M.Z. ו- K.S.F. ועבודה זו נתמכה על ידי מענק שהוענק במסגרת אתגר החדשנות של פיט (PInCh), באמצעות המכון למדעי הקליניקה והתרגום באוניברסיטת פיטסבורג, ומענק NHLBI R01 HL153407, שהוענק ל- M.Z.

הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פיטסבורג אישרה את כל הפרוטוקולים של בעלי חיים המפורטים בפרסום זה לפני ביצוע כל אחד מהניסויים בבעלי חיים אלה.
הערה: פרוטוקול זה מפרט כיצד לבצע מחקרי סיווג רירי vivo באמצעות הדמיה רדיונוקלידית עם סורק SPECT /CT דו-מודאלי. הטכניקות שהוכחו הן כיול מערכת פועל, עכברים הרדמה, צנרור קנה הנשימה של עכברים, החדרת האיזוטופ לתוך הריאות, הדמיה כפולה מודאליות, רישום משותף של תמונות אלה, וניתוח.
1. הגדרת מערכת SPECT/CT
<ol><li>תכנן זרימת עבודה מתאימה והגדר לפני הפעלת ניסויים באמצעות בעלי חיים חיים.<ol>
<li>השתמש ברכישת SPECT המורכבת מ- 60 תחזיות עם גודל צעד של 6o בין תחזיות עם רדיוס סיבוב של 40 ס"מ. רכישת CT מורכבת מ-220 תחזיות עם זווית של 1.6o בין התחזיות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ודא כי המערכת יש קולימטורים MWB הנכון עבור עכברים הדמיה SPECT במקום. אם הקולימטורים הבלתי הולמים מותקנים, השתמש באשף הקולימטור כדי להתקין את הקולימטורים הנכונים.</li>
	<li>הפעל את כיול המערכת הדרוש כדי להכין את המערכת לשימוש. הערה: רכיבי SPECT ו- CT של הסורק זקוקים לכיול. כייל את רכיבי ה- CT באמצעות מיזוג מקור וכיול כהה/בהיר (D/L) פעם ביום, כיול היסט מרכזי (COS) כל שבועיים, והערך את חומרת הרנטגן מדי חודש. רכיבי SPECT צריכים להיות מכוילים פעם בשנה.<ol>
<li>כדי להעריך את חומרת הרנטגן, סמן את התיבה הערך חומרת רנטגן במהלך כיול CT(תפריט כיול CT משלים).</li>
		<li>כדי לבצע מיזוג מקור, סמן את התיבה בצע מיזוג מקור במהלך כיול CT(תפריט כיול CT משלים).</li>
		<li>כדי לבצע כיול D/L, סמן את התיבה D/L לצד פרוטוקול רכישת CT המשמש במהלך ניסויים במהלך כיול CT. בטל את הסימון של כל הפרוטוקולים האחרים(תפריט כיול CT משלים).</li>
		<li>כדי לבצע כיול COS, החלף את המיטה בכלי טבעת הכיול, התאם את הגדרות סוג המיטה כך שיתאימו להגדרות בקרת התנועה וסמן את התיבה COS לצד פרוטוקול רכישת CT המשמש במהלך ניסויים במהלך כיול CT. בטל את הסימון של כל הפרוטוקולים האחרים(תפריט כיול CT משלים, טבעת כיול משלימה).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אינטובציה והטמעה של עכבר
<ol><li>לשקול את העכברים להיבדק. אם סורקים עכברים מרובים, יש לסמן את העכברים למטרות זיהוי באמצעות שיטות כגון אגרוף באוזן או סימון הזנב.</li>
	<li>הרדמה של עכבר באמצעות 1.5% isoflurane עם זרימת גז של 2 L / min O2 בתא גזים במשך ~ 5 דקות כדי לייצר הרדמה של עומק מספיק, עד הנשימה מאטה ~ 55-65 נשימות לדקה 16 (איור 1A).</li>
	<li>הסר את העכבר מן התא ולהשעות על ידי החותכים הקדמיים על דוכן אינטובציה בשיפוע 45o. ציידו את מעמד הצנרור בקונוס אף כדי לוודא שהעכבר מורדם במהלך הצנרור (איור 1B).</li>
	<li>חבר קצה אחד של חוט סיב אופטי של 50 מיקרומטר למקור אור וחוט קנולה של 20 מד מעליה באמצעות החוט כדי לשמש כמדריך(איור 1C).</li>
	<li>פתח את הפה של העכבר ולמשוך את הלשון קדימה באמצעות מלקחיים קהים. האר את חוט ההנחיה והשתמש בו כדי לדמיין את מיתרי הקול(איור 1D).</li>
	<li>מעבירים את חוט ההנחיה דרך מיתרי הקול כך שהחוט נמצא ממש מעבר למיתרי הקול ונחים בקנה הנשימה העליון. החלק את הצינורית בגודל 1 אינץ' קדימה לאורך החוט כדי לצנרר את העכבר, והעבר את הצינורית עמוק מספיק כך שהרכזת שלה היא נגד החותכות של החיה(איור 1E). הסר את החוט משאיר את הצינורית במקום.</li>
	<li>בדוק את הצנרור על ידי חיבור קצר של הצינורית באצבע ובדיקת שינויים בנשימה. נשימה מופסקת או נשימה מתוחה תוך חיבור ונשימה מואצת עם השחרור הם סימנים של צנרור קנה הנשימה הנכון. אם אין שינוי בדפוסי הנשימה בעת חיבור הצינורית, האחרון סביר בוושט.</li>
	<li>הכן 0.2 mCi של קולואיד טכנציום-גופרית 99m(99mTc-Sc) בנפח של 10 μL, ופיפט לתוך הצינורית. אפשר לעכבר לשאוף אותו באופן ספונטני לריאות במשך 1-2 דקות (איור 1F). הסר את הצינורית לפני העברת העכבר למשטח של הסורק. הערה: הרדיונוקליד הוכן ומסונן על ידי קרדינל בריאות.</li>
</ol>3. הדמיית SPECT/CT
<ol><li>מעבירים את העכבר למשטח 25 מ"מ עם חרוט האף ומאובטחים עם סרט הדבקה, מקפידים לא להדביק את החזה והבטן חזק מדי כדי למנוע פגיעה בנשימה. יש להקפיד להסיר את כל תגי האוזן ממתכת המחוברים לעכבר.</li>
	<li>הכן פנטום רדיואקטיבי המורכב 0.05 mCi ב 200 μL ומניחים כמות זו בצינור PCR 0.2 מ"ל. מקם את הצינור על ידי הדבקה על המשטח מתחת לבטן התחתונה של העכבר, הימנעות חפיפה עם הריאות. הערה: הפנטום משמש לצורך רישום משותף של תמונות CT ו- SPECT, כמו גם שליטה שלילית לסילוק.</li>
	<li>הכנס את העכבר למערכת SPECT/CT, בחר את זרימת העבודה של הדימות והפעל את תוכנית ההתקנה.</li>
	<li>הגדר את מיקום הגלאים בעכבר והפעל את זרימת העבודה של הדימות.</li>
	<li>הכינו כלוב לעכברים שקיבלו רדיואקטיביות לאחר ההליך, עם גישה בלתי מוגבלת למזון ומים, ותיוג ברור באמצעות מדבקת בטיחות לקרינה.</li>
	<li>עם השלמת זרימת העבודה, להסיר את העכבר ממשטח ההדמיה, ולאפשר לו להתאושש בכלוב מוכן למשך 6 שעות בין הסריקות (סוף הסריקה 1 לתחילת הסריקה 2) עם גישה libitum המודעה למזון ומים. 6 שעות נבחר כפי שהוא תואם את פרק הזמן שבו אישור ליניארי בהתאם לתפקוד ריסים מתרחש עם מעט מאוד סיווג מכתשים.</li>
