본 연구는 폐 감염 모델에서 생쥐의 기도 내용물을 보존하기 위한 효율적인 프로토콜을 확립하는 것을 목표로 합니다. 우리는 흡입된 곰팡이 포자가 폐의 어디에 도달하는지에 대한 질문에 답할 수 있는 능력을 개발하고 있습니다. 최근에는 많은 그룹에서 감염을 감지하고 보호 면역 반응을 시작하는 다양한 기도 상피 세포의 역할을 확인했습니다.
이러한 상피 세포는 기관지의 곤봉 세포에서 말단 폐포의 II형 상피 세포에 이르기까지 다양합니다. 일반적인 폐 준비 기술은 다운스트림 조직학적 분석을 위해 폐 조직을 보존하기 위해 액체 고정제로 폐를 팽창시키는 것입니다. 그러나 이 기술은 흡입된 곰팡이 포자와 같은 기도의 내용물을 대체합니다.
당사의 프로토콜은 공기 팽창을 통해 적절한 폐 형태를 유지하고 혈관 관류를 통해 적절한 폐 고정을 유지하면서 폐에서 흡입된 곰팡이 포자의 자연스러운 위치를 보존합니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여 포자가 우리 모델에 착륙하는 것으로 보이는 기관지폐포 접합부를 특성화하기를 희망하지만, 다양한 상피 세포에 근접한 포자의 위치를 활용하고 그에 따른 면역 반응을 연구할 것입니다. 시작하려면 섭씨 30도에서 30 분 동안 5 마이크로 몰 농도의 CFSE로 6 개의 Coccidioides posadasii 포자의 힘에 10을 곱하여 염색하십시오.
염색 후 PBS로 포자를 씻으십시오. 12, 000 g에 포자를 분리기로 하고 적합한 농도에 포자 inoculum를 위한 PBS의 25 마이크로리터에 있는 펠릿을 resuspend. 25 마이크로 리터의 포자 접종물이 든 피펫을 준비하십시오.
Nalgene 병에 마우스를 마취한 후 한 손에 쥐를 누운 자세로 놓고 3-5번의 규칙적인 헐떡임 호흡을 하도록 합니다. 피펫 끝을 쥐 구인두의 뒤쪽에 놓고 흡입하는 동안 접종물을 방출합니다. 쥐 흉부의 뒤쪽과 앞쪽에서 딱딱거리는 소리를 손과 엄지손가락으로 느껴보고 접종물의 흡입을 확인합니다.
심하게 마취된 마우스에 70%에탄올을 분사합니다. 가위를 사용하여 마우스의 피부를 조심스럽게 잘라낸 다음 당겨서 복막을 드러냅니다. 그런 다음 마우스의 머리 위로 위쪽 절반의 피부를 당겨 팔을 풀어줍니다.
이제 흉골과 흉곽의 아래쪽을 따라 복막을 잘라 복막을 노출시킵니다. 횡격막을 드러내기 위해 간을 열등하게 변위시킵니다. 가위를 사용하여 횡격막을 폐 실질에서 조심스럽게 뚫습니다.
다음으로 왼쪽의 흉곽을 잘라 심장을 노출시킵니다. 30게이지 바늘을 사용하여 5-10ml의 PBS를 우심실에 주입합니다. 바늘을 제거한 후 새 바늘을 사용하여 10% 중성 완충 포르말린 5ml를 우심실에 주입합니다.
가위를 사용하여 흉곽의 앞쪽 절반을 제거합니다. 기관을 노출시키려면 기관이 있는 정중선을 피하고 목의 오른쪽과 왼쪽에 있는 위쪽 갈비뼈와 쇄골을 자릅니다. 집게를 사용하여 목 정중선 근처의 나머지 위쪽 갈비뼈와 쇄골을 잡고 기관이 노출될 때까지 위쪽으로 당깁니다.
10cm 봉합사를 준비하여 기관 아래로 당깁니다. 노출된 기관의 아래쪽 끝에 느슨한 매듭을 미리 묶습니다. 그런 다음 18게이지 카테터로 1ml 공기 주사기를 준비합니다.
18게이지 바늘을 사용하여 노출된 부위의 위쪽 끝에 있는 기관에 구멍을 뚫습니다. 이제 카테터를 구멍에 삽입하여 공기가 빠져나가지 않도록 단단히 끼워줍니다. 그런 다음 10초에 걸쳐 1ml의 공기를 폐에 천천히 주입하여 모든 폐엽이 팽창하는 것을 관찰합니다.
