Trapianto di cellule staminali in un In vitro Simulato ischemia / riperfusione Modello

Riepilogo

Dimostriamo come impostare uno In vitro Ischemia / riperfusione modello e come valutare l'effetto della terapia con cellule staminali su postischemica cellule cardiache.

Abstract

Protocolli di trapianto di cellule staminali stanno trovando la loro strada nella pratica clinica ^1,2,3. Ottenere risultati migliori, rendendo i protocolli più robusto, e di trovare nuove fonti di cellule impiantabili sono al centro di recenti ricerche ^4,5. Indagare l'efficacia delle terapie cellulari non è un compito facile e nuovi strumenti sono necessari per indagare i meccanismi coinvolti nel processo di trattamento ^6. Abbiamo progettato un protocollo sperimentale di ischemia / riperfusione in modo da consentire l'osservazione di connessioni cellulari e dei meccanismi subcellulari anche durante l'ischemia / riperfusione e dopo il trapianto di cellule staminali e per valutare l'efficacia della terapia cellulare. H9c2 cellule cardiomyoblast sono stati collocati su piastre di coltura cellulare ^7,8. Ischemia è stato simulato con 150 minuti in media glucosio libero con il livello di ossigeno inferiore allo 0,5%. Poi, i media normale e livelli di ossigeno sono state reintrodotte per simulare riperfusione. Dopo la deprivazione di ossigeno glucosio,le cellule danneggiate sono state trattate con il trapianto di midollo osseo umano etichettato cellule staminali mesenchimali aggiungendoli alla cultura. Cellule staminali mesenchimali sono preferiti negli studi clinici, perché sono facilmente accessibili con chirurgia mini-invasiva, facilmente espandibile e autologhe. Dopo 24 ore di co-coltura, le cellule sono state colorate con calceina e etidio-omodimero di distinguere tra cellule vive e morte. Questa configurazione ci ha permesso di indagare le connessioni intercellulari utilizzando la microscopia confocale a fluorescenza e di quantificare il tasso di sopravvivenza delle cellule postischemica mediante citometria di flusso. Microscopia confocale hanno mostrato le interazioni delle due popolazioni cellulari, come la fusione cellulare e la formazione di nanotubi intercellulari. Analisi di citometria a flusso ha rivelato 3 gruppi di cellule danneggiate, che può essere tracciata su un grafico e analizzati statisticamente. Queste popolazioni possono essere indagati separatamente e si possono trarre conclusioni su questi dati sull'efficacia del simulatoapproccio terapeutico.

Protocollo

1. Preparazione H9c2 cellule cardiomyoblast

H9c2 cardiomyoblasts ratto sono stati ottenuti da ATCC (Wesel, Germania) e ampliato nel glucosio (4,5 g / L) DMEM contenente 10% di siero fetale bovino, 4 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina. La linea cellulare H9c2 mioblasti è derivato da cuore di ratto embrionale, è usato come un modello in vitro sia per muscolo scheletrico e cardiaco ^8,9.

Preparare 12 pozzetti di H9c2 celle:

1. Togliere terreno di coltura da piastra di Petri di H9c2 cellule.
2. Lavare le cellule due volte con 5 ml di PBS e digerire con 2-3 ml 0,05% tripsina / EDTA.
3. Mettere le capsule di Petri per 5 minuti nel 37 ° C incubatore.
4. Inibire la tripsina con 10 ml di mezzo di coltura DMEM.
5. Spin down delle celle a 1200 rpm per 8 minuti.
6. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere le cellule in 1 ml di mezzo di coltura DMEM e contare le cellule con emocitometro utilizzando tripan colorazione blu.
7. Semi di 30.000 H9c2 cellule in 2 ml di DMEM per bene in un piatto ben 12.
8. Collocare la piastra nel 37 ° C CO ₂ incubatore per 24 ore.

2. Ischemia simulata / riperfusione

Ischemia / riperfusione è stato simulato in vitro effettuando glucosio privazione di ossigeno (OGD) H9c2 su colture cellulari. Questa procedura è stata eseguita sul palco del microscopio confocale Zeiss con il sistema di incubazione delle cellule Pecon (Erbach, Germania) che consente l'osservazione delle cellule durante OGD.

1. Rimuovere medio di aspirazione da 12 pozzetti di H9c2 cellule.
2. Lavare le cellule due volte con PBS.
3. Aggiungi 3 medio glucosio libero ml per pozzetto.
4. Posizionare la piastra nel sistema di incubazione delle cellule.
5. Avvio di gas azoto per eliminare l'ossigeno dal sistema di incubazione.
6. Attendere che il livello di ossigeno raggiunge il 0,5% poi avviare il timer. 0,5% di ossigeno significa circa 3 mmHg tensione parziale. Cellule soggette a 150 minuti di ischemia simulata.
7. Alla fine di ischemia simulata, rimuovere il supporto di glucosio libero dalle cellule.
8. Pipettare 2 ml di terreno di coltura normale ai pozzetti.
9. Posizionare i 12 pozzetti per 30 minuti nel 37 ° C CO ₂ incubatore, questo è il "periodo di riperfusione".