	<li>לאחר 6 שעות, הרדמה מחדש של העכבר וסריקה, יחד עם הפנטום, באמצעות אותה זרימת עבודה כדי למדוד את כמות האיזוטופ פינה את דרכי הנשימה. הערה: זה קריטי כדי לאפשר לעכבר להתאושש כמו הרדמה ללא הפרעה עם isoflurane במשך 6 שעות יוביל אפקט משמעותי ריסים-דיכאון, וכתוצאה מכך כמעט אפס סיווגים mucociliary.</li>
</ol>4. ניתוח
<ol><li>לאחר ההדמיה, בצעו לאחר העיבוד שחזור תמונות מלאות של מחסנית תלת-ממד.<ol>
<li>היסטוגרמה תמונות SPECT באמצעות ההגדרות הסטנדרטיות של היצרן עבור Tc 99m,ולאחר מכן לשחזר באמצעות אלגוריתם MAP3D ופונקציית התפשטות נקודה (PSF) שחזור. הערה: השחזור בוצע באמצעות 8 איטרציות ו- 6 ערכות משנה. שחזור יעיל זקוק ליחס בין קבוצות משנה לתחזיות ב- 1:10 או לחלק באופן שווה למספר התחזיות, כך שנעשה שימוש ב- 6 ערכות משנה עקב הרכישה באמצעות 60 תחזיות.</li>
		<li>לשחזר את תמונות CT באמצעות אלגוריתם פלדקאמפ ומסנן שפ-לוגן. הערה: השחזור בוצע באמצעות 4 איטרציות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבד את תמונות CT ו- SPECT ב- FIJI ImageJ21 באמצעות כלי השריד כדי ליצור תמונות תצוגה קורנל מתמונות צירי ברירת המחדל. לאחר מכן בצע הקרנת סכום מחסנית z בתמונת SPECT כדי להוסיף את נתוני הספירה מכל פרוסה וליצור תמונה אחת כדי להקל על הניתוח.</li>
	<li>לשנות גודל ולרשום במשותף את תמונות CT ו- SPECT באמצעות צינור הפנטום Eppendorf כהפניה (איור 2A,B). עקוב אחר מדידות עקביות של שינוי גודל והשתמש בהן בכל הדגימות.</li>
	<li>בינריז של תמונת CT באמצעות סף אוטומטי, ולאחר מכן היפוך המחסנית וביצוע הקרנת סכום מחסנית z כדי ליצור חלוקה לרמות של הריאות לניתוח (איור 2C).</li>
	<li>סובבו את תמונות CT ו-SPECT ומזגו את התמונה בעזרת כלי הערוצים. חשב MCC על-ידי ציור החזר על ההשקעה סביב הריאה הימנית ומדידתו (איור 2D). הערה: מדידה זו תהיה של הספירה הכוללת בריאה הימנית עבור 0 ו 6 נקודות זמן שעה, עם תמונות 6 שעות מתוקן עבור ריקבון רדיואקטיבי באמצעות הנוסחה: N(t) = N0e-t. 99 מ' Tc-Sc יש קבוע ריקבון של 3.21e-5 לשנייה עם זמן מחצית חיים של ~ 6 שעות. לאחר מכן ניתן להשתמש בערכים אלה כדי לחשב מרווח באחוזים. הערה: ריאה ימנית נבחרה עבור ציור החזר על ההשקעה ומדידת ספירות כמו אישור רירי יעביר את radioisotope מתוך הריאות אל הלוע משם הוא ייבלע בסופו של דבר בבטן. לעתים קרובות למדי, ספירות ניתן לראות בבטן שעשויים לחפוף עם הריאה השמאלית ולכן לייצר ספירות שגויות. זה מבלבל ניתן להימנע על ידי מדידת ספירות בריאה הימנית בלבד.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Afzelius, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-related+diseases.">Cilia-related diseases.</a> Journal of Pathology. 204 (4), 470-477 (2004).</li><li>Mitchell, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+eukaryotic+cilia+and+flagella+as+motile+and+sensory+organelles.">The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).</li><li>Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution:+Tracing+the+origins+of+centrioles,+cilia,+and+flagella.">Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella.</a> Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).</li><li>Randell, S. H., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=University+of+North+Carolina+Virtual+Lung,+G.+Effective+mucus+clearance+is+essential+for+respiratory+health.">University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).</li><li>Wanner, A., Salathe, M., O'Riordan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucociliary+clearance+in+the+airways.">Mucociliary clearance in the airways.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154, 1868-1902 (1996).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+genetic+analysis+in+mice+unveils+central+role+for+cilia+in+congenital+heart+disease.">Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease.</a> Nature. 521 (7553), 520-524 (2015).</li><li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction+and+respiratory+symptoms+in+patients+with+transposition+of+the+great+arteries.">Airway ciliary dysfunction and respiratory symptoms in patients with transposition of the great arteries.</a> PLoS One. 13 (2), 0191605 (2018).</li><li>Stewart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction:+Association+with+adverse+postoperative+outcomes+in+nonheterotaxy+congenital+heart+disease+patients.">Airway ciliary dysfunction: Association with adverse postoperative outcomes in nonheterotaxy congenital heart disease patients.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (2), 755-763 (2018).</li><li>Garrod, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction+and+sinopulmonary+symptoms+in+patients+with+congenital+heart+disease.">Airway ciliary dysfunction and sinopulmonary symptoms in patients with congenital heart disease.</a> Annals of the American Thoracic Society. 11 (9), 1426-1432 (2014).</li><li>Harden, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+postoperative+respiratory+complications+in+heterotaxy+congenital+heart+disease+patients+with+respiratory+ciliary+dysfunction.">Increased postoperative respiratory complications in heterotaxy congenital heart disease patients with respiratory ciliary dysfunction.