ניצול הדמיה רדיונוקלדית דו-מודאלית. פרוטוקול זה מיועד טומוגרפיה ממוחשבת פליטת פוטון יחיד (SPECT) ופרוטוקול רכישת טומוגרפיה ממוחשבת (CT) באמצעות עכבר גוף שלם (MWB) collimators במערכת SPECT / CT כפול....

Video: In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

ביצוע שטיפת נרתיק, כתמים ויולטו קריסטל, והערכת ציטולוגית נרתיק לאחסון זמני מחזור הייחום חולל זיהוי עכבר

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

הערכה של מכניקת מערכת נשימה בעכברים באמצעות טכניקת תנודה בכפייה

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

הערכה של תפקוד שרירים של שריר extensor digitorum Longus<em&gt; גופיים</em&gt; ושריר קדמי tibialis<em&gt; באתר</em&gt; בעכברים

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

בVivo siRNA Transfection וג&#39;ין מציאה בחוט השדרה באמצעות ראפיד פולשנית מותני intrathecal זריקות בעכברים

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...