에서 간세포 이식 체외에서 시뮬레이션 국소 빈혈 / Reperfusion 모델

요약

우리는을 설정하는 방법을 보여줍니다 체외에서 국소 빈혈 / reperfusion 모델과 방법을 postischemic 심장 세포에서 줄기 세포 치료의 효과를 평가할 수 있습니다.

초록

줄기 세포 이식 프로토콜은 임상 연습 ^1,2,3에 그들의 방법을 찾는 수 있습니다. 더 나은 결과를 얻기 프로토콜보다 강력한 만들기, implantable 세포에 대한 새로운 소스를 찾는 것이 ^4,5 최근 연구의 초점입니다. 세포 요법의 효과를 조사하는 것은 쉬운 일이 아니므로 새로운 도구는 치료 과정 ⁶ 관련된 메커니즘을 조사하기 위해 필요합니다. 우리는 국소 빈혈 / reperfusion 상해시와 줄기 세포 이식 후 휴대폰 연결 심지어 subcellular 구조의 관찰을 허용하고 세포 요법의 효능을 평가하기 위해 국소 빈혈 / reperfusion의 실험 프로토콜을 설계했습니다. H9c2 cardiomyoblast 세포는 세포 배양 접시 ^7,8에 배치했다. 국소 빈혈은 0.5 % 이하의 산소 수준 포도당 무료 매체 150 분 모의했다. 그렇다면 정상적인 미디어와 산소 수준은 reperfusion을 시뮬레이트하기 위해 reintroduced되었습니다. 산소 포도당 박탈 후,손상된 세포는 문화에 그들을 추가하여 mesenchymal 줄기 세포를 파생 표시된 인간 골수의 이식과 함께 치료를했다. 그들이 최소한의 침략 수술 쉽게 쉽게 확장하고 autologous되기 때문에 Mesenchymal 줄기 세포는 임상 실험에서 원하는 있습니다. 공동 배양 24 시간 후 세포가 살고 죽은 세포를 구분하는 calcein하고 ethidium - homodimer로 얼룩진했다. 이 설정은 우리가 공촛점 형광 현미경을 사용하여 세포 연결을 조사하고 유동세포계측법에 의해 postischemic 세포의 생존 비율을 정할 수있었습니다. 공촛점 현미경은 세포 융합과 세포 나노튜브의 형성과 같은 두 가지 세포 집단의 상호 작용을 보여주었다. 유동세포계측법 분석 그래프를 꾸몄다 그리고 통계적으로 분석할 수 손상된 세포의 3 클러스터를 공개했다. 이러한 집단은 별도로 조사하고 결론은 시뮬레이션의 효과에 이러한 데이터를 발행한 수치료 접근.

프로토콜

1. H9c2 cardiomyoblast 전지를 준비

H9c2 쥐 cardiomyoblasts는 ATCC (Wesel, 독일)에서 얻은 높은 포도당 (4.5 g / L) DMEM 10 % 태아 소 혈청, 4 MM의 L - 글루타민, 100 U / ML 페니실린과 100 μg / ML 스트렙토 마이신을 포함하는으로 확장되었습니다. H9c2 myoblast 전지 라인이 배아 쥐의 심장에서 파생된 것입니다, 그것은 골격과 심장 근육 ^8,9 모두 체외 모델로 사용됩니다.

H9c2 세포의 12 잘 접시를 준비 :

1. H9c2 세포의 배양 접시에서 문화 매체를 제거합니다.
2. 2-3 ML 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5 ML PBS 소화와 두 번 세포를 씻으십시오.
3. 37 ° C 배양기에서 5 분 페트리 접시 놓습니다.
4. 10 ML DMEM 문화 매체와 트립신을 억제.
5. 팔분을 위해 1200 RPM에서 세포를 다운 스핀.
6. Trypan 블루 염색법을 사용하여 hemocytometer 1 ML DMEM 배양 매체와 카운트 세포의 표면에 뜨는, resuspend 세포를 제거 후.
7. 이 ML DMEM에 따라 잘 12 잘 접시에 씨앗 30,000 H9c2 세포.
8. 24 시간 동안 37 ° C CO ₂ 배양기에 플레이트를 놓습니다.

2. 모의 국소 빈혈 / reperfusion

국소 빈혈 / reperfusion는 H9c2 세포 배양에서 산소 포도당 박탈 (OGD)를 수행하여 체외에서 모의​​했다. 이 절차는 OGD 동안 세포의 관찰을 허용 PeCon 세포 배양 시스템 (Erbach, 독일)와 자이스 혈구 공촛점 현미경의 무대에서 수행되었다.