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 147 (4), 1291-1298 (2014).</li><li>Leigh, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+genetic+aspects+of+primary+ciliary+dyskinesia/Kartagener+syndrome.">Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/Kartagener syndrome.</a> Genetics in Medicine. 11 (7), 473-487 (2009).</li><li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ivacaftor+on+mucociliary+clearance+and+clinical+outcomes+in+cystic+fibrosis+patients+with+G551D-CFTR.">Effect of ivacaftor on mucociliary clearance and clinical outcomes in cystic fibrosis patients with G551D-CFTR.</a> JCI Insight. 3 (24), (2018).</li><li>Donaldson, S. H., Corcoran, T. E., Laube, B. L., Bennett, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucociliary+clearance+as+an+outcome+measure+for+cystic+fibrosis+clinical+research.">Mucociliary clearance as an outcome measure for cystic fibrosis clinical research.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 4 (4), 399-405 (2007).</li><li>Ledowski, T., Hilmi, S., Paech, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchial+mucus+transport+velocity+in+patients+receiving+anaesthesia+with+propofol+and+morphine+or+propofol+and+remifentanil.">Bronchial mucus transport velocity in patients receiving anaesthesia with propofol and morphine or propofol and remifentanil.</a> Anaesthesia. 61 (8), 747-751 (2006).</li><li>Donnelley, M., Morgan, K. S., Siu, K. K., Parsons, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+deposition+of+pollutant+and+marker+particles+onto+live+mouse+airway+surfaces+enhances+monitoring+of+individual+particle+mucociliary+transit+behaviour.">Dry deposition of pollutant and marker particles onto live mouse airway surfaces enhances monitoring of individual particle mucociliary transit behaviour.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 551-558 (2012).</li><li>Christopher, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+temperature+and+anesthetic+agents+on+ciliary+function+in+murine+respiratory+epithelia.">The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 111 (2014).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography.">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).</li><li>Lam, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+6-mediated+selective+autophagy+regulates+COPD-associated+cilia+dysfunction.">Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5212-5230 (2013).</li><li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+examine+the+effect+of+chronic+treatment+with+immunosuppressive+drugs+on+mucociliary+clearance+in+a+vagotomized+murine+model.">A pilot study to examine the effect of chronic treatment with immunosuppressive drugs on mucociliary clearance in a vagotomized murine model.</a> PLoS One. 7 (9), 45312 (2012).</li><li>Ortiz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Mucociliary+Clearance+by+Three+Dimension+Micro-CT-SPECT+in+Guinea+Pig:+Role+of+Bitter+Taste+Agonists.">Evaluation of Mucociliary Clearance by Three Dimension Micro-CT-SPECT in Guinea Pig: Role of Bitter Taste Agonists.</a> PLoS One. 11 (10), 0164399 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Solomon, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+ciliary+phenotype+in+primary+ciliary+dyskinesia+by+micro-optical+coherence+tomography.">Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography.</a> JCI Insight. 2 (5), 91702 (2017).</li><li>Nakhleh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+respiratory+ciliary+dysfunction+in+congenital+heart+disease+patients+with+heterotaxy.">High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy.</a> Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).</li><li>Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+aerosol+deposition+restricted+to+the+nose+in+beagle+dogs.">Technique for aerosol deposition restricted to the nose in beagle dogs.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. 23 (4), 519-525 (1988).</li><li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy.">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> Journal of Applied Physiology. 90 (3), 1111-1117 (2001).</li><li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+control+of+mucociliary+clearance+in+murine+lungs:+a+study+in+a+chronic+preparation.">Vagal control of mucociliary clearance in murine lungs: a study in a chronic preparation.</a> Autonomic Neuroscience. 154 (1-2), 74-78 (2010).</li><li>Van Audenhaege, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+SPECT+collimator+selection,+optimization,+and+fabrication+for+clinical+and+preclinical+imaging.">Review of SPECT collimator selection, optimization, and fabrication for clinical and preclinical imaging.</a> Medical Physics. 42 (8), 4796-4813 (2015).</li></ol>

