Generation teratoma nella Capsule Testicolo

Riepilogo

Cellule staminali pluripotenti (hPSCs) hanno il potenziale per trattare una miriade di diverse malattie. L'utilità di queste cellule risiede nel fatto che essi possono differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula del corpo. Qui si descrive il saggio teratoma, che viene utilizzato per dimostrare l'pluripotence di hPSCs.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti (PSC) hanno la caratteristica unica che possono differenziarsi in cellule provenienti da tutti i tre strati germinali. Questo li rende uno strumento potenzialmente utile per il trattamento di molte malattie diverse. Con l'avvento delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) e la ricerca continua con cellule staminali embrionali umane (hESC) vi è la necessità di analisi che possono dimostrare che una linea di cellule pluripotenti particolare. La trasmissione germinale è il gold standard per dimostrare la pluripotence di cellule staminali embrionali del mouse (MESC) linee ^1,2,3. Usando questo test, i ricercatori in grado di dimostrare che una linea MESC può fare tutti i tipi di cellule nell'embrione comprese le cellule germinali ^4. Con la generazione di umana ESC linee ^5,6, il dosaggio appropriato per dimostrare pluripotence di queste cellule è stata chiara, dato che i CES umani non possono essere testati per la trasmissione germinale. Come un surrogato, il saggio teratoma è attualmente utilizzato per dimostrare la pluripotrenza di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) ^7,8,9. Anche se questo test è di recente oggetto di esame e le nuove tecnologie vengono attivamente esplorate, il saggio teratoma è il gold standard attuale ^7. In questo saggio, le cellule in questione sono iniettate in un topo immune compromesso. Se le cellule sono pluripotenti, un teratoma si svilupperà e le sezioni del tumore mostrerà i tessuti da tutti i 3 strati germinali ^10. Nel saggio teratoma, hPSCs può essere iniettato in zone diverse del mouse. I siti di iniezione più comuni includono la capsula testicolo, la capsula rene, il fegato, o nella gamba per via sottocutanea o intramuscolare ^11. Qui si descrive un protocollo robusto per la generazione di teratomi dal hPSCs utilizzando la capsula testicolo come luogo per la crescita tumorale.

Protocollo

Nota: Tutte le procedure sugli animali deve essere approvato dal IACUC o equivalente.

Tutte le attrezzature chirurgiche devono essere sterilizzati prima dell'intervento chirurgico. Guanti sterili, garze e drappi devono essere utilizzati.

1. Preparazione prima dell'intervento

1. Ottenere 6 settimane vecchie Mus musculus CbySmn.CB17 Prkdc-SCID / J topi maschi o altro ceppo immunocompromessi del mouse.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, guanti e garze.
3. Dissociano hPSCs deve essere iniettato con accutase.
4. Contare le cellule e risospendere 1.000.000 cellule per 20-30 pl in matrigel diluito 1:1 in DMEM/F-12. Mantenere le cellule in ghiaccio fino al termine.
5. Si noti che spesso è utile fare una corsa attraverso dell'esperimento in cui viene iniettato Trypan Blue. Questo aiuterà ad identificare i potenziali problemi prima che le cellule sono sprecati.
6. Nel vivarium, anestetizzare il mouse in base alle procedure accettate presso l'istituto. Nei nostri esperimenti, abbiamo utilizzato un AnesthESIA macchina con isoflurano. I topi sono stati inizialmente messi in una camera di induzione con l'ossigeno e il 3-4% 1L/min isoflurano. Una volta anestetizzato, un cono con l'ossigeno e il 2-3% 1L/min isoflurano è stato utilizzato.
7. Shave l'addome con un rasoio, e pulire la parete anteriore dell'addome topo, a partire dal centro del ventre e di lavoro verso l'esterno in senso orario. In primo luogo l'uso povidone-iodio soluzione quindi lavare con etanolo al 70%. Ripetere 3 volte, ogni volta cambiando tamponi. Trasferire l'animale a una piastra elettrica per mantenere l'animale caldo all'interno di una coltura di tessuto o cappuccio dissezione.
8. Effettuare una incisione 1 centimetro longitudinale attraverso la cute e peritoneo sterili con forbici chirurgiche appena sotto il livello dell'articolazione dell'anca.
9. Tenendo il peritoneo con le pinze, raggiungere verso il fianco destro con un altro forcept sterile ed estrarre il tessuto grasso bianco con testicoli collegati.
10. Posizionare i testicoli su garza sterile.
11. Riempire un (1 cc) tubercolina o wi siringa Hamiltoni th hPSCs da iniettare. Si noti che è una buona idea di includere una linea di controllo hPSC che si sa è pluripotenti come WA09 (noto anche come H9). In questo modo si dispone di un controllo positivo che è possibile utilizzare per determinare se l'iniezione o l'intervento chirurgico era difettosa.
12. Iniettare lentamente il hPSCs (20-30 ml) nel centro della capsula testicolo lontano da vasi sanguigni più grandi, fermandosi se la capsula testicolare inizia a gonfiarsi.
13. Rimuovere l'ago lentamente per evitare il riflusso delle cellule.
14. Utilizzando pinze, trasferire i testicoli e schiena tessuto adiposo nella sua posizione originale nell'addome.
15. Primo piano il peritoneo con 2 o 3 punti di sutura riassorbibili e chiudere la pelle con autoclips.
16. Il mouse deve essere tenuto caldo fino a quando non recupera e dato qualche forma di analgesico (vedi ciò che è accettato nel Vivarium) dopo l'intervento chirurgico due volte al giorno per 1-2 giorni.
    Si noti che né l'anestesia né l'analgesico con interferire con lo sviluppo del tumore.
17. Monitorare °animale e per la crescita del tumore per 6-12 settimane. Molto raramente, tumori possono crescere a 5 mm di dimensioni precedenti a 6 settimane dopo l'iniezione, quindi è importante monitorare gli animali. In questo caso, gli animali devono essere sacrificati ed i tumori trattati ed analizzati come al solito.
18. Una volta che il tumore è palpabile e raggiunge circa 5 millimetri di dimensioni, anestetizzare il mouse e il sacrificio secondo le procedure di animali accettati protocollo.
19. Rimuovere tumorale e di conseguenza il documento - fotografia formato, misura, pesare.
20. Tagliare in piccoli pezzi del tumore e fissare in una soluzione di paraformaldeide al 4%. Conservare in paraformaldeide al 4% fino campioni sono inviati ad un patologo di sezionamento, colorazione e analisi.

