Topo Modello ortotopico di cancro colorettale

Riepilogo

Due tecniche possono essere usate per stabilire questo modello: l'iniezione di una sospensione di cellule tumorali nella parete del cieco o il trapianto di un pezzo di tumore sottocutaneo sul cieco. Questo modello è utile per studiare la naturale progressione del tumore del colon-retto e test nuovi agenti terapeutici contro il cancro del colon-retto.

Abstract

Il tradizionale modello di tumore sottocutaneo è proprio l'ideale per lo studio del cancro del colon-retto. Ortotopico modelli murini di cancro del colon-retto, che presentano le cellule tumorali in crescita nella loro posizione naturale, replicare malattia umana con l'alta fedeltà. Due tecniche possono essere usate per stabilire questo modello. Entrambe le tecniche sono simili e richiedono l'anestesia del mouse e laparotomia per l'esposizione del cieco. Una tecnica prevede l'iniezione di una sospensione di cellule di cancro del colon-retto nella parete del cieco. Le cellule cancerose vengono prima crescere in coltura, raccolto quando subconfluent e pronta come una sospensione di cellule singole. Una piccola quantità di cellule viene iniettato lentamente per evitare perdite. L'altra tecnica prevede il trapianto di un pezzo di tumore sottocutaneo sul cieco. Un mouse con un precostituito tumore del colon-retto per via sottocutanea è eutanasia e il tumore è stato rimosso con tecnica sterile. Il pezzo tumore è diviso in piccoli pezzi per il trapianto di un altro mouse. Prima del trapianto, la parete del cieco è leggermente danneggiato per facilitare l'infiltrazione delle cellule tumorali. Il tempo per lo sviluppo di tumori primari e delle metastasi epatiche varia a seconda della tecnica, linea cellulare, e le specie utilizzate il mouse. Questo modello murino ortotopico è utile per studiare la naturale progressione del tumore del colon-retto e test nuovi agenti terapeutici contro il cancro del colon-retto.

Protocollo

I. Preparazione cellulare

1. Le cellule tumorali del colon-retto sono cresciuti in coltura e raccolta quando subconfluent.
2. Una sospensione singola cella viene preparato in tampone fosfato e tenuta in ghiaccio.

II. Preparazione del tumore

1. Un mouse con un precostituito tumore del colon-retto per via sottocutanea è eutanasia.
2. Il tumore sottocutaneo viene rimosso utilizzando una tecnica sterile e diviso in 2-3 pezzi millimetri
3. I pezzi del tumore sono tenuti in tampone fosfato salino sul ghiaccio.

III. Preparazione del mouse

Nota: Nel nostro laboratorio usiamo per via inalatoria isoflurano per anestetizzare il mouse, in alternativa, si può usare anestetici iniettabili per ottenere lo stesso effetto

1. La profondità di anestesia viene valutata usando un pizzico piedi. Non ci dovrebbero essere ritirarsi reflex con un pizzico punta.
2. Gli antibiotici può essere somministrato a questo punto.
3. Il mouse anestetizzato, che in precedenza era rasata, sia posizionata correttamente.
4. L'addome viene preparato con una soluzione di Betadine.
5. Dell'addome e del sito chirurgico sono drappeggiati in modo sterile.

IV. Laparotomia

1. Un piccolo nick è realizzata in pelle
2. La muscolatura della parete addominale è colto ed elevato
3. La cavità addominale è entrato e una singola lama delle forbici è usato per spingere l'intra-addominale contenuti via
4. L'incisione è estesa a 2-3 cm

L'esposizione V. del cieco

1. Il cieco con il suo sacchetto finale cieco è identificato e esteriorizzato
2. Il cieco è isolato dal resto del mouse utilizzando un pre-taglio, garza sterile
3. Salina calda viene utilizzata per mantenere umido il cieco

VI. L'iniezione di cellule nella parete del cieco

1. A 27 G o un ago sottile viene usato per iniettare un volume di 50 ml di cellule nella parete del cieco
2. L'ago viene rimosso
3. Il sito di iniezione è controllato per garantire l'assenza di perdite
4. Il cieco è tornato alla cavità addominale

VII. Il trapianto di Tumore sulla Cieco

Nota: oltre a iniettare le cellule nel muro del cieco, un approccio alternativo consiste nel trapianto di tumore sul cieco

1. Una figura di 8 punti è posizionato sul cieco utilizzando 6-0 o 7-0 sutura dimensioni
2. La parete del cieco è leggermente danneggiato
3. Poi, il pezzo tumorale è posizionata
4. Il punto è legato
5. Il cieco è tornato alla cavità addominale

VIII. Chiusura del mouse parete addominale e di recupero

1. La parete addominale del mouse è chiuso con tre punti di sutura interrotta utilizzando 3-0 o 4-0 sutura dimensioni
2. In alternativa, si può usare un punto semplice esecuzione
3. Post-operatorio analgesici e un bolo fluido può essere data a questo punto
4. Il mouse è permesso di recuperare l'anestesia.

Nota: con anestetici inalatori questo richiede in genere 30 secondi

IX. Risultati - tumore primitivo e metastasi epatiche

Tumore primario - mostrato in situ (A) e con evidenza di neovascolarizzazione (B); alla colorazione H & E, i tumori localmente invasivi (C)

Metastasi al fegato - mostrato ex vivo (D)

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Discussione

Anche se il mouse modelli di tumore sottocutaneo sono facili da stabilire e controllare, è chiaro che questo modello non può replicare il sito originale anatomica del tumore colorettale. A causa della differenza di microambiente, le cellule del cancro colorettale in crescita sotto la pelle hanno dimostrato di cambiare il loro fenotipo e quasi sempre non riescono a progredire e metastasi ^1,2. In realtà, la risposta del tumore alla terapia può variare notevolmente a seconda che le cellule tumorali sono impiantate in un ectopica...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture media and components			will vary depending on cell line used
Phosphate Buffered Saline	BioWhittaker	17-512F	also sold by a number of other vendors
15 mL centrifuge tubes, polypropylene	Corning	430790
6 well plates with lid	BD Biosciences	353046
Iris forceps, straight, serrated tips	World Precision Instruments, Inc.	15914	best to have a pair of these instruments
Iris dissecting scissors, straight, sharp	World Precision Instruments, Inc.	14393
Needle Holder (regular)	World Precision Instruments, Inc.	14109
Needle Holder (Castroviejo)	World Precision Instruments, Inc.	14137
Cidex Plus	World Precision Instruments, Inc.	7364	instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex
6-0 or 7-0 suture			for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF
3-0 or 4-0 suture			for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF
Anesthetic machine / Isoflurane	J.A. Baulch and Associates	3206	also sold by a number of other vendors
Heating Pad, disposable, 6" x 6"	Prism Technologies	20419
Tape, orange, 13 mm x 13 m	Fisher Scientific	15901F	for restraining anesthetized mouse
Pro-Cord/Cordless Trimmer	Oster Professional Products	78997-010	for shaving mouse fur
Betadine	Fisher Scientific	19-027132	may also be purchased at any medical supply store
2 x 2 gauze, 3-ply	Johnson & Johnson	7635	may also be purchased at any medical supply store
Sterile Field, Barrier, 16" x 29"	Johnson & Johnson	0905	may also be purchased at any medical supply store
Cotton tipped applicators, 6"	Fisher Scientific	14-960-3Q	may also be purchased at any medical supply store
Syringe, 10 cc, Luer lock tip	BD Biosciences	309604
Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip	BD Biosciences	309602
27 1/2 G needle	BD Biosciences	305109
30 G needle	BD Biosciences	305106