אף אחד מהם לא קשור לעבודה זו.

התפקיד של ריסים נשימתיים מוטיב הן המחלה והן הפיתוח ממשיך להתפתח ולהיות מוערך טוב יותר. סינכרוני, מכות metachronal של ריסים מוטיב מרובים על פני השטח apical של תאים רירית עץ קנה הנשימה ליצור זרימה cephalad לייצר אישור mucociliary או MCC. MCC נפגעת ciliopathies כמו PCD22, מחלות נרכשות כמו COPD18, וחשיבותו מוכרת CHDs, לא נחשב באופן מסורתי ciliopathies. נתונים אחרונים הראו תפקוד לקוי של הנשימה הן CHD עם הטרוטקסיה23 וללא הטרוטקסיה7. כזה תפקוד לקוי של ריסים מוטיל הוכח לתרגם תסמינים נשימתיים גדולים יותר9, כמו גם תחלואה לאחר הניתוחגדול יותר 8. רוב, אם לא כל, של מחלות אלה, יש מודלים העכבר זמין הפרוטוקול שלנו למדידת MCC בעכברים הוא כלי רב ערך שניתן להשתמש בו כדי לבדוק טיפולים פוטנציאליים.
מודלים של בעלי חיים מספקים שירות להבנת מחלות ופיתוח טיפולים. דימות בעלי חיים In vivo מספק תועלת נוספת עם היכולת לרכוש נקודות נתונים מרובות מאותם בעלי חיים, ללא צורך להקריב את בעלי החיים, המאפשר לחוקרים לעקוב אחר מהלך האורך של המחלה, כמו גם משך המחקר של השפעות הטיפול. מודל העכבר של MCC פותח במהלך עשרות שנים על ידי חוקרים מרובים, בתחילה מבוצע על כלבי ביגל באמצעות scintigraphy מישורי, טכניקת הדמיה גרעינית דו מימדית24. הטכניקה הותאמה לשימוש בעכברים עשור לאחר מכן, ואחריה הסתגלות להדמיית SPECT עשור לאחר מכן25,26. הפיתוח של טכניקה זו במודלים של עכבר היה התפתחות גדולה הרלוונטיות של טכניקה זו, בשל הזמינות של מודלים עכבר מרובים של מחלות אנושיות כמו PCD שבו תפקוד ciliary משתנה באופן משמעותי. MCC הוערך במודלים עכבר של denervation ריאות ודיכוי המערכת החיסונית, ויש לו את הפוטנציאל לשמש בשילוב עם דגמים אחרים19,26. מחקרי מדידה MCC בחולים אנושיים עם מחלות בדרכי הנשימה כגון CF, אסטמה, PCD, ו ciliopathies הקשורים CHD נערכו, הניבו תוצאות כי הטכניקה יכולה לסייע הן מחקרים של פיזיולוגיה ריאות ויעילות טיפולית13.
חלק חשוב בפרוטוקול זה הוא הגדרת רכישות עם פרמטרי ההדמיה הנכונים כדי להשיג תמונות מדויקות לכימות. מספר גורמים הם המפתח בעת עיצוב הגדרות רכישת SPECT, כולל אילו collimators משמשים, מספר התחזיות לרכוש לכל מהפכה, וגודל שלב הסיבוב. בחירת קולימטור היא גורם מרכזי ברגישות וברזולוציה של הרכישה, וייתכן שיהיה צורך להתאים את הגדרות הרכישה לקולימטור המשמש27. לחלופין, בעת שימוש בבעלי חיים גדולים יותר כמו חולדות, הקולימטורים יצטרכו להיות מותאמים. collimators pinhole מרובים למשל רגישים יותר, אבל יש להקפיד בעת בחירת גודל צעד על מנת למנוע תחזיות חופפות ולגרום multiplexing לא רצוי, אשר יכול להגביר עוד יותר את הרגישות של הרכישה על חשבון כמה עמימות תמונה שיכולה לגרום חפצי שחזור25. כיוונון שחזור הוא גם המפתח ליצירת תמונות הניתנות לכימות. MAP3D הוא אלגוריתם שחזור איטרטיבי נפוץ, ו- PSF הוא מודל שחזור נפוץ. שתיהן אמינות לבנייה מחדש של תמונות, אך יש להקפיד על כך בעת הגדרת מספר האיטרציות וערכות המשנה. מספר גבוה יותר של איטרציות יגדיל את הזמן החישובי הנדרש לשיקום, ויגדיל את איכות השחזור עם ירידה בתשואות עם עלייה נוספת.
