Cette recherche vise à établir un protocole efficace pour préserver le contenu des voies respiratoires de souris dans des modèles d’infection pulmonaire. Nous développons la capacité de répondre à la question de savoir où les spores fongiques inhalées atterrissent dans les poumons. Récemment, de nombreux groupes ont identifié le rôle de diverses cellules épithéliales des voies respiratoires dans la détection des infections et l’initiation de réponses immunitaires protectrices.
Ces cellules épithéliales vont des cellules massues dans les bronches aux cellules épithéliales de type II dans les alvéoles terminales. La technique courante de préparation pulmonaire consiste à gonfler le poumon avec le fixateur liquide afin de préserver le tissu pulmonaire pour les analyses histologiques en aval. Cependant, cette technique déplace le contenu des voies respiratoires, comme les spores fongiques inhalées.
Notre protocole préserve l’emplacement naturel des spores fongiques inhalées dans les poumons tout en maintenant une morphologie pulmonaire appropriée par gonflage à l’air et une fixation pulmonaire correcte par perfusion vasculaire. Nous espérons utiliser ce protocole pour caractériser les jonctions broncho-alvéolaires où les spores semblent atterrir dans notre modèle, mais nous utiliserons les emplacements des spores à proximité de diverses cellules épithéliales et étudierons les réponses immunitaires qui en résultent. Pour commencer, colorez une fois 10 à la puissance six spores de Coccidioides posadasii avec une concentration micromolaire de cinq micromolaires de CFSE pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius.
Après la coloration, lavez les spores avec du PBS. Centrifuger les spores à 12 000 g et remettre la pastille en suspension dans 25 microlitres de PBS pour l’inoculum des spores à la concentration appropriée. Préparez une pipette avec 25 microlitres d’inoculum de spores.
Après avoir anesthésié la souris dans un bocal Nalgene, positionnez-la en position couchée d’une main et laissez-la prendre trois à cinq respirations haletantes régulières. Placez l’embout de la pipette à l’arrière de l’oropharynx de la souris et libérez l’inoculum lors de l’inhalation. Sentez les craquelures sur les faces postérieure et antérieure du thorax de la souris avec la main et le pouce pour confirmer l’inhalation de l’inoculum.
Vaporisez la souris profondément anesthésiée avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide de ciseaux, coupez soigneusement la peau de la souris, puis séparez-la pour exposer le péritoine. Ensuite, tirez la peau de la moitié supérieure sur la tête de la souris, libérant ainsi les bras.
Maintenant, coupez la membrane péritonéale au niveau du sternum et le long de la face inférieure de la cage thoracique, exposant le péritoine. Déplacez le foie vers le bas pour révéler le diaphragme. À l’aide de ciseaux, percez soigneusement le diaphragme pour l’éloigner du parenchyme pulmonaire.
Ensuite, coupez la cage thoracique sur le côté gauche pour exposer le cœur. À l’aide d’une aiguille de calibre 30, injectez cinq à 10 millilitres de PBS dans le ventricule droit. Après avoir retiré l’aiguille, utilisez une nouvelle aiguille pour injecter cinq millilitres de formol tamponné à 10 % neutre dans le ventricule droit.
À l’aide de ciseaux, retirez la moitié antérieure de la cage thoracique. Pour exposer la trachée, coupez les côtes supérieures et les clavicules à droite et à gauche du cou, en évitant la ligne médiane où se trouve la trachée. À l’aide d’une pince, saisissez les côtes supérieures et les clavicules restantes près de la ligne médiane du cou et tirez vers le haut jusqu’à ce que la trachée soit exposée.
Préparez un fil de suture de 10 centimètres et tirez-le sous la trachée. Faites un nœud lâche à l’extrémité inférieure de la trachée exposée. Ensuite, préparez une seringue d’air d’un millilitre avec un cathéter de calibre 18.
À l’aide d’une aiguille de calibre 18, faites un trou dans la trachée à l’extrémité supérieure de la région exposée. Maintenant, insérez le cathéter dans le trou, en assurant un ajustement serré pour empêcher l’air de s’échapper. Ensuite, injectez lentement un millilitre d’air dans les poumons pendant 10 secondes, en surveillant le gonflement de tous les lobes pulmonaires.
