Bu araştırma, akciğer enfeksiyonu modellerinde farelerin hava yolu içeriğini korumak için etkili bir protokol oluşturmayı amaçlamaktadır. Solunan mantar sporlarının akciğerlerde nereye indiği sorusuna cevap verme kapasitesini geliştiriyoruz. Son zamanlarda, birçok grup, enfeksiyonları algılamada ve koruyucu immün yanıtları başlatmada çeşitli hava yolu epitel hücrelerinin rollerini tanımlamıştır.
Bu epitel hücreleri, bronşlardaki kulüp hücrelerinden terminal alveollerdeki tip II epitel hücrelerine kadar değişir. Yaygın akciğer hazırlama tekniği, aşağı akış histolojik analizler için akciğer dokusunu korumak için akciğeri sıvı fiksatif ile şişirmektir. Bununla birlikte, bu teknik, solunan mantar sporları gibi hava yollarının içeriğinin yerini alır.
Protokolümüz, solunan mantar sporlarının akciğerdeki doğal konumunu korurken, hava şişirme yoluyla uygun akciğer morfolojisini ve vasküler perfüzyon yoluyla uygun akciğer fiksasyonunu korur. Bu protokolü, sporların modelimize iniyor gibi göründüğü bronkoalveolar kavşakları karakterize etmek için kullanmayı umuyoruz, ancak sporların çeşitli epitel hücrelerine yakın konumlarını kullanacağız ve ortaya çıkan bağışıklık tepkilerini inceleyeceğiz. Başlamak için, 30 santigrat derecede 30 dakika boyunca beş mikromolar CFSE konsantrasyonu ile altı Coccidioides posadasii sporunun gücüne 10 kez boyayın.
Boyamadan sonra sporları PBS ile yıkayın. Sporları 12.000 g'da santrifüjleyin ve peleti uygun konsantrasyonda spor aşısı için 25 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. 25 mikrolitre spor aşısı içeren bir pipet hazırlayın.
Fareyi bir Nalgene kavanozunda uyuşturduktan sonra, fareyi bir elinizle sırtüstü pozisyonda konumlandırın ve üç ila beş düzenli nefes almasına izin verin. Pipet ucunu fare orofarenksinin arkasına yerleştirin ve inhalasyon sırasında aşıyı serbest bırakın. İnokulumun solunmasını doğrulamak için fare göğüs kafesinin arka ve ön yönlerinde elinizle ve başparmağınızla çatlaklar hissedin.
Derin anestezi uygulanmış fareye %70 etanol püskürtün. Makas kullanarak farenin derisini dikkatlice kesin, ardından peritonu ortaya çıkarmak için ayırın. Ardından, cildi farenin başının üst yarısından çekerek kolları serbest bırakın.
Şimdi, periton zarını sternumda ve göğüs kafesinin alt yüzü boyunca kesin ve peritonu açığa çıkarın. Diyaframı ortaya çıkarmak için karaciğeri daha aşağı doğru hareket ettirin. Diyaframı akciğer parankiminden dikkatlice delmek için makas kullanın.
Ardından, kalbi ortaya çıkarmak için sol taraftaki göğüs kafesini kesin. 30 gauge bir iğne kullanarak, sağ ventriküle beş ila 10 mililitre PBS enjekte edin. İğneyi çıkardıktan sonra, sağ ventriküle beş mililitre% 10 nötr tamponlu formalin enjekte etmek için yeni bir iğne kullanın.
Makas kullanarak göğüs kafesinin ön yarısını çıkarın. Trakeayı ortaya çıkarmak için, trakeanın bulunduğu orta hattan kaçınarak üst kaburgaları ve köprücük kemiklerini boynun sağına ve soluna kesin. Forseps kullanarak, kalan üst kaburgaları ve köprücük kemiklerini boyun orta hattına yakın bir yerde sıkın ve trakea açığa çıkana kadar üstünden çekin.
10 santimetrelik bir dikiş ipliği hazırlayın ve soluk borusunun altına çekin. Açıkta kalan trakeanın alt ucunda gevşek bir düğüm atın. Ardından, 18 gauge kateter ile bir mililitrelik bir hava şırıngası hazırlayın.
18 gauge bir iğne kullanarak, maruz kalan bölgenin üst ucunda trakeada bir delik açın. Şimdi, kateteri deliğe yerleştirin ve havanın kaçmasını önlemek için sıkı bir şekilde oturduğundan emin olun. Ardından, tüm akciğer loblarının şişmesini izleyerek 10 saniye boyunca akciğerlere yavaşça bir mililitre hava enjekte edin.
Tam şişme, akciğerlerin kalbin etrafına hafifçe sarılması ve delinmemiş diyaframda işgal edilen hacmin doldurulması ile sonuçlanır. Akciğerleri fareden izole ettikten sonra, 20 mililitre% 10 nötr tamponlu formalin ile doldurulmuş 50 mililitrelik konik bir tüpün üst kenarına yerleştirin. Dikiş dişlerini tüpün dışına yerleştirin, ardından kapağı vidalayın.