1. H9c2 세포의 12 잘 접시에서 열망으로 매체를 제거합니다.
2. PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
3. 물론 당 3 ML 포도당 무료 매체를 추가합니다.
4. 세포 배양 시스템에 접시를 놓습니다.
5. 배양 시스템의 밖으로 산소를 정화하기 위해 질소 가스를 시작합니다.
6. 다음 타이머를 시작 산소 수준이 0.5 %에 도달할 때까지 기다리십시오. 0.5 %의 산소가 약 3 mmHg 부분 긴장을 의미합니다. 1 제목 셀모의 국소 빈혈의 50 분.
7. 모의 국소 빈혈의 끝에 세포에서 포도당 무료 매체를 제거합니다.
8. 우물에 피펫이 ML 일반 문화 매체.
9. 37 ° C CO ₂ 배양기에서 30 분 12 잘 접시를 놓고, 이것은 "reperfusion 기간"입니다.

3. 준비 구조 mesenchymal 줄기 세포

인간의 근본 골수는 T75 flasks 고려하고 Dulbecco의 변형 이글 배지 (DMEM) 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS), 100 U / ML 페니실린과 100 μg / ML 스트렙토 마이신을 포함하는 문화 매체, 4 MM의 L - 글루타민과 함께 희석되었다 1g / L 포도당. flasks 3 일 동안 5 % CO _2의 완전 humidified 분위기에서 37 ° C에서 incubated했다. 잠복기 후 flasks 및 골수의 나머지 구성 요소의 표면에 붙어 BMSCs은 PBS로 세척하여 제거되었습니다. 사용 BMSCs은 실험 1 5 구절 사이에 있었다. iden세포의 tity는 유동세포계측법와 혈통 특정 세포 표면 마커의 존재에 의해 확인되었다. 조혈 행수 특정 표면 마커 (CD34, CD45)와 mesenchymal 표면 마커 (CD73, CD90, CD105과 CD166)을 조사했다.

모의 국소 빈혈 동안 이식을위한 mesenchymal 줄기 세포를 구출 준비합니다.

1. Vybrant는 DMEM 문화 매체 1:200 비율에서 한 형광 염료를 희석.
2. 구조 세포에서 매체를 기음과 Vybrant했던 300 μl DMEM를 추가합니다.
3. 37 ° C CO ₂ 배양기에서 30 분 장소 페트리 접시.
4. mesenchymal 줄기 세포의 배양 접시에서 문화 매체를 제거합니다.
5. 2-3 ML 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5 ML PBS 소화와 두 번 세포를 씻으십시오.
6. 37 ° C 배양기에서 5 분 페트리 접시 놓습니다.
7. 10 ML DMEM 문화 매체와 트립신을 억제.
8. 팔분을 위해 1200 RPM에서 세포를 다운 스핀.
9. supe을 제거한 후한 ML DMEM 배양 매체와 Trypan 블루 염색법을 사용하여 hemocytometer로 카운트 세포에 rnatant, resuspend 세포.
10. reperfusion의 끝에 30 분 postischemic H9c2 심장 myoblasts마다 잘 20,000 mesenchymal 줄기 세포를 추가한 후.
11. 24 시간 동안 37 ° C CO ₂ 배양기에 장소 세포의 공동 문화.

4. 공촛점 현미경과 분석

모의 국소 빈혈 / reperfusion 상해 후, 전지가 24 시간 동안 일반 문화 매체 incubated 수 있습니다.

1. 24 시간 PBS로 두 번 세포를 씻어 후.
2. 30 분 (5 NM calcein 400 nm의 PBS에서 Ethidium - homodimer - 2) 500 μl 죽은 / 라이브 염료 용액 (5x10 ⁴ 셀 / ML)에 세포를 얼룩.

형태학 및 형광 선정 살고 죽은 세포에 대한 공촛점 이미지의 평가는 ImageJ 소프트웨어 (보건 국립 연구소, 미국)과 함께 수행할 수 있습니다. C의 경우O - 문화, MSCS들은 Vybrant나요 셀 라벨로 인해 H9c2 세포에서 구분할 수 있습니다. 죽은 세포의 비율은 맹인 패션 ^10의 각 문화보기 4 독립적인 필드 (10X 목적)에서 평가할 수 있습니다.

42mm 유리 coverslips에 교양 H9c2 cardiomyoblasts도 공촛점 현미경으로 세포 배양 시스템을 사용하여 국소 빈혈 / reperfusion 상해시 후 시간 저속 비디오 현미경과 함께 조사하실 수 있습니다. 이러한 세포 융합과 세포 나노튜브의 형성과 같은 휴대 전화의 상호 작용은 시간이 지남에 따라 공부하실 수 있습니다.

5. 유동세포계측법와 분석

모의 국소 빈혈 / reperfusion 상해 후, 전지가 24 시간 동안 일반 문화 매체 incubated 수 있습니다.