כדי לכמת תמונות ב-ImageJ, כלי המדידה האידיאלי לשימוש הוא RawIntDen, שמפיק פלט של הערך הכולל של פיקסלים בבחירה. בעת כימות נתוני SPECT על-פני ROIs ריאות בגדלים שונים, השימוש ב- RawIntDen מספק מידה מוחלטת של ספירות ונמנע מהתאמת המדידה לאזור ההחזר על ההשקעה, כמו המדידה הממוצעת21.
טכניקה זו כוללת מספר מקורות שגיאה משויכים שהחוקר צריך להיות מודע להם בעת יישום טכניקה זו. אחד ההסתבכויות הבולטות הוא השימוש בחומרי הרדמה. Isoflurane הוא משחק מהיר, הרדמה בשאיפה כי העכברים להתאושש במהירות לאחר השלמת רכישה. עם זאת, יש להקפיד לספק לעכברים מספיק זמן להתאושש בכלובים שלהם, ולא לשמור על מורדמת יותר מהנדרש. מניסיוננו האישי (נתונים שלא פורסמו) עכברים שהוחזקו מורדמת ברציפות באמצעות isoflurane בשאיפה בין נקודת הזמן של 0 עד 6 שעות הראו סיווג זניח. כמו כן, מנה מבוקרת של הרדמה יש צורך גם כדי להבטיח התאוששות מהירה. בעת אבטחת החיה למשטח להדמיה, צינור הפנטום המשמש לרישום משותף צריך להישמר נמוך על הבטן, כדי למנוע חפצים חופפים עם הריאות. כמו כן, כדי להבטיח תמונת CT איכותית, הקפד להסיר תגי מתכת מהעכבר כדי למנוע ממצאים מפיזור קרני רנטגן.
ניתן להחיל את פרוטוקול MCC הנוכחי על מודלים רבים של בעלי חיים. טכניקה זו יש השפעה זניחה על בריאותו של החיה נסרק, נסבל היטב על ידי עכברים, ובגלל זה זה יכול לשמש עם מודלים המחלה מבלי לסכן את בריאותם של עכברים עדינים כבר. החוזק של מתודולוגיה זו נובע מכך שהיא טכניקת in vivo, המאפשרת רכישת מדידות עקביות וחוזרות על עצמן של תפקוד דרכי הנשימה ללא הקרבת בעלי חיים כדי לבלות קנה הנשימה עבור וידאו מיקרוסקופיה, כי מודלים ex vivo דורשים26. העקביות של טכניקה זו בהפקת מדידות חוזרות על פני סריקות מרובות של אותם בעלי חיים, מאפשרת לטפל באותה חיה עם סוכנים שונים או טיפולים פוטנציאליים, והשוואות סטטיסטיות שנעשו בין אותה חיה כדי להפחית את השונות הביולוגית הטבועה בכל מודל של בעלי חיים, ובכך להקטין את גודל המדגם הדרוש כדי להראות הבדלים מובהקים סטטיסטית.
ההערכה של תפקוד דרכי הנשימה באמצעות טכניקת MCC יכולה להיות מותאמת למגוון מודלים של בעלי חיים וליישם דגמים רבים ושונים של בריאות דרכי הנשימה, כמו גם בדיקת טיפולים חדשים. דרכי הנשימה של דגמי העכבר של PCD ניתן להעריך באמצעות טכניקה זו, כמו גם מודלים של COPD. השיטה שלנו יכולה גם להיות מנוצלת כדי ללמוד השפעות דיפרנציאליות של הרדמה שונים על MCC כי הם בשימוש קליני נפוץ. לבסוף, ההשפעות של סוכנים טיפוליים על דרכי הנשימה ניתן גם להעריך באמצעות מודל זה. כאמור אך נושאת חזרה, שכן היא מדידה in vivo זה מאפשר הערכות MCC חוזרות במהלך מחלה, כמו גם יתרונות הבדיקה של התערבויות טיפוליות לאורך זמן. בנוסף, עכברים הם חיות המעבדה הנפוצות ביותר המשמשות לחיקוי/מחקר של מחלות אנושיות, כאשר במקרים מסוימים, מודלים רבים של עכברים מהונדסים של מחלות אנושיות זמינים לבחירה.