3. Preparazione salvataggio cellule staminali mesenchimali

Midollo osseo di origine umana è stata presa in T75 palloni e diluito con Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) terreno di coltura contenente il 10% di siero fetale bovino (FCS), 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina, 4 mM L-glutamina e 1 g / l di glucosio. I palloni sono state incubate a 37 ° C in un ambiente completamente umidificata al 5% di CO ₂ per 3 giorni. Dopo il periodo di incubazione della BMSCs aderito alla superficie dei palloni e gli altri componenti del midollo osseo sono stati eliminati mediante lavaggio con PBS. Il BMSCs utilizzati sono stati tra 1 e 5 passaggi negli esperimenti. Identitità di cellule è stata confermata dalla presenza di marcatori cellulari lineage-specifica superficie con citometria a flusso. Ematopoietiche linage specifici marcatori di superficie (CD34, CD45) e marcatori di superficie mesenchimali (CD73, CD90, CD105 e CD166) sono stati studiati.

Durante l'ischemia simulata, preparare salvataggio cellule staminali mesenchimali per il trapianto.

1. Diluire il colorante fluorescente Vybrant DiD in rapporto 1:200 nel terreno di coltura DMEM.
2. Aspirare il terreno dalle cellule di soccorso e aggiungere 300 ml con DMEM Vybrant DiD.
3. Mettere le capsule di Petri per 30 minuti nel 37 ° C CO ₂ incubatore.
4. Togliere terreno di coltura da piastra di Petri di cellule staminali mesenchimali.
5. Lavare le cellule due volte con 5 ml di PBS e digerire con 2-3 ml 0,05% tripsina / EDTA.
6. Mettere le capsule di Petri per 5 minuti nel 37 ° C incubatore.
7. Inibire la tripsina con 10 ml di mezzo di coltura DMEM.
8. Spin down delle celle a 1200 rpm per 8 minuti.
9. Dopo aver rimosso il Supernatant, risospendere le cellule in 1 ml di mezzo di coltura DMEM e contare le cellule con emocitometro utilizzando tripan colorazione blu.
10. Dopo 30 minuti alla fine della riperfusione aggiungere 20.000 cellule staminali mesenchimali per bene al postischemica H9c2 mioblasti cardiaci.
11. Luogo di co-coltura di cellule in 37 ° C CO ₂ incubatore per 24 ore.

4. Analisi con microscopia confocale

Dopo la simulazione di ischemia / riperfusione, le cellule vengono incubate in terreno di coltura normale per 24 ore.

1. Dopo 24 ore lavare le cellule due volte con PBS.
2. Macchiare le cellule in 500 microlitri dal vivo / morto soluzione colorante per 30 minuti (5 calceina nM e 400 nM di etidio-omodimero-2 in PBS) (5x10 ⁴ cellule / ml).

La valutazione delle immagini confocale per le cellule vive e morte selezionati dalla morfologia e dalla fluorescenza può essere effettuata con il software ImageJ (National Institutes of Health, USA). In caso di co-culture, MSC può essere distinto dal H9c2 cellule a causa della loro etichettatura delle cellule Vybrant DiD. Il rapporto tra le cellule morte possono essere valutati in 4 campi indipendenti di vista (obiettivo 10x) per ogni cultura in maniera cieca ^10.

H9c2 cardiomyoblasts coltivati ​​su coprioggetto mm 42 di vetro possono anche essere studiate con microscopia video di lasso di tempo durante e dopo ischemia / riperfusione mediante il sistema di incubazione delle cellule del microscopio confocale. Cellula-cellula interazioni, come la fusione cellulare e la formazione di nanotubi intercellulare possono essere studiati nel corso del tempo.

5. Analisi con citometria a flusso

Dopo la simulazione di ischemia / riperfusione, le cellule vengono incubate in terreno di coltura normale per 24 ore.