Başlamak için, izole edilmiş fare akciğerlerini PBS'de durulayın ve bunları dört santigrat derecede 72 ila 96 saat boyunca% 30 sükroz PBS çözeltisine yerleştirin. Daha sonra, fazla dokuyu çıkarın ve akciğerleri OCT ortamlı bir Cryomold'a yerleştirin. Numuneyi eksi 80 santigrat derecede dondurun.
Blokları 20 ila 100 mikrometre kalınlığında bölmeden önce numuneyi eksi 20 santigrat derecede OCT kriyobloklarında bir saat boyunca dengeleyin. Bölümleri bir cam slayt üzerine toplayın ve 30 dakika ila bir saat arasında kurumasını bekleyin. OCT'yi dokudan çıkarmak için slaytı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir PBS banyosuna yerleştirin.
Ardından, doku örneğinin etrafındaki slaydın çevresinden fazla damlacıkları çıkarmak için bir mendil kullanın. Hidrofobik bir PAP kalemi kullanarak slayttaki numunenin etrafına bir çevre çizin ve beş dakika kurumasını bekleyin. Daha sonra, slayta 300 mikrolitre taze hazırlanmış hayvansız engelleme solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında inkübe edin.
Şimdi, slaytı 300 mikrolitre birincil Alexa Fluor 647 konjuge sıçan anti-fare EpCAM antikor çözeltisi içinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, antikor çözeltisini çıkarın ve slaytı iki kez 300 mikrolitre PBS ile beş dakika boyunca yıkayın. Kuruduktan sonra, her bir doku parçasına bir damla oda sıcaklığında yumuşak sertleşen SlowFade cam montaj ortamı ekleyin.
Dokunun üzerine, numunenin ve hidrofobik işaretleyici çevresinin ötesine uzandığından emin olacak şekilde bir lamel yerleştirin. Başlamak için, mantar sporu aşılanmış, bağışıklığı boyanmış fare akciğer bölümünü çok kanallı bir floresan mikroskobu altına yerleştirin ve uygun bir objektif seçin. Akciğer lobunun tamamını yakalamak için yeterli sayıda görüntü döşemesi toplayın ve bunları birleştirin.
Mikroskobun yazılımını kullanarak, sonraki işlemler için tüm akciğer lobunun görüntüsünü dışa aktarın. QuPath'te bir proje dosyası oluşturun ve floresan görüntüleri dosyaya ekleyin. EpCAM pozitif pikselleri sırayla Sınıflandır, Piksel sınıflandırması ve Eşikleyici oluştur'u seçerek epitel olarak sınıflandırın.
Hedef bölgeyi tanımlamak için çözünürlüğü, kanalı, yumuşatma sigmasını ve eşik değerini seçin. Sınıflandırıcıyı benzersiz bir adla kaydedin ve Nesne oluştur'u seçin. Yeni Nesne oluştur penceresinde, Ek Açıklama olarak Yeni nesne türü'nü seçin.
Akciğer epiteli için minimum nesne boyutunu ve minimum delik boyutunu 100 mikrometre kare olarak ayarlayın. Tamam'ı seçtikten sonra, ek açıklamalar oluşturulur ve fırça aracı kullanılarak değiştirilebilir. Sporları sınıflandırmak için, akciğer epitel açıklamaları için gösterildiği gibi adımları tekrarlayın.
Ardından, Nesne oluştur penceresinden, yeni nesne türü olarak Algılama'yı seçin. Minimum nesne boyutunu ve minimum delik boyutunu sıfır mikrometre kare olarak ayarlayın ve Nesneleri böl'ü seçin. Ardından, sporların uzamsal analizini sırayla yapmak için Analiz, Uzamsal analiz'i seçin ve iki boyutlu ek açıklamalara işaretli mesafeyi hesaplayın.
Tespit edilen her spor için EpCAM pozitif epitele olan mesafeler hesaplanacaktır. Son olarak, sonuçları dışa aktarmak için Ölç'ü ve ardından Ölçümleri dışa aktar'ı tıklayın. Coccidioides posadasii sporları esas olarak distal bronşlarda ve hava ile şişirilmiş akciğerlerde yakındaki alveolar boşluklarda birikir.
Sporlar, hava ile şişirilmiş akciğerlere kıyasla resmi ve sıvı ile şişirilmiş akciğerlerde bronşlardan daha fazla dağılmış görünüyordu. Sporlar ve EpCAM pozitif bronşiolar epitel arasındaki mesafe, sıvı ile şişirilmiş akciğerlerde fizyolojik hava şişirme ile karşılaştırıldığında daha fazlaydı ve bu da daha fazla dağınık sporu gösteriyordu.