סיליה הם אברונים תאיים מבוססי מיקרוטובולה השמורים לאורך ההיסטוריה האבולוציונית מאצות לבני אדם. הם נובעים משטחי תאים ויש להם מספר פונקציות1, החל מזיהוי אותות חושיים סביבתיים מקומיים ועד תנועתיות, פונקציות שניתן לייחס מבני אדם לאורגניזמים אוקריוטיים חד תאייםמוקדמים 2,3. Cilia יכול להיות לא מוטילי יחיד לשמש אנטנה מיוחדת של התא כדי לעבד אותות סביבתיים; או מוטיב וכפול, מכות בגלים מסונכרנים, מטכרוניים כדי ליצור זרימת נוזלים, כגון בטנה של החצוצרות ודרכי הנשימה העליונות והתחתונות, למעט הסמפונות הסופיות המובילות אל alveoli1,2.
משטח האפיתל הנרחב של דרכי הנשימה חשוף למטח מתמיד של זיהום בצורה של מגוון מזהמים ופתוגנים בשאיפה שעלולים להיות מסוכנים, המחייבים הגנה. מנגנון הגנה מרכזי אחד הוא המנגנון הרירי של עץ קנה הנשימה, שבו זרימה רציפה של ריר מופרש מועברת מכנית מחוץ לדרכי הנשימה על ידי מכות של ריסים מוטיבים מרובים המצפים את המשטחים האפיקליים של תאי האפיתל קנה הנשימה- הסימפונות. אלה מתפקדים כדי ללכוד מזהמים בשאיפה, ובאמצעות המכות המתמשכות והסנכרון שלהם, להעביר אותם cephalad4,5.
סיליה הוכחו כבעלי תפקידי מפתח כגון בפיתוח דפוס שמאלי-ימני בפיתוח עוברים, שם ריסונים מוטיבים בצומת העוברי שובריםסימטריה 6. מוטציות בגנים הקשורים לריסונים נקשרו למחלות כגון מחלות לב מולדות (CHD) בשל המבנה האסימטרי של הלב6. מחקרים אחרונים דיווחו על שכיחות גבוהה של תפקוד לקוי של מערכת הנשימה של חולים עם CHD, כמו גם שכיחות מוגברת של סיבוכים נשימתיים לאחר הניתוח ותסמינים כרוניים בדרכי הנשימה בדרכי הנשימה העליונות והתחתונות7,8,9,10. חולים עם CHD ותפקוד לקוי, עם או בלי הטרוטקסיה, הוכחו כסיכון מוגבר לסיבוכים נשימתיים ותוצאות נשימתיות שליליות לאחר הניתוח5,8,10. מעבר לתפקידם באיתות ופיתוח, החשיבות של ריסוני דרכי הנשימה הוכח על ידי ciliopathies, אשר דוגמה מעולה היא דיסקינזיה ciliary העיקרי (PCD). PCD היא הפרעה מולדת הנובעת ממספר מוטציות המשפיעות על ריסים נשימתיים מוטיב, המוביל דלקות ריאות חוזרות ונשנות, bronchiectasis, ופוטנציאל הצורך בהשתלת ריאות11. בנוסף, למרות ריסונים נורמליים סיסטיק פיברוזיס (CF), ההפרעה מולדת הנפוצה ביותר באוכלוסייה הקווקזית, MCC נפגע עקב ריר עבה, צמיג הנובע מוטציות בגן CFTR12. ישנם דגמי עכבר מרובים של PCD ו- CF, כמו גם מספר גדל והולך של דגמים של CHD. בסופו של דבר ריסונים הם מבנים רב-תכליתיים עם תפקידי מפתח רבים, ושיטה להערכת תפקודם של ריסונים נשימתיים מוטיבים ב- vivo יכולה להיות בעלת ערך למחקר פרה-קליני, ולהערכת ההשפעות של מוטציות כמו גם תרופות על סיווג רירי (MCC)13. השיטה תהיה גם בעלת ערך בהערכת ההשפעות של תרופות חדשניות, ריפוי גנטי או התערבויות על MCC במודלים אלה של העכבר.
ישנם מודלים רבים ושונים ששימשו להערכת MCC. שיטה בולטת אחת כרוכה בשימוש בצבע כחול מתילן שהוחדיר לתוך הסימפונות, עם אישור נמדד על ידי מדידה סיבית של תנועת צבע14. שיטה זו מוגבלת על ידי היכולת להתבונן בתנועה של הצבע, שהוא שגרתי יותר בבני אדם מאשר במודלים פרה-קליניים של עכברים. שיטה בולטת נוספת היא הדמיית רנטגן סינכרון שלב ניגודיות (PCXI), אשר ניתן להשתמש בהם כדי לעקוב אחר חלקיקים בודדים בדרכי הנשימה. שיטה זו חדשה יחסית ולא נגישה באופן נרחב15. ישנן שיטות ex vivo רבות להערכת דרכי הנשימה על ידי כריתת קנה הנשימה עבור וידאו מיקרוסקופיה, אולם מודלים אלה מספקים תועלת מועטה בחולים אנושיים16. טכניקות ברזולוציה גבוהה להדמיית ריסים כגון טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית מוגבלות באותואופן 17.
במאמר זה, אנו מציגים שיטה לשחזור כדי למדוד MCC ב vivo ששימש למדידת סיווגי ריאות במודלים רבים של בעלי חיים, כמו גם מחקר MCC במחלת ריאות חסימתית כרונית ולהעריך את ההשפעות של תרופות לדיכוי המערכת החיסונית18,19. שיטה זו עוקבת אחר האישור של קולואיד טכנציום-גופרית רדיופארמה 99m(99mTc-Sc), רדיוטר חלקיקי בלתי מסיס, לאחר החדרה לריאות. לאחר מכן ניתן לעקוב אחר הרדיונוקליד באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת פליטת פוטון יחיד (SPECT)18,20. יש לנו עוד יותר מעודן טכניקה זו למדידת MCC באמצעות SPECT מודאליות כפולה טומוגרפיה ממוחשבת (CT) הדמיה עם לוקליזציה משותפת של ספירות radioisotope לריאות ומדידת הירידה בספירות אלה מעל 6 שעות. הדמיה דו-מודאלית, עם רישום משותף של תמונות CT ו- SPECT מאפשר לוקליזציה מדויקת של ספירת קרינה לאזור העניין שלנו, הריאות. למרות שאנו מתארים בפירוט את השיטה למדידת MCC בעכברים, ניתן להתאים את הפרוטוקול כדי ללמוד MCC בחולדות. הקולימטורים יצטרכו להיות מותאמים, כמו גם מינון קרינה. לדעתנו, סריקות MCC עכבר הם מאתגרים יותר מבחינה טכנית בשל גודל בעלי החיים הקטנים, אבל שימושי יותר מאשר חולדות בשל מספר גדול של מודלים עכבר הוקמה של מספר הפרעות אנושיות. בנוסף, בשל העלות הנמוכה יותר שלהם ועלות התחזוקה במושבות בעלי חיים, גודל מדגם גדול יותר הוא ריאלי יותר בעכברים.