2. Rappresentativi Risultati:

Quando questo protocollo è effettuata come descritto e la linea cellulare è iniettato pluripotenti, uno palpabile, visivamente evidente, tumore dovrebbe formare entro 12 settimane al massimo. Per le linee stabilite hPSC come WA09, di solito si vedatumori entro 6 settimane. Per le linee IPSC non è raro vedere i tumori entro 8-10 settimane. È molto importante per iniettare topi con una linea che è noto per essere pluripotenti, come controllo positivo, per essere sicuri che la procedura è stata eseguita correttamente. I tumori di solito guardano molto eterogeneo e hanno molte cisti allegati (Figura 1). L'analisi dei campioni tumorali da un patologo deve mostrare tessuti differenziati da tutti i tre strati germinali (Figura 2).

Figura 1. Tipica teratoma hPSC derivato nella capsula testicolo.

Seguendo il protocollo descritto, un milione WA09 cellule sono state iniettate nella capsula testicolo di un topo immune compromesso. Sei settimane dopo, un teratoma è stata osservata. A) teratoma tirato dal mouse. B) Primo piano immagine del teratoma. Notare le strutture eterogeneità e cisti.

Figura 2. Ematossilina Eosina e le sezioni colorate dal teratoma mostrano tessuti provenienti da ogni strato germinale.
Dopo fissazione, il teratoma era sezionati e colorati con ematossilina ed eosina. Analisi da un patologo rivelato la presenza di cellule provenienti da ciascuno dei 3 strati germinali.

Discussione

Il metodo qui presentato fornisce un mezzo altamente affidabili, semplici per generare teratomi dal hPSCs nella capsula testicolo. Ci sono diversi parametri critici di questa tecnica. In particolare, è importante iniettare hPSC linee cellulari che sono noti per essere pluripotenti come controllo. Altri parametri importanti includono l'intervallo di tempo tra l'iniezione e l'osservazione del tumore. Per le linee cellulari come WA09, teratomi deve essere osservato in 6-8 settimane. Per le nuove linee di IPSC troviamo che spesso sono necessarie 10 settimane. Un altro problema è il numero di cellule iniettate. Abbiamo iniettare un milione di cellule, ma il test può essere fatto facilmente con meno cellule. Inoltre, il mezzo di iniezione è importante. Troviamo che si ottengono i migliori risultati quando le cellule vengono iniettate in una miscela 1:1 di Matrigel e DMEM/F-12, al contrario di PBS o DMEM/F-12.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo
Accutase	Invitrogen	A1110501
DMEM/F-12	Invitrogen	113300-032
Matrigel	BD Biosciences	354277