Le gonflage complet fait que les poumons s’enroulent légèrement autour du cœur et remplissent le volume occupé dans le diaphragme non perforé. Après avoir isolé les poumons de la souris, placez-le sur le bord supérieur d’un tube conique de 50 millilitres rempli de 20 millilitres de formol tamponné à 10 % neutre. Placez les fils de suture à l’extérieur du tube, puis vissez le capuchon.
Pour commencer, rincez les poumons de souris isolés dans du PBS et placez-les dans une solution de PBS à 30 % de saccharose pendant 72 à 96 heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez l’excès de tissu et placez les poumons dans un cryomoule avec un milieu OCT. Congelez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius.
Équilibrez l’échantillon dans des cryoblocs OCT à moins 20 degrés Celsius pendant une heure avant de sectionner les blocs à 20 à 100 micromètres d’épaisseur. Rassemblez les sections sur une lame de verre et laissez-les sécher pendant 30 minutes à une heure. Placez la lame dans un bain PBS à température ambiante pendant 30 minutes pour éliminer l’OCT du tissu.
Ensuite, utilisez une lingette pour enlever les gouttelettes en excès du périmètre de la lame autour de l’échantillon de tissu. Tracez un périmètre autour de l’échantillon sur la lame à l’aide d’un stylo PAP hydrophobe et laissez-le sécher pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de solution de blocage sans animaux fraîchement préparée sur la lame et incubez à température ambiante.
Maintenant, incubez la lame dans 300 microlitres de solution d’anticorps EpCAM primaire conjuguée contre le rat Alexa Fluor 647 pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez la solution d’anticorps et lavez la lame deux fois avec 300 microlitres de PBS pendant cinq minutes. Après séchage, ajoutez une goutte de support de montage en verre SlowFade à température ambiante sur chaque morceau de tissu.
Placez une lamelle sur le tissu, en vous assurant qu’il s’étend au-delà de l’échantillon et du périmètre du marqueur hydrophobe. Pour commencer, placez la section pulmonaire de souris immunomarquée inoculée de spores fongiques sous un microscope fluorescent multicanaux et sélectionnez un objectif approprié. Pour capturer l’ensemble du lobe pulmonaire, collectez suffisamment de tuiles d’image et fusionnez-les.
À l’aide du logiciel du microscope, exportez l’image de l’ensemble du lobe pulmonaire pour un traitement en aval. Dans QuPath, créez un fichier projet et ajoutez-y les images fluorescentes. Classez les pixels positifs EpCAM en tant qu’épithélium en sélectionnant séquentiellement Classify, Classification Pixel et Create thresholder.
Sélectionnez la résolution, le canal, le sigma de lissage et la valeur de seuil pour identifier la région cible. Enregistrez le classificateur sous un nom unique et sélectionnez Créer des objets. Dans la nouvelle fenêtre Créer des objets, sélectionnez Nouveau type d’objet en tant qu’annotation.
Pour l’épithélium pulmonaire, réglez la taille minimale de l’objet et la taille minimale du trou à 100 micromètres carrés. Après avoir sélectionné OK, les annotations seront créées et pourront être modifiées à l’aide de l’outil pinceau. Pour classer les spores, répétez les étapes comme indiqué pour les annotations de l’épithélium pulmonaire.
Ensuite, dans la fenêtre Créer des objets, sélectionnez Détection comme nouveau type d’objet. Définissez la taille minimale de l’objet et la taille minimale du trou sur zéro micromètre carré et sélectionnez Diviser les objets. Ensuite, pour effectuer une analyse spatiale des spores de manière séquentielle, sélectionnez Analyser, Analyse spatiale, et calculez la distance signée par rapport aux annotations bidimensionnelles.
Les distances jusqu’à l’épithélium positif à l’EpCAM seront calculées pour chaque spore détectée. Enfin, cliquez sur Mesurer, puis sur Exporter les mesures pour exporter les résultats. Les spores de Coccidioides posadasii se sont accumulées principalement dans les bronches distales et les espaces alvéolaires voisins des poumons gonflés à l’air.
Les spores semblaient plus dispersées loin des bronches dans les poumons formels et gonflés de liquide que dans les poumons gonflés à l’air. La distance entre les spores et l’épithélium bronchiolaire positif à l’EpCAM était plus grande dans les poumons gonflés par liquide que dans le gonflage physiologique de l’air, ce qui indique des spores plus dispersées.