완전히 팽창하면 폐가 심장을 약간 감싸고 구멍이 뚫리지 않은 횡격막에서 차지하는 부피를 채웁니다. 쥐에서 폐를 분리한 후 20ml의 10% 중성 완충 포르말린으로 채워진 50ml 원뿔형 튜브의 상단 가장자리에 놓습니다. 봉합사를 튜브 바깥쪽에 놓고 캡을 조입니다.
먼저 PBS에서 분리된 마우스 폐를 헹구고 30% 자당 PBS 용액에 넣어 섭씨 4도에서 72-96시간 동안 보관합니다. 그 후, 여분의 조직을 제거하고 폐를 OCT 배지가 있는 크라이오몰드에 넣습니다. 표본을 섭씨 영하 80도에서 동결합니다.
섭씨 영하 20도의 OCT 극저온 블록에서 시료를 1시간 동안 평형을 이룬 후 20-100마이크로미터 두께로 블록을 절단합니다. 유리 슬라이드에 절편을 모아 30분에서 1시간 동안 건조시킵니다. 슬라이드를 실온의 PBS 수조에 30분 동안 넣어 조직에서 OCT를 제거합니다.
그런 다음 물티슈를 사용하여 조직 표본 주변의 슬라이드 주변에서 과도한 물방울을 제거합니다. 소수성 PAP 펜을 사용하여 슬라이드의 표본 주위에 둘레를 그리고 5분 동안 건조시킵니다. 다음으로, 갓 준비한 동물성 차단 용액 300마이크로리터를 슬라이드에 추가하고 실온에서 배양합니다.
이제 300마이크로리터의 기본 Alexa Fluor 647 복합 쥐 항 마우스 EpCAM 항체 용액에서 슬라이드를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 항체 용액을 제거하고 300마이크로리터의 PBS로 슬라이드를 5분 동안 두 번 세척합니다. 건조 후 각 조직 조각에 실온 소프트 세트 SlowFade 유리 장착 매체 한 방울을 추가합니다.
조직 위에 커버슬립을 놓아 샘플과 소수성 마커 둘레를 넘어 확장되도록 합니다. 먼저 진균 포자가 접종된 면역 염색된 마우스 폐 절편을 다중 채널 형광 현미경 아래에 놓고 적절한 대물렌즈를 선택합니다. 전체 폐엽을 캡처하려면 충분한 이미지 타일을 수집하고 함께 병합합니다.
현미경의 소프트웨어를 사용하여 다운스트림 처리를 위해 전체 폐엽의 이미지를 내보냅니다. QuPath에서 프로젝트 파일을 만들고 파일에 형광 이미지를 추가합니다. Classify(분류), Pixel classification(픽셀 분류), Create thresholder(임계값 생성)를 순차적으로 선택하여 EpCAM positive pixels를 상피로 분류합니다.
resolution, channel, smoothing sigma, threshold값을 선택하여 타겟 영역을 식별합니다. 분류자를 고유한 이름으로 저장하고 개체 만들기를 선택합니다. 새 Create objects(개체 만들기) 창에서 New object type(새 개체 유형)을 Annotation(주석)으로 선택합니다.
폐 상피의 경우 최소 개체 크기와 최소 구멍 크기를 100제곱마이크로미터로 설정합니다. 확인을 선택하면 주석이 생성되고 브러시 도구를 사용하여 수정할 수 있습니다. 포자를 분류하려면 폐 상피 주석에 대해 설명된 단계를 반복합니다.
그런 다음, Create objects(개체 만들기) 창에서 Detection(감지)을 새 개체 유형으로 선택합니다. 최소 개체 크기와 최소 구멍 크기를 0제곱 마이크로미터로 설정하고 개체 분할을 선택합니다. 다음으로, 포자의 공간 분석을 순차적으로 수행하려면 분석, 공간 분석을 선택하고 주석에 대한 부호 있는 거리를 2차원으로 계산합니다.
EpCAM 양성 상피까지의 거리는 검출된 각 포자에 대해 계산됩니다. 마지막으로 Measure(측정)를 클릭한 다음 Export measurements(측정값 내보내기)를 클릭하여 결과를 내보냅니다. Coccidioides posadasii의 포자는 주로 원위 기관지와 공기로 팽창된 폐의 인근 폐포 공간에 축적되었습니다.
포자는 공기로 팽창된 폐에 비해 형성된 폐와 액체로 팽창된 폐에서 기관지에서 더 멀리 분산되어 있는 것으로 나타났습니다. 포자와 EpCAM 양성 세기관지 상피 사이의 거리는 생리학적 공기 팽창에 비해 액체로 팽창된 폐에서 더 컸으며, 이는 포자가 더 분산되어 있음을 나타냅니다.