<table><tbody><tr><td>500 &amp;micro;m Unjacketed Fiber Optic Wire</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td></td></tr><tr><td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Vaporizer</td><td>Vetland Medical</td><td>A13480</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety Catheters 20G 1inch</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1534477</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>118-2097</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Intubation Stand</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE-01</td><td></td></tr><tr><td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Channel Anesthesia Stand</td><td>Summit Anesthesia Solutions</td><td>22860</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice

ריסים מוטיב נשימתי, אברונים מיוחדים של התא, קו פני השטח apical של תאי אפיתל רירית דרכי הנשימה. על ידי מכות באופן מטכרוני, סינכרוני, אלה מרובים, motile, actin מבוססי organelles ליצור זרימת נוזל cephalad ניקוי דרכי הנשימה של מזהמים בשאיפה ופתוגנים. עם זיהום סביבתי גובר, פתוגנים ויראליים חדשניים וחיידקים עמידים לתרופות מרובות, סיווג רירית שנוצר על ידי ריסים (MCC) חיוני לשמירה על בריאות הריאות. MCC הוא גם מדוכא בהפרעות מולדות מרובות כמו דיסקינזיה ciliary ראשונית, סיסטיק פיברוזיס, כמו גם הפרעות נרכשות כמו מחלת ריאות חסימתית כרונית. כל ההפרעות האלה הקימו, במקרה מסוים מרובים, מודלים עכבר. בפרסום זה, אנו מפרטים שיטה המשתמשת בכמות קטנה של רדיואקטיביות והדמיית SPECT/CT דו-מודאלית כדי למדוד MCC במדויק ושחזור בעכברים ב- vivo. השיטה מאפשרת התאוששות של עכברים לאחר הדמיה, הפיכת מדידות סדרתיות לאפשריות, ובדיקת טיפולים פוטנציאליים לאורך זמן. הנתונים בעכברים מסוג בר מדגימים את יכולת השחזור של מדידת MCC כל עוד משולמת תשומת לב מספקת לפרטים, והפרוטוקול דבק בקפדנות.

באמצעות פרוטוקול זה, אנחנו מורדמת עכברים בתא isoflurane (איור 1A). לאחר שהשיגו רמה נאותה של הרדמה, עכברים הונחו על תמיכות אנכיות (איור 1B) ומיתרי הקול הוצגו באמצעות חוט מנחה מואר(איור 1C-1D). העכברים היו צנרור והחדיר עם 0.2 mCi 99mTc-Sc בכמויות של 10 μL דרך קנולה ועכברים מותר לשאוף באופן ספונטני לתוך הריאות (איור 1E-1F). לאחר רכישת ועיבוד התמונה, תמונות ה-CT וה-SPECT היו מקולוסליות (איור 2A)תוך שימוש בצינור הפנטום כציון דרך (איור 2B). מסכות הריאות נוצרו מתמונת CT (איור 2C) ושימשו למשיכה של ROIs סביב הריאה הימנית לניתוח ב- 0 (איור 2D) ו- 6 שעות (איור 2E-2F). כדי לבדוק את יכולת השחזור של הפרוטוקול, נסרקו בסך הכל 8 עכברים פעמיים בימים שונים עם תנאי ניסוי זהים, כאשר ניתוח באמצעות מבחן t מזווג לא מראה הבדל משמעותי בין הסריקות החוזרות (p-value=0.9904)(איור 3A). שני עכברים נוספים נסרקו שלוש פעמים בימים שונים עם תנאי ניסוי זהים, כאשר ניתוח באמצעות ANOVA חד-כיווני מראה התאמה משמעותית בין הסריקות החוזרות (p-value של 0.0041)(איור 3B). בסך הכל נסרקו 8 עכברים והוצגו שתי תמונות מייצגות (איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> איור 1: אינטובציה של עכבר והטמעת איזוטופים. תמונות של השלבים הדרושים כדי לצנרר ולהחדיר איזוטופ לתוך דרכי הנשימה. A) העכבר מורדם בתא. ב)העכבר המומר ממוקם על תמיכה אנכית, מושעה על ידי החותכים הקדמיים. C) חוט סיב אופטי מואר 0.5 מ"מ המשמש כחוט מדריך מוכן על ידי הפעלתו דרך קנולה 20 G. ד)פיו של העכבר נפתח באמצעות מלקחיים ומואר באמצעות המדריך המואר כדי לדמיין את מיתרי הקול. E) הצינורית נדחפת על פני מיתרי הקול והמדריך מוסר. F) איזוטופ מסיס הוא החדיר לתוך הצינורית באמצעות פיפטה והעכבר מותר לשאוף באופן ספונטני את האיזוטופ לתוך הריאות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> איור 2: תמונות SPECT/CT של סריקת MCC. A) תמונת SPECT שהותאם במשותף עם תמונת CT. B) תמונת CT עם צינור פנטום גלוי ששימש ללוקליזציה משותפת. ג)מסכה של דרכי הנשימה הנגזרת על ידי binarizing תמונת CT וביצוע הקרנת סכום מחסנית z. D) מסיכת CT מותאמת במשותף עם תמונת SPECT. החזר על ההשקעה לניתוח נמשך סביב הריאה הימנית. ה)מסכה של דרכי הנשימה בשעה 6 שעות. F) CT ו SPECT תמונה משותפת של דרכי הנשימה ב 6 שעות עם החזר על ההשקעה לניתוח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> איור 3: מדידות אישור של אותם עכברים בסריקות מרובות. א)שני סיווגים חוזרים בודדים נמדדו עבור 8 עכברים ללא שינויים בתנאי הניסוי. בדיקת t מזווגת הראתה כי לא היה הבדל משמעותי בין הסריקות החוזרות עם ערך p של 0.9904. ב)שלושה סיווגים חוזרים בודדים נמדדו עבור שני עכברים ללא שינויים בתנאי הניסוי. ANOVA חד כיווני הראה שיש התאמה משמעותית בין הסריקות החוזרות עם ערך p של 0.0041. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> איור 4: תמונות SPECT/CT המותאמות לשפות נוספות של דרכי הנשימה של 0 ו- 6 שעות בשני עכברים עם ROIs שצוירו ב- 0 ו- 6 שעות המתארות את הריאה הימנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור 1 משלימה: סרטון של מיתרי הקול המוארים בחוט סיב אופטי עם השפעת הנשימה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.</a>
קבצים משלימים. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קבצים אלה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice at JoVE.com