1. 24 시간 후에, 문화 미디어를 수확. 어떤 죽은 세포는 24 시간 incuba 동안 문화 접시 표면에서 분리 할 수​​ 있기 때문에 그것은 또한 문화 매체를 수집하는 것이 매우 중요합니다기.
2. 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 PBS 소화와 두 번 세포를 씻으십시오.
3. DMEM 문화 매체와 트립신을 억제.
4. 팔분위한 1,200 RPM (약 150-200그램)에서 세포와 수확 문화 매체를 돌린다.
5. 뜨는 폐기하십시오.
6. 30 분 (5 NM calcein 400 nm의 PBS에서 Ethidium - homodimer - 2) 500 μL 죽은 / 라이브 염료 용액 (5x10 ⁴ 셀 / ML)에 세포를 일시 중지합니다.
7. cytometry 튜브를 흐름 세포를 전송합니다.
8. CellQuest Pro 소프트웨어를 시작합니다.
9. 측정 흐름 cytometer를 설정하려면, 살고 죽은 세포의 샘플을 제어할 준비합니다.
   1. 12 잘 접시에 3x10 ⁴ 밀도에 플레이트 H9c2 세포는 지점 1에 설명되어 있습니다.
   2. 포인트 1 설명된대로 단일 trypsinisation로 셀 컨트롤을 살 준비합니다.
   3. 1 시간 10 μm의 H ₂ O _2와 치료에 의해 ​​죽은 세포 컨트롤을 준비합니다.
   4. trypsinisation 후, resuspen500 μl 죽은 / 라이브 염료 용액 (5 NM calcein - AM 400 nm의 PBS에서 Ethidium - homodimer - 2)에서 D 살고 죽은 세포 제어합니다.
10. 죽은 세포가 homodimer 긍정적인 calcein 부정하고 ethidium하는 동안 살아있는 세포가 calcein 긍정적이고 부정적인 homodimer ethidium되도록 악기 설정을 조정해야합니다.
11. 그래프 및 통계 분석 바, 이러한 가치에 수행할 수 있습니다 이러한 인구의 비율은 표현할 수있다.
12. 다른 실험 그룹을 측정합니다.

6. 대표 결과 :

우리의 결과는 추가 mesenchymal 줄기 세포가 심장 세포 postischemic의 생존을 향상시킬 수 있다고했다. 공촛점 현미경 이미지 아마도 관찰된 보호 ¹⁰ 중요한 역할을 이러한 부분 멤브레인 연결 또는 세포 나노튜브로 직접 휴대 전화의 상호 작용을, 발표했다. 이러한 나노튜브는 여러 셀 D의 거리 스팬iameters, 그들의 직경은 200, 500 nm의 (흰색 화살표) 사이에 있었다.

그림 1. 세포 사이의 나노튜브 형성. 나노튜브 형성 (흰색 화살표)가 Vybrant DIO 표시 cardiomyoblasts 및 Vybrant나요 표시 mesenchymal 줄기 세포 사이에 관찰되었다.

유동세포계측법 분석은 생존의 인구 및 괴사성 cardiomyoblasts 및 mesenchymal 줄기 세포를 보여주었다. 흥미롭게도, 우리는 또한 calcein를 포함 세번째 '부상'cardiomyoblast 세포 인구를 관찰뿐만 아니라 죽은 세포, ethidium homodimer (그림 2)의 지표를 포함.

그림 2. 모의 국소 빈혈 후 다른 세포 집단의 대표 도트 플롯.

몇 가지 실험 슈의 평가postischemic H9c2의 cardiomyoblast에 mesenchymal 줄기 세포뿐만 아니라이 국소 빈혈 후 혼자 교양 심장 myoblasts (그림 3)에 비해 크게 살아있는 세포의 비율이 증가되는 결혼.

그림 3. ., 또한 이후 증가 : 살아있는 세포의 postischemic cardiomyoblasts에 대한 줄기 세포 치료의 효과 비율이 크게 (90.36 ± 2.60 대 10.52 ± 0.48, ** P> 0.001 제어 대 IR 모델) 컨트롤에 비해 모의 국소 빈혈 이후 감소되었다 mesenchymal 줄기 세포 (IR 모델 대 IR + BMSC : 10.52 ± 0.48 대 25.21 ± 2.13, ** P> 0.001). 데이터 말은 ± SEM을 나타냅니다. 데이터의 통계 분석은 Tukey의 다중 비교 게시물을 임시 시험 분산의 한 방법으로 분석을 사용하여 실시되었다.

토론

시연 프로토콜은 같은 모델의 모든 장점과 단점과 심근 경색에 줄기 세포 치료의 훨씬 더 복잡한 문제 체외 접근 방식에있다. 분명히 그것은 심근 경색 동안 후 일어나는 복잡한 (예 : 면역) 이벤트를 반영하지 수 있지만 postischemic 세포에 대한 추가 세포의 직접적인 효과에 초점을 맞출 수 있습니다. H9c2 cardiomyoblasts에 대한 시뮬레이션 국소 빈혈의 효과는 매우 사용되는 세포의 통과 번호와 O _2<...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
calcein - AM	분자 프로브	L3224, C3099	http://www.invitrogen.com
ethidium homodimer - 2	분자 프로브	L3224, E3599	http://www.invitrogen.com
Vybrant가나요	분자 프로브	V22887	http://www.invitrogen.com

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자이스 혈구 현미경에 대한 PeCon 세포 배양 시스템	PeCon GmbH의	www.pecon.biz/