1. Dopo 24 ore, raccogliere i terreni di coltura. E 'molto importante raccogliere il terreno di coltura anche perché alcune cellule morte potrebbe essere staccato dalla superficie del piatto cultura durante l'incubazione 24 orezione.
2. Lavare le cellule due volte con PBS e digerire con il 0,05% tripsina-EDTA.
3. Inibire la tripsina con terreno di coltura DMEM.
4. Spin basso le celle e il terreno di coltura raccolto a 1200 giri (circa 150-200g) per 8 minuti.
5. Scartare il surnatante.
6. Sospendere le cellule in 500 microlitri dal vivo / morto soluzione colorante per 30 minuti (5 calceina nM e 400 nM di etidio-omodimero-2 in PBS) (5x10 ⁴ cellule / ml).
7. Trasferimento alle cellule di tubi di citometria a flusso.
8. Avviare il software Pro CellQuest.
9. Per impostare il citometro a flusso per la misura, preparare del campioni di cellule vive e morte.
   1. Piastra H9c2 cellule ad una densità di 3x10 ⁴ in 12-pozzetti, come descritto al punto 1.
   2. Preparare vivere controlli cella con trypsinisation singolo come descritto al punto 1.
   3. Preparare i controlli cellule morte da un trattamento con 10 mM H ₂ O ₂ per 1 ora.
   4. Dopo trypsinisation, resuspend vivere e controlli cellule morte in 500 microlitri dal vivo / morto soluzione colorante (5 nM calceina-AM e 400 Nm di etidio-omodimero-2 in PBS).
10. Le impostazioni dello strumento dovrebbe essere regolata in modo le cellule viventi sono calceina positive e etidio omodimero negativo, mentre le cellule morte sono calceina negativi e positivi omodimero etidio.
11. La percentuale di queste popolazioni può essere espresso come barre su un grafico e analisi statistiche possono essere eseguite su questi valori.
12. Misurare i diversi gruppi sperimentali.

6. Rappresentante dei risultati:

I nostri risultati hanno dimostrato che le cellule staminali mesenchimali aggiunto potrebbe migliorare la sopravvivenza di postischemica cellule cardiache. Immagini di microscopia confocale hanno rivelato diretto cellula-cellula interazioni, come la connessione a membrana parziale o nanotubi intercellulare, che probabilmente giocano un ruolo importante nella protezione osservati ^10. I nanotubi arco su distanze di cellule diverse diameters, e il loro diametro era tra i 200 ei 500 nm (frecce bianche).

Figura 1. Formazione di nanotubi tra le cellule. Nanotubi di formazione (freccia bianca) è stata osservata tra Vybrant cardiomyoblasts DIO etichettati e Vybrant DiD cellule staminali mesenchimali etichettati.

Analisi di citometria a flusso ha mostrato le popolazioni di sopravvivere e cardiomyoblasts necrotiche e cellule staminali mesenchimali. È interessante notare che abbiamo anche osservato un terzo, 'ferito' cardiomyoblast popolazione cellulare che conteneva calceina ma conteneva anche l'indicatore delle cellule morte, etidio omodimero (Figura 2).

Figura 2. Rappresentante dot-plot della diverse popolazioni cellulari dopo l'ischemia simulata.

La valutazione di diversi esperimenti shomer che l'aggiunta di cellule staminali mesenchimali per postischemica cardiomyoblast H9c2 aumentato in modo significativo la percentuale di cellule viventi rispetto ai mioblasti cardiaci colta da sola dopo ischemia (Figura 3).

Figura 3. . Effetto del trattamento con cellule staminali su cardiomyoblasts postischemica Percentuale di cellule viventi era significativamente ridotta dopo ischemia simulata rispetto al controllo (controllo rispetto al modello IR: 90,36 ± 2,60 vs 10,52 ± 0,48, *** p> 0,001), che è aumentato dopo l'aggiunta di cellule staminali mesenchimali (IR modello vs IR + BMSC: 10,52 ± 0,48 vs 25,21 ± 2,13, *** p> 0,001). I dati rappresentano media ± SEM. L'analisi statistica dei dati è stata effettuata utilizzando una analisi della varianza con il post di comparazione multipla di Tukey hoc test.

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Discussione

Il protocollo è dimostrato un approccio in vitro alla questione molto più complessa di terapia con cellule staminali in infarto miocardico, con tutti i vantaggi e gli svantaggi di un tale modello. Ovviamente non può riflettere il complesso (ad esempio, immunologici) eventi che si svolgeranno durante e dopo l'infarto del miocardio, ma può concentrarsi sugli effetti diretti delle cellule aggiunto sulle cellule postischemica. Gli effetti di ischemia simulata su H9c2 cardiomyoblasts molto dipende dal tempo di OGD, s...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
calceina-AM	Molecular Probes	L3224, C3099	http://www.invitrogen.com
etidio omodimero-2	Molecular Probes	L3224, E3599	http://www.invitrogen.com
Vybrant DiD	Molecular Probes	V22887	http://www.invitrogen.com

Nome del materiale	Azienda	Commenti (opzionale)
Pecon sistema a celle di incubazione per microscopi Zeiss	Pecon GmbH	www.pecon.biz/