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

בפרסום זה, אנו מתארים פרוטוקולים להערכת סיווג רירי בדרכי הנשימה (MCC) בעכברים ב vivo ניצול הדמיה רדיונוקלדית דו-מודאלית. פרוטוקול זה מיועד טומוגרפיה ממוחשבת פליטת פוטון יחיד (SPECT) ופרוטוקול רכישת טומוגרפיה ממוחשבת (CT) באמצעות עכבר גוף שלם (MWB) collimators במערכת SPECT / CT כפול.

In vivo הערכה של אישור Mucociliary בעכברים

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

in-vivo-evaluation-of-mucociliary-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

4.3K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. בפרסום זה, אנו מתארים פרוטוקולים להערכת סיווג רירי בדרכי הנשימה (MCC) בעכברים ב vivo ניצול הדמיה רדיונוקלדית דו-מודאלית. פרוטוקול זה מיועד טומוגרפיה ממוחשבת פליטת פוטון יחיד (SPECT) ופרוטוקול רכישת טומוגרפיה ממוחשבת (CT) באמצעות עכבר גוף שלם (MWB) collimators במערכת SPECT / CT כפול....

Video: In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

דגם Murine של אסטמה אלרגן מושרה

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Immunology and Infection

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

במדידת vivo של שכבת פני שטח האנדותל ריאתי המאוסה

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Medicine

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

הפיך, לא פולשני שיטת ההתנגדות מדידות דרכי הנשימה ואת נוזל שטיפה ברונכואלוואולרית דגימה של עכברים

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

הערכה של מכניקת מערכת נשימה בעכברים באמצעות טכניקת תנודה בכפייה

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to non-invasively assess some features of the respiratory function in humans as well as in laboratory animals. The present article focuses on the application of the double-chamber plethysmography (DCP) in small animals. It provides background information on the methodology as well as a detailed step-by-step procedure to successfully assess respiratory function in conscious, spontaneously breathing animals in a non-invasive manner. The DCP can be used to monitor the respiratory function of multiple animals in parallel, as well as to identify changes induced by aerosolized substances over a chosen time period and in a repeated manner. Experiments on control and allergic mice are used herein to demonstrate the utility of the technique, explain the associated outcome parameters, as well as to discuss the related advantages and shortcomings. Overall, the DCP provides valid and theoretically sound readouts that can be trusted to evaluate the respiratory function of conscious small animals both at baseline and after challenges with aerosolized substances.

The objective of the present article is to provide a detailed description of the recommended procedures to evaluate respiratory function in conscious mice by double-chamber plethysmography.

הערכה של תפקוד מערכת הנשימה בעכברים בהכרה על ידי כפול-תא Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful in cases of attenuated, oligo- or mono-symptomatic forms of CF usually diagnosed later in life, and of CF-related disorders such as congenital bilateral absence of vas deferens, idiopathic chronic pancreatitis, allergic bronchopulmonary aspergillosis, and bronchiectasis. In both clinical and preclinical settings, the test has been used as a biomarker to quantify responses to targeted therapeutic strategies for CF. Adapting the test to a mouse is challenging and can entail an associated mortality. This paper describes the adequate depth of anesthesia required to maintain a nasal catheter in situ for continuous perfusion. It lists measures to avoid broncho-aspiration of solutions perfused in the nose. It also describes the animal care at the end of the test, including administration of a combination of antidotes of the anesthetic drugs, leading to rapidly reversing the anesthesia with full recovery of the animals. Representative data obtained from a CF and a wild-type mouse show that the test discriminates between CF and non-CF. Altogether, the protocol described here allows reliable measurements of the functional status of trans-epithelial chloride and sodium transporters in spontaneously breathing mice, as well as multiple tests in the same animal while reducing test-related mortality.

Here, we present a protocol to measure nasal potential difference in mice. The test quantifies the function of transmembrane ion transporters such as the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and the epithelial sodium channel. It is valuable to evaluate the efficacy of novel therapies for cystic fibrosis.

האף הפרש הפוטנציאלים לכמת תחבורה טרנס-אפיתל יון בעכברים

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

פלטיסמוגרפיה לא פולשנית בזמן אמת לכל הגוף לרגישות לשיעול בעכברים

Methods for Detecting Cough and Airway Inflammation in Mice

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge socioeconomic burden and a marked decrement in quality of life. Animal models can mimic the complex pathophysiology of the cough and are important tools for cough research. The detection of cough sensitivity and airway inflammation is of great significance for studying the complex pathological mechanism of cough. This article describes the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples (including blood, lung, spleen, and trachea) of mice. It introduces some methods to assess airway inflammation, including pathological changes in hematoxylin and eosin (HE)-stained lung and trachea sections, the total protein concentration, the uric acid concentration, and the lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant of bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and the leukocytes and differential cell counts of BALF. These methods are reproducible and serve as valuable tools to study the complex pathophysiology of cough.

מחבר זרקור: חקירת הפתופיזיולוגיה של שיעול כרוני

Here, we describe the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples of mice and introduce some methods to assess airway inflammation.

שיטות לאיתור שיעול ודלקת בדרכי הנשימה בעכברים

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge ...